Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Фракционирование клеток U937 методом изопикновой очистки градиента плотности

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

ERRATUM NOTICE

Summary

Этот протокол фракционирования позволит исследователям выделить цитоплазматические, ядерные, митохондриальные и мембранные белки из клеток млекопитающих. Последние две субклеточные фракции дополнительно очищаются с помощью изопикнового градиента плотности.

Abstract

Этот протокол описывает способ получения субклеточных белковых фракций из клеток млекопитающих с использованием комбинации детергентов, механического лизиса и центрифугирования градиента изопикновой плотности. Основным преимуществом этой процедуры является то, что она не полагается на исключительное использование солюбилизирующих моющих средств для получения субклеточных фракций. Это дает возможность отделить плазматическую мембрану от других мембранно-связанных органелл клетки. Эта процедура облегчит определение локализации белка в клетках воспроизводимым, масштабируемым и селективным методом. Этот метод был успешно использован для выделения цитозольных, ядерных, митохондриальных и плазматических мембранных белков из клеточной линии моноцитов человека U937. Хотя эта процедура оптимизирована для этой клеточной линии, она может служить подходящей отправной точкой для субклеточного фракционирования других клеточных линий. Обсуждаются потенциальные подводные камни процедуры и способы их избежания, а также изменения, которые, возможно, потребуется рассмотреть для других клеточных линий.

Introduction

Субклеточное фракционирование представляет собой процедуру, при которой клетки лизируются и разделяются на составляющие их компоненты с помощью нескольких методов. Этот метод может быть использован исследователями для определения локализации белка в клетках млекопитающих или для обогащения белков с низким содержанием, которые в противном случае не были бы обнаружены. Хотя методы субклеточного фракционирования в настоящее время существуют, как и коммерческие наборы, которые можно приобрести, они страдают от нескольких ограничений, которые эта процедура пытается преодолеть. Большинство методов фракционирования клеток основаны исключительно на моющих средствах 1,2, основанных на использовании буферов, содержащих все большее количество моющего средства для солюбилизации различных клеточных компонентов. Хотя этот метод быстрый и удобный, он приводит к нечистым фракциям. Они предназначены для того, чтобы позволить исследователям легко выделить один или два компонента клетки, но недостаточно сложны, чтобы выделить несколько субклеточных фракций из образца одновременно. Опора исключительно на моющие средства обычно приводит к тому, что мембранно-закрытые органеллы и плазматическая мембрана без разбора солюбилизируются, что затрудняет разделение этих компонентов. Дополнительным осложнением от использования этих наборов является неспособность исследователей изменять / оптимизировать их для конкретных применений, поскольку большинство компонентов являются запатентованными составами. Наконец, эти наборы могут быть непомерно дорогими, с ограничениями в количестве применений, которые делают их менее идеальными для больших образцов.

Несмотря на наличие наборов для выделения митохондрий, которые не полагаются на моющие средства, они не предназначены для изоляции плазматической мембраны и дают значительно меньшее количество образца, чем стандартные протоколы изоляции 3,4. Хотя методы дифференциального центрифугирования являются более трудоемкими, они часто приводят к образованию различных фракций, которые не могут быть получены с помощью наборов1 исключительно на основе моющих средств. Сепарация без исключительного использования солюбилизирующих моющих средств также позволяет проводить дальнейшую очистку с использованием ультрацентрифугирования и изопикнических градиентов плотности, что приводит к меньшему перекрестному загрязнению. Этот протокол фракционирования демонстрирует выделение субклеточных фракций из моноцитов U937 с использованием комбинации подходов на основе детергентов и высокоскоростного центрифугирования. Этот метод облегчит выделение ядерного, цитоплазматического, митохондриального и плазматического мембранных компонентов клетки млекопитающих с минимальным загрязнением между фракциями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовьте буферы и реагенты

