Summary
胶质瘤干细胞 （GSC） 是癌症细胞的一小部分，在肿瘤启动、血管生成和胶质母细胞瘤 （GBM） 中的耐药性方面起着至关重要的作用，胶质母细胞瘤 （GBM） 是最普遍和最具破坏性的原发性脑肿瘤。GSC 的存在使 GBM 对大多数单个目标制剂非常耐火，因此需要高通量筛查方法来识别潜在的有效组合治疗。该协议描述了一个简单的工作流程，使潜在的组合疗法与协同相互作用的快速筛选。此工作流程的一般步骤包括建立带有葡萄糖标记的 GSC、准备母体涂层板、组合药物筛选、分析和验证结果。
Abstract
胶质瘤干细胞 （GSC） 是癌症细胞的一小部分，在肿瘤启动、血管生成和胶质母细胞瘤 （GBM） 中的耐药性方面起着至关重要的作用，胶质母细胞瘤 （GBM） 是最普遍和最具破坏性的原发性脑肿瘤。GSC 的存在使 GBM 对大多数单个目标制剂非常耐火，因此需要高通量筛查方法来识别潜在的有效组合治疗。该协议描述了一个简单的工作流程，使潜在的组合疗法与协同相互作用的快速筛选。此工作流程的一般步骤包括建立带有葡萄糖标记的 GSC、准备母体涂层板、组合药物筛选、分析和验证结果。
Introduction
胶质母细胞瘤 （GBM） 是原发性脑肿瘤中最常见和最具有攻击性的类型。目前，接受最大治疗（手术、化疗和放疗相结合）的GBM患者的总体存活期仍不足15个月：因此， 迫切需要新颖有效的 Gbm 疗法。
胶质瘤干细胞（GSC）在GBM中的存在对常规治疗构成相当大的挑战，因为这些干细胞在维持肿瘤微环境、耐药性和肿瘤复发1方面起着枢轴作用。因此，针对GSC可能是GBM治疗2的一个有希望的战略。然而，GBM药物疗效的一个主要缺点是其异质性，包括但不限于基因突变、混合亚型、表观遗传调节和肿瘤微环境的差异，这使得它们对治疗非常耐火。经过多次失败的临床试验，科学家和临床研究人员意识到，单一药物靶向治疗可能无法完全控制高异质性癌症（如GBM）的进展。然而，经过精心挑选的药物组合通过协同提高彼此的效果，已批准其有效性，从而为GBM治疗提供了一个有希望的解决方案。
虽然有许多方法来评估药物组合的药物-药物相互作用，如CI（组合指数）、HSA（最高单一剂）和Bliss值等3、4，但这些计算方法通常基于多个浓度组合。事实上，这些方法可以提供药物-药物相互作用的肯定评估，但如果应用于高通量筛查，可能会非常费力。为了简化这一过程，开发了一个筛选工作流程，用于快速识别抑制GCS生长的潜在药物组合，这些组合源自患者GBM的外科活检。该方法引入了反映预期组合效应和观察到的组合效应差异的灵敏度指数 （SI），以量化每种药物的协同效应，因此 SI 排名可以轻松识别潜在候选者。同时，本协议演示了一个示例屏幕，以识别在20种小分子抑制剂中，能够与特莫佐洛米德（GBM治疗的一线化疗）协同抗胶质瘤效应的潜在候选者。
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Protocol
GBM标本是在获得南京医科大学第一附属医院人类研究伦理委员会的充分知情同意后，在一次常规手术中从患者身上采集的。
1. 患者衍生的GCS的隔离和文化
- 将新鲜手术切除的胶质母细胞瘤组织放入充满无菌 PBS 的 15 mL 离心机管中，并将组织储存在冰上，直到进一步手术。
- 使用解剖剪刀将GBM组织切成直径约0.5至1毫米的碎片，并用神经元基底介质清洗组织标本，以清除生物安全柜中的细胞碎片。
- 在 37 °C 下以 30 分钟 1 毫克/mL 拼贴剂 A 消化组织片段，在 4°C 下以 400 x g 为离心机在 5 分钟内消化离心机。
- 取出超高颗粒，用空白的神经元基底介质悬浮颗粒，并通过在冰上重复管道机械地分离颗粒。
- 在 37 °C 的无菌细胞培养器中培养充满 GSC 培养介质的超低附件 6 井培养板中的混合物（见食谱 表 1）， 在 37 °C 下具有 5% CO2 和 90% 湿度，直到神经球形成。
- 在足够的神经圈形成时，使用移液器在 1.5 mL 微管中收集它们，在室温下以 800 x g 离心机收集 5 分钟。
- 重新使用颗粒，将其拆分成几个烧瓶，其中填充了上述培养基，用于维持主要的 GSC。
注：本例中使用的患者衍生的GCS来自世卫组织IV级复发性GBM患者一名34岁男性患者的外科活检。GSC被命名为XG387作为未来的实验。对上述GC进行了基于PCR的支原体测试，以确认不存在支原体污染。本议定书中使用的所有涉及GSC的实验都是在15段<进行的。
2. 准备带有卢西费拉斯标记的 GSC
- 从中等培养物中收集 GSC，并在室温下以 70 x g 离心 3 分钟。
- 取出超高分子，在37°C下用加苏酶消化细胞4分钟。 反复使用 200 μL 尖端和移液器分离和重新悬念细胞颗粒。
- 将细胞稀释到12井培养板中每口井2×105 个细胞，并在一夜之间培养细胞。
- 在板中的每口井中加入 30 μL 荧光酶-EGFP 病毒超高分子（滴答> 108 TU/mL），然后在 25 °C 下以 1，000 x g 为 2 h 离心离心。 一夜之间培养细胞。
- 第二天刷新介质，再培养细胞48小时。
- 在荧光显微镜下观察细胞，以确认GFP阳性细胞的外观。
- 使用流细胞分拣器对具有高 GFP 荧光的 GSC 进行排序和选择，以进一步培养细胞。
3. 基于生物发光的细胞生存能力测量
- 涂有细胞外基质 （ECM） 混合物（例如，马特里格尔）：在每个油井中加入 40 微升 0.15 毫克/mL ECM 混合物，并在 37 °C 下孵育板 1 小时。 取出多余的ECM混合物，用PBS轻轻冲洗一次。
- 添加 100 μL 文化介质，包含 15，000， 10，000、8，000、6，000、4，000、2，000、1，000 和 500 XG387-Luc 细胞以及 100 μL 空白介质，在 96 井光学底板中对每口井进行 6 次复制，并在 37 °C 下隔夜培养细胞。
- 取出超高酸剂，在每个井中加入含有150 ng/μL D-luciferin的50微升培养介质，并在37°C下孵育细胞5分钟。
- 使用 IVIS 频谱成像系统拍摄板中的细胞生物发光图像。使用内置软件创建感兴趣的区域 （ROI） 的多个圆形区域，并量化细胞生物发光。
4. 特莫佐洛米德治疗和组合筛查
- 治疗前，预涂上上述四个96井板。
- 种子XG387-Luc细胞在密度为1000个细胞的100微升培养介质进入每口井的96井光学底板和培养细胞过夜。
- 提前从库存解决方案中准备特莫佐洛米德和目标代理。在培养中准备由 800 μM、600 μM、400 μM、300 μM、200 μM、100 μM 和 50 μM 特莫佐洛米德组成的浓缩系列，用于单代理治疗。稀释特莫佐洛米德和定向剂在库存溶液中分别在培养基中，获得200微米和2微米的最后浓度用于组合药物筛选（表2）。
- 当大多数 GSC 粘附在板的底部时，移除培养介质;将上述含有特莫佐洛米德的介质添加到每口井中，每次处理可进行三次技术复制。
- 要治疗特莫佐洛米德和筛选药物组合，请删除空白介质，并添加上述准备的介质，其中含有 200 μM 特莫佐洛米德或 2 μM 靶向剂，或将两者组合到每个井中，每次治疗可进行三次技术复制。
- 在 37 °C、5% 二氧化碳下孵育所有板材 3 天。
- 取出含药物介质，在每个油井中加入含有 150 ng/μL D-luciferin 的 50 μL 空白介质，并在 37 °C 下孵育细胞 5 分钟。
- 使用 IVIS 频谱成像系统拍摄板中的细胞生物发光图像。使用内置软件创建多个圆形 ROI 并量化细胞生物发光。
5. XG387-Luc 和 XG328-Luc 细胞系中特莫佐洛米德和 UMI-77 的组合处理
- 在治疗前，预涂上上述三个 96 井板。
- 种子XG387-Luc和XG328-Luc细胞的密度分别为1000个细胞，在100微升的培养介质中进入每个96井光学底板的井中，并在一夜之间培养细胞。
- 准备由 600 μM、400 μM、300 μM、200 μM 组成的浓度系列， 100 μM、50 μM 和 0 μM 特莫佐洛米德和由 6 μM、4 μM、3 μM、2 μM、1 μM、0.5 μM 和 0 μM UMI-77 组成的浓缩系列，用于六乘六剂量的配给矩阵治疗。
- 当大多数 GSC 粘附在板的底部时，移除空白介质;将上述准备的介质添加到每口井中，每次处理可进行三次技术复制。
- 在 37 °C、5% CO2下孵育这些板 3 天。
- 取出含药物介质;在每个油井中加入50微克的空白介质，其中含有150 ng/μL D-luciferin，并在37°C下孵育细胞5分钟，用于生物发光测量。
6. 数据分析
- 根据 图2A中的公式计算特莫佐洛米德和靶向剂的灵敏度指数（SI）分数。
注：SI 分数是量化添加另一种药物的影响。它的范围从 -1 到 +1， 正值表示特莫佐洛米德协同效应. - 使用 CompuSyn 软件计算特莫佐洛米德和 UMI-77 之间的组合索引 （CI） 值，以分析它们的组合交互。CI 值 <1 表示协同作用：CI 值>1 表示对抗。
- 使用康贝内菲特软件计算特莫佐洛米德和 UMI-77 之间的高单一代理 （HSA） 值。HSA 值表示组合抑制作用。HSA 值 >0 表示协同作用，HSA 值<0 表示对抗。
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Representative Results
XG387细胞在表1中描述的培养基中形成神经球，在超低附件6井培养板或非涂层板5（图1A）中形成。首先，进行了一项测试，以检查XG387-Luc细胞的生物发光强度是否与细胞数成正比。如图1B所示，生物发光强度与细胞密度成正比增加，导致它们之间的线性校正（Pearson r = 0.9872;p <0.0001;图1C）。由于荧光素标记细胞的生物发光是简单和快速测量，这提供了一个简单的方法来测量可行的GCC的密度。接下来，评估了特莫佐洛米德的反增殖活性。如图1D所示，400微米特莫佐洛米德导致XG387-Luc细胞约20%的增殖抑制，这表明它是有用的，但它的抗GBM效果可以进一步提高。选择 200 μM 的浓度进行组合筛选。