  1. Готовят свежие растворы фосфатазы и ингибиторов протеазы.
    1. Добавьте 17,4 мг фенилметансульфонилфторида (PMSF) к 1 мл 100% этанола для получения запаса 100 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носите защитное снаряжение при обращении с PMSF, так как это опасно при проглатывании или вдыхании и при контакте с кожей или глазами. Разъедает глаза и кожу.
    2. Согласно инструкции производителя, приготовьте коммерчески доступный коктейль ингибитора протеазы (100x).
    3. Добавьте 91,9 мг ортованадата натрия (SOV) в 1 мл деионизированной воды, чтобы подготовить запас 500 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носите защитное снаряжение при обращении с SOV, так как оно опасно при попадании в организм, вдыхании или при попадании в глаза. Сильное передержка может привести к смерти.
  2. Подготовьте буфер лизиса A, буфер цитоплазматической изоляции (CI), буфер солюбилизации клеток (CS), буфер ядерного лизиса (NL), буфер лизиса B, буфер гомогенизации клеток (CH), разбавитель йодиксанола и моющие средства.
    1. Добавьте 8,7 г хлорида натрия (NaCl) и 50 мл 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES, 1 M, рН 7,4) до 950 мл деионизированной воды для получения лизисного буфера А (конечные концентрации 150 мМ NaCl и 50 мМ HEPES).
    2. Готовят исходные растворы моющих средств следующим образом: добавляют 0,1 г додецилсульфата натрия (СДС) к 10 мл лизисного буфера А (конечная концентрация 1% СДС), добавляют 0,1 г дезоксихолата натрия к 10 мл лизисного буфера А (конечная концентрация 1%), добавляют 2,5 мг дигитонина к 10 мл лизисного буфера А (конечная концентрация 250 мкг/мл), и добавить 1 мл неионного, неденатурирующего моющего средства (см. Таблицу материалов) к 9 мл лизисного буфера А (конечная концентрация 10% (v/v)).
    3. Получают ci-буфер путем добавления 10 мкл запаса PMSF (100 мМ), 10 мкл ингибитора протеазы (100x), 2 мкл запаса SOV (500 мМ) и 100 мкл исходного дигитонина (250 мкг/мл) к 878 мкл лизизного буфера A (конечные концентрации 1 мМ PMSF, 1x ингибитора протеазы, 1 мМ SOV и 25 мкг/мл дигитонина). Держите раствор на льду до добавления в ячейку гранулы.
    4. Получение буфера CS путем добавления 10 мкл запаса PMSF (100 мМ), 10 мкл ингибитора протеазы (100x), 2 мкл запаса SOV (500 мМ), 100 мкл неионного, неденатурирующего моющего вещества (см. Таблицу материалов) (10%) и 118 мкл гексиленгликоля (8,44 М) до 760 мкл лизизного буфера А (конечные концентрации 1 мМ PMSF, 1x ингибитор протеазы, 1 мМ SOV, 1% неионное, неденатурирующее моющее средство и 1 М гексиленгликоля). Держите раствор на льду до добавления в ячейку гранулы.
    5. Получение буфера NL путем добавления 10 мкл запаса PMSF (100 мМ), 10 мкл ингибитора протеазы (100x), 2 мкл запаса SOV (500 мМ), 50 мкл дезоксихолата натрия (10%), 100 мкл запаса SDS (1%) и 118 мкл гексиленгликоля (8,44 М) до 710 мкл лизизного буфера A (конечные концентрации 1 мМ PMSF, 1x ингибитор протеазы, 1 мМ SOV, 0,5% дезоксихолат натрия (v/v), 0,1% SDS (мас./об.) и 1 М гексиленгликоля). Держите раствор на льду до добавления в ядерную гранулу.
    6. Добавьте 20 мл HEPES (1 M, рН 7,4), 0,74 г хлорида калия (KCl), 0,19 г хлорида магния (MgCl2), 2 мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (0,5 M EDTA), 2 мл этиленгликоля-биса (β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (0,5 M EGTA), 38,3 г маннитола и 23,9 г сахарозы до 980 мл деионизированной воды для получения лизисного буфера B (конечные концентрации 20 мМ HEPES, 10 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 210 мМ маннит и 70 мМ сахарозы).
    7. Подготовьте буфер CH путем добавления 10 мкл запаса PMSF (100 мМ) и 2 мкл запаса SOV (500 мМ) к 988 мкл лизисного буфера B (конечные концентрации 1 мМ PMSF и 1 мМ SOV; отрегулируйте конечный объем для размещения количества формируемых клеток). Держите раствор на льду до добавления в ячейку гранулы.
    8. Получают разбавитель йодиксанола путем добавления 12 мл HEPES (1 M, рН 7,4), 447 мг KCl, 114 г MgCl2, 1,2 мл 0,5 M ЭДТА, 1,2 мл 0,5 M EGTA, 21,3 г маннитола и 14,4 г сахарозы в 88 мл деионизированной воды (конечные концентрации 120 мМ HEPES, 60 мМ KCl, 12 мМ MgCl2, 6 мМ ЭДТА, 6 мМ ЭГТА, 1200 мМ маннит и 420 мМ сахарозы).
    9. Храните буферы при температуре 4 °C и дигитонин при -20 °C.