举个例子，20种靶向选择性小分子抑制剂用于药物组合筛选，以识别增强特莫佐洛米德抗GBM效果的潜在候选者。因此，13个目标代理的敏感指数（SI）值高于0，其中5个高于0.1（图2B，C）。特别是前两种候选药物UMY-77和A 83-01的SI高于0.25，表明它们有可能与特莫佐洛米德协同作用。
为了验证上述发现，应用了HSA和Bliss3、4、6的经典协同模型，以确定特莫佐洛米德和UMY-77在GSC中的综合效应。此外，XG328-另一个患者衍生的GSC模型建立早期-用于执行相同的评估。对特莫佐洛米德和UMY-77的联合治疗进行抗增殖性测定，在六乘六剂量的点子基质中进行。分析结果以获取HSA和Bliss值，这些值是协同抑制的读数，并描绘了预期抑制和观察到的抑制之间的差异。如图3B-D所示，组合指数 （CI） 值<1 和高单个代理 （HSA） 值>0，用于不同浓度的特莫佐洛米德和 UMI-77 的大多数组合，这表明在 XG387 和 XG328 GSC 中，特莫佐洛米德和 UMI-77 的整体协同相互作用。
图1：GBM患者衍生的GCSXG387.（A）神经圈形成。（B） XG387-Luc细胞产生的生物发光生成与细胞密度成正比。（D） 特莫佐洛米德治疗XG387。每次治疗都用三重实验和两个独立的实验进行。数据表示为 SD ±平均值。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：使用GSC（A）进行药物组合筛选，计算组合屏幕上20种目标药物的SI（敏感指数）的公式。（B） 20 个目标代理的 SI 值分布。红点：前五名候选药物。（C） 前五名候选人的资料对象为代理人。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：XG387-Luc和XG328-Luc细胞系中特莫佐洛米德（TMZ）和UMY-77的组合处理。 （A ） 在XG387-Luc和XG328-Luc细胞系的增殖检测中，单体和组合滴定和UMY-77。（B） 伊索博洛格拉姆和组合指数分析XG387-Luc和XG328-Luc细胞的增殖抑制，用特莫佐洛米德和UMI-77治疗。CI <1 表示协同效应。（C，D）康贝内菲特生成的协同图显示特莫佐洛米德和 UMI-77 之间的相互作用。对相互作用的分析得出了 HSA（高单一代理）值和 Bliss 值，表明根据预期计算的协同功效。HSA 和 Bliss 值>0 表示协同效应。每次治疗都用三重实验和两个独立的实验进行。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在本研究中，描述了一种可用于使用患者衍生的 GSC 确定 GBM 潜在组合疗法的协议。与标准协同/增殖性指标模型（如 Loewe、BLISS 或 HSA 方法）不同，使用了简单而快速的工作流程，不需要将药物对以全因子方式以全因子方式与传统方法以多个浓度组合。在此工作流中，引入SI（敏感性指数），该指数源于一项研究，以评估SIRNA与小分子抑制剂相结合的敏感效应，以量化两种小分子抑制剂的协同药物效应。SI 值的范围从 -1 到 1，正 SI 值表示每种药物之间的敏感效果。SI 值实现得越高，协同作用就越强。虽然仅凭SI值无法对药物相互作用的类型（协同、添加剂或对抗性）提供肯定的答案，但这些排名靠前的候选者极有可能与感兴趣的药物协同，因此值得进一步验证。相比之下，目前大多数高通量药物组合筛选方法仍然费力，涉及困难的算法8，9。
为了证明这种方法的可行性，进行了小规模的测试屏幕。因此，有可能确定UMI-77，一种选择性的MCL1抑制剂，作为20种靶向剂中与GSC生长抑制中的特莫佐洛米德协同作用的首选。事实上，在先前的研究中，UMI-77也被发现在既定的GBM细胞10中协同增强特莫佐洛米德的抗胶质瘤活性。在目前的研究中，UMI-77 和特莫佐洛米德之间的协同相互作用再次在 GSC 中使用经典的 Chou-Talalay 组合索引、BLISS 或 HSA 方法获得批准。此协议的另一个优点是使用带有荧光酶标记的 GSC 来测量细胞的可行比例。细胞的荧光素活性可以通过添加路西法林（荧光素的基质）来轻松测量，并且通过具有光度测量功能的任何仪器捕捉发光。由于葡萄糖-卢西法林反应快，因此与传统的 MTT （3-（4，5-迪米基硫醇-2-yl） -2，5-二苯甲基溴）、MTS （3-） 相比，它提供了一个廉价而快速的解决方案 4，5-二甲基硫醇-2-yl）-5-（3-卡盒甲基苯）-2-（4-硫苯）-2H特特拉佐利姆），或CKK-8（细胞计数套件-8）检测， 所有这些都需要很长的孵化时间。该协议共同提出了对GBM潜在药物组合的高通量筛选。该协议还提供了可选的快速和简单的解决方案的药物组合屏幕除了标准的协同评估方法。
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Disclosures
作者声明没有冲突要披露。
Acknowledgments
我们感谢中国国家自然科学基金（81672962）、江苏省创新团队项目基金会、东南大学联合重点项目基金会和南京医科大学的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 50X |
| EGF | Gibco | PHG0313 | 20 ng/ml |
| FGF | Gibco | PHG0263 | 20 ng/ml |
| Gluta Max | Gibco | 35050061 | 100X |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | 1X |
| Penicillin-Streptomycin | HyClone | SV30010 | P: 10,000 units/ml S: 10,000 ug/ml |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 2088876 | 100 mM |
| Table 1. The formulation of GSC complete culture medium. | |||
| ABT-737 | MCE | Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor | |
| Adavosertib (MK-1775) | MCE | Wee1 inhibitor | |
| Axitinib | MCE | Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor | |
| AZD5991 | MCE | Mcl-1 inhibitor | |
| A 83-01 | MCE | Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase | |
| CGP57380 | Selleck | Potent MNK1 inhibitor | |
| Dactolisib (BEZ235) | Selleck | Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor | |
| Dasatinib | MCE | Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor | |
| Erlotinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Gefitinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Linifanib | MCE | Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family | |
| Masitinib | MCE | Inhibitor of c-Kit | |
| ML141 | Selleck | Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase | |
| OSI-930 | MCE | Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R | |
| Palbociclib | MCE | Selective CDK4 and CDK6 inhibitor | |
| SB 202190 | MCE | Selective p38 MAP kinase inhibitor | |
| Sepantronium bromide (YM-155) | MCE | Survivin inhibitor | |
| TCS 359 | Selleck | Potent FLT3 inhibitor | |
| UMI-77 | MCE | Selective Mcl-1 inhibitor | |
| 4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene) | Selleck | Selective estrogen receptor (ER) modulator | |
| Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table. |
References
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