2. Выделение цитозольного белка

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги позволят обеспечить рост и расширение клеток U937 с последующей экстракцией цитозольных белков. При используемой концентрации дигитонин будет проникать в плазматическую мембрану, не нарушая ее, что позволяет высвобождать цитозольные белки и удерживать другие клеточные белки.

  1. Культивируйте клетки в RPMI 1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой при 37 °C и 5% CO2. Убедитесь, что клетки выращены до конечной суммы 6 х 108 клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе клетки подсчитывались с помощью стандартного гемоцитометра и микроскопа.
  2. Центрифугируют культивируемые клетки при 400 × г в течение 10 мин. После выброса супернатанта повторно суспендируют ячейку гранулы в фосфатно-буферном физиологическом растворе комнатной температуры (PBS) в конечной концентрации 4 × 106 клеток/мл, и пипетку осторожно разбивают сгустки.
  3. Центрифугируют клеточную суспензию при 400 × г в течение 10 мин для гранулирования клеток. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в ледяно-холодном лизисном буфере А (полученном на стадии 1.2.1) в конечной концентрации 2 × 107 клеток/мл.
  4. Удалить 7,5 мл клеток, взвешенных в буфере лизиса А (3 × 107 клеток), и оставить на льду для экстракции ядерного белка (раздел 6). Центрифугируют клеточную суспензию при 4 °C, 400 × г в течение 10 мин для гранулирования клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все последующие шаги при температуре 4 °C или на льду и предварительно отклоните все буферы.
  5. Отбросьте надосадочный материал, повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере CI в конечной концентрации 2 × 107 клеток/мл и аккуратно пипетку, чтобы разбить сгустки. Поверните клеточную суспензию концом через конец при 4 °C в течение 20 мин.
  6. Центрифугируют клеточную суспензию при 4 °C, 400 × г в течение 10 мин и переносят супернатант в чистую центрифужную трубку. Сохраните ячейку гранулы и храните на льду. Центрифугировать собранный супернатант при 4 °C, 18 000 × г в течение 20 мин в гранулированный клеточный мусор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта высокоскоростная стадия центрифугирования имеет решающее значение для предотвращения загрязнения цитозольной фракции органеллами и мембранно-связанными белками.
  7. Выбросьте гранулу после переноса супернатанта в чистую центрифужную трубку. Повторяйте оба этапа центрифугирования на этапе 2.6 до тех пор, пока после центрифугирования не будет получена гранула.
  8. Соберите супернатант, которым является цитозольная фракция. Для краткосрочного хранения (1 месяц) убедитесь, что супернатант хранится при 4 °C. Для длительного хранения (>1 месяц) соедините супернатант с 1x буфером Laemmli, содержащим 1x восстановитель, нагревайте при 95 °C в течение 7 мин и храните при -20 или -80 °C.
  9. Повторно суспендируют клеточную гранулу (со стадии 2.6) в лизисном буфере А при конечной концентрации 4 × 106 клеток/мл; пипетку аккуратно разбить комочки.

3. Гомогенизация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы позволят провести механическую гомогенизацию клеток, обработанных дигитонином (из стадии 2.9), что необходимо для выделения митохондриальных и мембранных белковых фракций.

  1. Центрифугируйте клеточную суспензию в буфере лизиса А (приготовленном на стадии 2.9), сохраните гранулу и выбросьте супернатант для удаления избытка дигитонина и цитозольных загрязнителей из клеточной гранулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторные промывки в буфере лизиса А могут быть выполнены для удаления избытка цитозольных загрязнений.
  2. Повторно суспендируют клеточную гранулу в ледяном буфере CH (приготовленном на стадии 1.2.7) в конечной концентрации 4 × 106 клеток/мл. Инкубировать клеточную суспензию на льду в течение 30 мин.
  3. При использовании метода механического лизиса на основе бисера поместите 30 г предварительно промытых шариков из нержавеющей стали 3,2 мм в пробирку с юбкой объемом 50 мл, заполните 15 мл лизисного буфера B и поместите на лед для охлаждения. При использовании гомогенизатора Dounce (с плотно прилегающим пестиком B) заполните соответствующим объемом лизисного буфера B, вставьте пестик и поместите на лед для охлаждения.
  4. После инкубации (стадия 3.2) отбросьте буфер лизиса B из шариковых пробирок (или гомогенизатора Dounce) и переложите 15 мл клеточной суспензии в шариковую трубку (или соответствующий объем гомогенизатору).
  5. Если используется метод на основе бисера, поместите пробирки с шариками, содержащие суспензию ячейки, в устройство блендера и сконфигурируйте так, чтобы они работали в течение 5 мин со скоростью 8. Если вы используете гомогенизатор Dounce, держите его на льду и выполняйте 40 проходов с пестиком, используя медленные, ровные удары (или используйте альтернативный метод механического лизиса клеток, как подробно описано в разделе обсуждения).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании блендера, отличного от используемого здесь, скорость и время, возможно, потребуется определить эмпирически.
  6. Переложите гомогенат в чистую центрифужную трубку и центрифугируйте его при 400 × г в течение 10 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в чистую центрифужную трубку и сохраните; выбросьте гранулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен, а гомогенат хранить при 4 °C в течение короткого срока (24 ч).

4. Удаление мусора и выделение сырых митохондриальных и мембранных фракций

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы позволят удалить клеточный мусор путем центрифугирования гомогената с возрастающей скоростью. За этим следует дифференциальное центрифугирование для выделения сырых митохондриальных и мембранных фракций.

  1. Центрифугируют гомогенат (со стадии 3.6) при 500 × г в течение 10 мин при 4 °С. Переложите супернатант в чистую центрифужную трубку и выбросьте любую гранулу.
  2. Центрифугируют супернатант (со стадии 4.1) при 1000 × г в течение 10 мин при 4 °C. Переложите супернатант в чистую центрифужную трубку и выбросьте любую гранулу.
  3. Центрифугируют супернатант (со стадии 4.2) при 2000 × г в течение 10 мин при 4 °C. Переложите супернатант в чистую центрифужную трубку и выбросьте любую гранулу.
  4. Центрифугируют супернатант (со стадии 4.3) при 4000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в чистую центрифужную трубку и сохраните гранулу, которая представляет собой сырую митохондриальную фракцию.
  5. Центрифугировать супернатант (начиная со стадии 4.4) при 18 000 × г в течение 1 ч при 4 °C. Выбросьте супернатант и сохраните гранулу, которая является сырой мембранной фракцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен, а гранулированные образцы хранить при 4 °C в течение краткосрочного периода (24 ч).

5. Очистка градиента изопикновой плотности

ПРИМЕЧАНИЕ: На следующих этапах используется центрифугирование изопикновой градиентной плотности для очистки сырых митохондриальных и мембранных фракций.

  1. Готовят 50% (v/v) рабочий раствор йодиксанола путем смешивания 1 части разбавителя (приготовленного на стадии 1.1.3) с 5 частями йодиксанола (60% раствора (мас./об.)). Готовят 10%, 15%, 20%, 25%, 30% и 35% растворы йодиксанола (v/v) путем смешивания 50% рабочего раствора (v/v) с лизизным буфером B в соответствующих количествах.
  2. Повторное суспендирование сырых митохондриальных и мембранных гранул (со стадий 4.4 и 4.5) каждая в 200 мкл лизисного буфера B. Доведите до 45% йодиксанола (v/v), добавив 1800 мкл рабочего раствора йодиксанола (50% (v/v)) к 200 мкл повторно суспендированной гранулы.
  3. Создайте прерывистый градиент йодиксанола следующим образом (отрегулируйте объемы в соответствии с емкостью ультрацентрифужной трубки): Добавьте 1 мл 15% йодиксанола (v / v) к нижней части 8 мл, с открытым верхом, тонкостенной ультрацентрифужной трубки, поместите 1 мл 20% йодиксанола (v / v) ниже первого слоя (методом подложки), с последующим подложением 1 мл 25%, 1 мл 30% и 1 мл 35% йодиксанола (v/v).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе должно быть создано 2 градиента: 1 для митохондриальной фракции и 1 для мембранной фракции.
  4. Через 1 градиент добавляют 2 мл сырой митохондриальной гранулы (суспендированной в 45% йодиксаноле (v/v)) с использованием метода подложки к нижней части трубки ниже 35% йодиксанола (v/v). В другом градиенте добавляют 2 мл сырой мембранной гранулы (суспендированной в 45% йодиксаноле (v/v)) с использованием метода подложки на дно трубки ниже 35% йодиксанола (v/v).
  5. Добавьте 1 мл 10% йодиксанола (v/v) в верхнюю часть каждой градиентной трубки, наложив ее поверх слоя 15%. Балансируют пробирки в пределах 0,1 г друг от друга путем добавления 10% йодиксанола (v/v).
  6. Вращайте трубки с градиентом плотности при 4 °C в течение 18 ч при 100 000 × г. Обязательно установите ускорение и замедление на минимальные значения для используемой ультрацентрифуги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В митохондриальном градиенте будет видимая полоса на границе раздела между 25% и 30% йодиксанола (v/v). Это чистая митохондриальная фракция. В мембранном градиенте будет видимая полоса в фракции 15% йодиксанола (v/v). Это чистая мембранная фракция. В мембранном градиенте могут быть дополнительные полосы в фракциях 25% и 30% йодиксанола (v/v). Это митохондриальное загрязнение.
  7. Собирайте фракции с верхней части трубки в 1 мл аликвот, стараясь минимизировать объем фракции, содержащей видимые полосы и меняя кончик пипетки после сбора каждого слоя. В качестве альтернативы проколите бок тонкостенной трубки иглой и соберите видимые полосы.
  8. Храните образцы, как описано в шаге 2.8, до тех пор, пока не пройдут проверку с помощью анализа белка и вестерн-блоттинга.

6. Ядерная белковая изоляция

ПРИМЕЧАНИЕ: Используя ионные и неионные моющие средства, а также такие методы, как обработка ультразвуком и центрифугирование, следующие шаги будут солюбилизировать все клеточные мембраны и позволят выделить ядерные белки.

  1. Центрифугируют 7,5 мл аликвоты клеток, взвешенных в буфере лизиса А (со стадии 2.4), и отбрасывают супернатант. Добавьте 800 мкл ледяного CS-буфера (приготовленного на этапе 1.2.4) и повторно суспендируйте гранулу путем пипетки и вихря. Инкубируйте образцы на льду (или при 4 °C) в течение 30 мин, чтобы разрушить плазменные и органеллные мембраны, защищая ядерные белки.
  2. Центрифугируют клеточную суспензию при 7000 × г в течение 10 мин при 4 °C и выбрасывают супернатант. Добавьте 800 мкл ледяного NL-буфера (приготовленного на стадии 1.2.5) к ядерной грануле после включения бензоназы 1U/μL. Повторно суспендировать гранулу путем аккуратной пипетки. Инкубируйте на торцевом ротаторе в течение 30 мин при 4 °C, чтобы разрушить ядерную мембрану.
  3. Ультразвук в течение 5 с при мощности 20% с пробирками, охлаждаемыми в ледяной ванне (3x, с паузами 5 с между импульсами), которые вместе с бензоназой (добавленной на шаге 6.2) будут сдвигать нуклеиновые кислоты.
  4. Центрифугируют ультразвук при 7 800 × г в течение 10 мин при 4 °C. Соберите и сохраните супернатант, которым является ядерная фракция. Не потревожите нерастворимую гранулу во время сбора надосадочного вещества. Для хранения образцы могут быть подготовлены, как описано в шаге 2.8.

7. Количественная оценка белка и анализ вестерн-блоттинга

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги позволят количественно оценить общий белок в каждой фракции и подтвердить чистоту субклеточных фракций.

  1. Выполните стандартный анализ Брэдфорда для количественной оценки общего белка в каждой фракции. Ожидаемые выходы белка приведены в таблице 1 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие белковые анализы, такие как анализ бицинхониновой кислоты (BCA) или абсорбция при 280 нм, могут быть использованы для измерения общего белка вместо анализа Брэдфорда.
  2. Соедините фракции с 1x буфером Laemmli, содержащим 1x восстановитель, и нагревайте при 95 °C в течение 7 мин. Загрузите 10 мкг каждой фракции в стандартный гель электрофореза SDS-полиакриламидного геля (PAGE) и запустите гель при 20 мА в течение 1 ч.
  3. Перенос разрешенных белков на поливинилдифторидную (PVDF) мембрану путем выполнения стандартного переноса иммуноблота при 100 В в течение 30 мин. Заблокируйте мембрану PVDF с 5% молоком в 1x Tris-буферном физиологическом растворе (TBS), содержащем 0,1% неионного моющего средства (v/v) в течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. Добавляют соответствующие первичные антитела для обнаружения домашних белков, специфичных для каждой субклеточной фракции, и инкубируют в течение ночи при 4 °C. Промывайте мембрану 5% молоком в 1x TBS, содержащим 0,1% неионного моющего средства (v/v) в течение 10 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола антитела против глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH, 1:10000), гистона H3 (1:2000), зависимого от напряжения анионного канала (VDAC, 1:1000) и Na,K+-АТФазы использовались для цитозольной, ядерной, митохондриальной и мембранной фракций соответственно.
  5. Добавляют к мембране соответствующие пероксидазу хрена (HRP)-конъюгированные вторичные антитела (разбавляют согласно инструкциям производителя) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Промывайте мембрану 5% молоком в 1x TBS, содержащим 0,1% неионного моющего средства (v/v) в течение 10 мин при комнатной температуре. Развивайте блоттинг с помощью стандартной хемилюминесценции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схематическая блок-схема этой процедуры (рисунок 1) визуально суммирует шаги, которые были предприняты для успешного фракционирования клеток U9375, выращенных в суспензии. Фракции, собранные с верхней части изопикнового градиента плотности в равных объемах (1 мл), показывают очистку митохондриальной и мембранной фракций (рисунок 2). Использование антитела против VDAC, белка, локализованного на внешней митохондриальной мембране6, показывает, что митохондриальная фракция мигрировала в фракции 25% и 30% йодиксанола (v/v) (рисунок 2A). Использование антитела против субъединицы Na,K+-АТФазы α1, входящей в состав интегрального мембранного гетеродимера, обнаруженного преимущественно в плазматической мембране7, показывает отделение мембранного загрязнения от чистой митохондриальной фракции (фиг.2A). Чистая мембранная фракция мигрировала в наименее плотные фракции, 10% и 15% йодиксанола (v/v) (рисунок 2B). Митохондриальное загрязнение мембранной фракции было разделено градиентом.

Вестерн-блот8 , выполненный с дополнительными маркерами локализации (упомянутыми на этапе 7.4), показывает чистоту цитозольной и ядерной фракций, дополнительно проверяя, что образцы митохондрий и мембран свободны от загрязнения белками из других частей клетки (рисунок 3). Использование антитела против GAPDH, обычно локализованного в цитоплазме клетки9, показывает, что этот белок содержится только в цитозольной фракции (рисунок 3A, lane 1, первая панель), и что не наблюдается загрязнения в экстрагированных ядерных белках, очищенных плотностью митохондриях или мембранных фракциях (Рисунок 3A; Полосы 2, 3 и 4; первая панель). Исследование гистона H3, белка, обнаруженного в ядре и участвующего в структуре хроматина10, показывает успешную ядерную экстракцию (рисунок 3A, полоса 2, вторая панель), с некоторым минимальным обнаружением в цитоплазматической фракции и без перекрестного загрязнения в митохондриальных или мембранных фракциях.

Зондирование VDAC во всех фракциях показывает присутствие этого белка в чистой митохондриальной фракции (рисунок 3A, полоса 3, третья панель), и что в других фракциях не существует перекрестного загрязнения (рисунок 3A; Полосы 1, 2 и 4; третья панель). Зондирование субъединицы Na/K-АТФазы α1 аналогичным образом показывает, что этот белок находится только в чистой мембранной фракции (рисунок 3A, полоса 4, четвертая панель). Эти фракции были проанализированы с помощью денситометрии для подтверждения воспроизводимости и статистической значимости (рисунок 3B-E). В отличие от результатов успешного фракционирования (рисунок 3), неправильное выполнение этого метода (или несоблюдение всех рекомендуемых этапов) может привести к перекрестному загрязнению клеточных компонентов (рисунок 4). Высокая концентрация гистона Н3 в цитозольной фракции (фиг.4, полоса 1, вторая панель) может быть результатом неспособности должным образом осветлить цитозольную фракцию (см. этап 2.6). Это может произойти, если не выполнено достаточное осветление спинов центрифуги или если цитозольная фракция не проясняется быстро. Если цитозольная фракция не осветляется достаточно быстро, это может привести к лизису фрагментов клеток, что приведет к загрязнению цитозольной фракции.

Невыполнение стадии очистки изопикновой плотности приведет к загрязнению мембранной фракции (рисунок 4, полоса 4, все панели), в зависимости от того, насколько гетерогенным является образец до очистки плотности. Правильное соблюдение всех этапов протокола имеет решающее значение для получения желаемого разделения субклеточных фракций. При количественной оценке с использованием анализа Брэдфорда можно определить выход белка для каждой фракции. Ожидаемый выход белка на фракцию представлен в таблице 1. Полезно выполнить количественный анализ белка перед выполнением вестерн-блоттинга по нескольким причинам. Во-первых, это подтверждает, что фракции действительно содержат белок; во-вторых, позволяет загружать гели SDS-PAGE в зависимости от количества белка; и, наконец, предполагая, что выход белка аналогичен ожидаемым (таблица 1), это подтверждает надлежащее выполнение процедуры.

Figure 1
Рисунок 1: Схема процедуры фракционирования клеток. Обзор протокола фракционирования ячеек, представленного в виде блок-схемы. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; CS = солюбилизация клеток; NL = ядерный лизис. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Изопикновая очистка плотности сырых митохондриальных и мембранных фракций. (А) Репрезентативное западное пятно всех фракций, собранных после очистки градиента плотности сырой митохондриальной фракции. (B) Репрезентативное западное пятно всех фракций, собранных после очистки градиента плотности сырой мембранной фракции. Обе очистки градиента плотности показывают миграцию митохондриального маркера, VDAC, для фракций 25% и 30% йодиксанола (v/v) и миграцию мембранного маркера Na,K+ АТФазы для фракций 10% и 15% йодиксанола (v/v). Аббревиатура: VDAC = зависимый от напряжения анионный канал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Успешная изоляция U937 цитозольной, ядерной, митохондриальной и мембранной фракций. (A) Репрезентативные западные пятна клеточных фракций, выделенных из клеточной культуры U937 с помощью этого метода и исследованных на наличие маркеров цитоплазмы (GAPDH, первая панель), ядра (гистон H3, вторая панель), митохондрий (VDAC, третья панель) и мембраны (Na,K+ ATPase α1, четвертая панель). (Б-Е) Денситометрия западных пятен клеточных фракций, выделенных из клеточных культур U937 с помощью этой методики. Результаты получены из 3 независимых экспериментов. Полосы погрешностей представляют стандартное отклонение. Односторонняя ANOVA. с<0.001. Сокращения: GAPDH = глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; VDAC = зависимый от напряжения анионный канал; цито = цитозольный; nuc = ядерный; mito = митохондриальный; mem = мембрана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Неполное фракционирование компонентов ячейки U937. Репрезентативные западные пятна клеточных фракций, выделенных из клеточной культуры U937, показывают загрязнение цитозольной фракции гистоном Н3 (полоса 1, вторая панель) из-за неправильного осветления этой фракции и сырой мембранной фракции, которая не подвергалась изопикновой градиентной очистке плотности (полоса 4, все панели). Сокращения: цито = цитозольный; nuc = ядерный; mito = митохондриальный; mem = мембрана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дробь Выход (мкг/мл) Стандартное отклонение Приблизительный объем
Цитоплазма 1500 146 5 мл
Ядро 1200 172 500 мкл
Митохондрии 400 66 500 мкл
Мембрана 200 23 500 мкл

Таблица 1: Выход белка для каждой субклеточной фракции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Данный способ является модифицированной версией ранее опубликованного подхода к субклеточному фракционированию без использования высокоскоростного центрифугирования11. Этот модифицированный метод требует более специализированного оборудования для достижения наилучших результатов, но является более всеобъемлющим и последовательно воспроизводимым.

Разработка первоначального протокола была необходима из-за невозможности разделения митохондриальных и мембранных образцов для анализа локализации белка при некроптозе12. Попытки использовать исключительно методы на основе моющих средств, обнаруженные в большинстве коммерчески доступных наборов, привели к получению однородной смеси, содержащей плазматическую мембрану и все мембранные органеллы в клетке. Другие ограничения этих наборов включают невозможность внесения изменений в процедуру, стоимость за образец, ограничения по объему и количество образцов, которые могут быть обработаны. Процедура, представленная здесь, может быть изменена до любого масштаба, изменена для выделения меньшего количества фракций и может быть выполнена без использования дорогостоящих реагентов. Выход фракции может быть увеличен за счет использования большего количества клеток; шаги могут быть адаптированы к проводимым исследованиям; и исполнение метода является гибким. Например, если исследователи не исследуют конкретную субклеточную фракцию, им не нужно выделять этот образец в ходе процедуры. Аналогичным образом, добавление конкретных ингибиторов или реагентов может быть опущено, если исследователь не планирует изучать состояние фосфорилирования белков (ортованадат натрия) или не заботится о денатурации белков (гексиленгликоль).

Применение йодиксанола в качестве раствора градиента плотности является необязательным; однако этот реагент не препятствует последующему исследованию образцов с помощью вестерн-блоттинга. Также можно удалить йодаксанол из образцов путем разбавления и центрифугирования для восстановления митохондрий или мембраны, хотя это повлияет на конечный выход. Могут быть использованы другие альтернативные растворы градиента плотности, включая сахарозу. Для получения оптимальных результатов и чистых фракций необходимо учитывать несколько факторов и конкретные критические шаги в протоколе, которые требуют пристального внимания. Этот протокол оптимизирован для фракционирования клеток U937, и концентрация клеток, рекомендуемая в определенных точках протокола, специфична для этой клеточной линии. Эти значения были определены эмпирически и, скорее всего, должны быть скорректированы для различных типов клеток, особенно если при выполнении протокола будут получены субоптимальные результаты.

Осветление цитоплазматического образца должно происходить как можно скорее для удаления неразрывных клеток и мусора, которые могут привести к перекрестному загрязнению белками из других субклеточных фракций (рисунок 4, полоса 1, вторая панель). Гомогенизация может быть выполнена с любой формой механического лизиса, хотя результаты, представленные здесь, были получены с использованием метода на основе шариков и устройства блендера. Альтернативные ручные формы гомогенизации (гомогенизатор Dounce или прохождение через небольшую калибровочную иглу) также могут быть использованы, но могут привести к проблемам воспроизводимости из-за изменчивости техники человеком, выполняющим процедуру. Эта группа заинтересована в первую очередь в циркулирующих лейкоцитах, поэтому в этой процедуре используются клетки U937. Тем не менее, эта процедура может быть применена к другим клеточным линиям суспензии с вероятной небольшой потребностью в изменении. Порции, которые, возможно, потребуется скорректировать для размещения другой клеточной линии суспензии, включают клеточные концентрации, используемые на протяжении всей процедуры, а также концентрацию дигитонина, используемую для извлечения цитозольной фракции.

Хотя эта процедура не оптимизирована для адгезивных клеточных линий, она может служить отправной точкой, в которую могут быть внесены коррективы для размещения адгезивных клеток. Эти корректировки включают концентрацию клеток, концентрацию дигитонина и время гомогенизации. Кроме того, адгезивные клетки ограничены площадью поверхности, в то время как суспензионные ячейки ограничены объемом; это упрощает масштабирование суспензионных ячеек. Для масштабирования адгезивных клеток необходимо использовать тканевые культуральные пластины с большой площадью поверхности (>500см2). Эта процедура представляет собой экономически эффективное, воспроизводимое субклеточное фракционирование со способностью разделять цитозольную, ядерную, митохондриальную и мембранную фракции с большой чистотой. Одним из самых больших преимуществ этой процедуры является отделение митохондриальной фракции от мембранной фракции. Это невозможно в процедурах, основанных исключительно на моющих средствах. Хотя в этой процедуре используются моющие средства, они используются для пермеабилизации, но не разрушения плазматической мембраны (дигитонина) и для получения ядерной фракции после выделения митохондриальной и мембранной фракций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH R15-HL135675-01 и NIH 2 R15-HL135675-02 для T.J.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
  2. Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
  4. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  5. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  6. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  7. Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
  8. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  9. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  10. Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
  11. McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
  12. McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).

Tags

Биохимия Выпуск 174 Клеточное фракционирование Ядро Митохондрии Мембрана Цитоплазма Органеллы Ультрацентрифугирование Градиент плотности U937

Erratum

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 05/31/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 07/22/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Фракционирование клеток U937 методом изопикновой очистки градиента плотности
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCaig, W. D., Deragon, M. A.,… More

McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter