Un flusso di lavoro di screening rapido per identificare la potenziale terapia combinata per GBM utilizzando cellule staminali di glioma derivate dal paziente

Summary

Le cellule staminali del glioma (GSC) sono una piccola frazione di cellule tumorali che svolgono ruoli essenziali nell'inizio del tumore, nell'angiogenesi e nella resistenza ai farmaci nel glioblastoma (GBM), il tumore cerebrale primario più diffuso e devastante. La presenza di GSC rende il GBM molto refrattario alla maggior parte dei singoli agenti mirati, quindi sono necessari metodi di screening ad alto rendimento per identificare potenziali terapie di combinazione efficaci. Il protocollo descrive un semplice flusso di lavoro per consentire uno screening rapido per la potenziale terapia di combinazione con interazione sinergica. I passaggi generali di questo flusso di lavoro consistono nello stabilire GSC con tag luciferasi, preparare piastre rivestite di matrigel, screening farmacologico combinato, analisi e convalida dei risultati.

Abstract

Le cellule staminali del glioma (GSC) sono una piccola frazione di cellule tumorali che svolgono ruoli essenziali nell'inizio del tumore, nell'angiogenesi e nella resistenza ai farmaci nel glioblastoma (GBM), il tumore cerebrale primario più diffuso e devastante. La presenza di GSC rende il GBM molto refrattario alla maggior parte dei singoli agenti mirati, quindi sono necessari metodi di screening ad alto rendimento per identificare potenziali terapie di combinazione efficaci. Il protocollo descrive un semplice flusso di lavoro per consentire uno screening rapido per la potenziale terapia di combinazione con interazione sinergica. I passaggi generali di questo flusso di lavoro consistono nello stabilire GSC con tag luciferasi, preparare piastre rivestite di matrigel, screening farmacologico combinato, analisi e convalida dei risultati.

Introduction

Il glioblastoma (GBM) è il tipo più comune e aggressivo di tumore cerebrale primario. Attualmente, la sopravvivenza globale dei pazienti GBM che hanno ricevuto il massimo trattamento (una combinazione di chirurgia, chemioterapia e radioterapia) è ancora inferiore a 15 mesi; quindi sono urgentemente necessarie terapie nuove ed efficaci per GBM.

La presenza di cellule staminali di glioma (GSC) nel GBM costituisce una sfida considerevole per il trattamento convenzionale in quanto queste cellule staminali svolgono ruoli di perno nel mantenimento del microambiente tumorale, della resistenza ai farmaci e della recidiva tumorale¹. Pertanto, il targeting delle GSC potrebbe essere una strategia promettente per il trattamento GBM². Tuttavia, un importante svantaggio per l'efficacia del farmaco in GBM è la sua natura eterogenetica, inclusa ma non limitata alla differenza di mutazioni genetiche, sottotipi misti, regolazione epigenetica e microambiente tumorale che li rende molto refrattari per il trattamento. Dopo molti studi clinici falliti, scienziati e ricercatori clinici si sono resi conto che la terapia mirata a singolo agente è probabilmente incapace di controllare completamente la progressione di tumori altamente eterogenei come il GBM. Considerando che, combinazioni di farmaci accuratamente selezionate sono state approvate per la loro efficacia migliorando sinergicamente l'effetto l'una dell'altra, fornendo così una soluzione promettente per il trattamento GBM.

Sebbene ci siano molti modi per valutare le interazioni farmaco-farmaco di una combinazione di farmaci, come i valori CI (Combination Index), HSA (Highest Single Agent) e Bliss, ecc. 3^,4, questi metodi di^calcolosono solitamente basati su combinazioni di concentrazione multiple. In effetti, questi metodi possono fornire una valutazione affermativa dell'interazione farmaco-farmaco, ma possono essere molto laboriosi se applicati nello screening ad alto rendimento. Per semplificare il processo, è stato sviluppato un flusso di lavoro di screening per identificare rapidamente le potenziali combinazioni di farmaci che inibiscono la crescita delle GSC originate da biopsie chirurgiche del paziente GBM. Un indice di sensibilità (SI) che riflette la differenza tra l'effetto combinato atteso e l'effetto combinato osservato è stato introdotto in questo metodo per quantificare l'effetto sinergizzante di ciascun farmaco, in modo che i potenziali candidati possano essere facilmente identificati dalla classifica SI. Nel frattempo, questo protocollo dimostra uno screening di esempio per identificare i potenziali candidati che possono sinergizzare l'effetto anti-glioma con temozolomide, la chemioterapia di prima linea per il trattamento GBM, tra 20 piccoli inibitori molecolari.

Protocol

Il campione gbM è stato acquisito da un paziente durante un'operazione di routine dopo aver ottenuto il consenso pienamente informato dal comitato etico della ricerca umana del primo ospedale affiliato dell'Università di Medicina di Nanchino.

1. Isolamento e coltura delle GSC derivate dal paziente

1. Posizionare il tessuto di glioblastoma fresco resecato chirurgicamente in un tubo di centrifuga da 15 ml riempito con PBS sterile e conservare il tessuto sul ghiaccio fino a un'ulteriore operazione.
2. Tritare il tessuto GBM in pezzi di diametro da 0,5 a 1 mm usando le forbici di dissezione e lavare i campioni di tessuto con un mezzo basale neuronale per rimuovere i detriti cellulari in un armadio di biosicurezza.
3. Digerire i frammenti di tessuto con 1 mg/mL di collagenasi A a 37 °C per 30 minuti e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
4. Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet con mezzo basale neuronale vuoto e dissociare meccanicamente il pellet mediante pipettaggio ripetitivo su ghiaccio.
5. Colturare la miscela in piastre di coltura a 6 pozzetti ad attacco ultra-basso riempite con terreno di coltura GSC (vedere tabella 1 per la ricetta) in un incubatore cellulare sterile con il 5% di CO₂ e il 90% di umidità a 37 °C fino alla formazione della neurosfera.
6. Su sufficiente formazione della neurosfera, raccoglierli usando una pipetta in un microtubo da 1,5 ml e centrifuga a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Risuscisci il pellet e dividilo in diversi palloni riempiti con il terreno di coltura di cui sopra per mantenere le GSC primarie.
   NOTA: le GSC derivate dal paziente utilizzate nell'esempio sono state derivate da biopsie chirurgiche di un paziente di sesso maschile di 34 anni con GBM ricorrente di grado IV dell'OMS. I GSC sono stati nominati come XG387 per gli esperimenti futuri. I test del micoplasma basati sulla PCR sono stati eseguiti per le GSC di cui sopra per confermare che non è presente alcuna contaminazione da micoplasma. Tutti gli esperimenti che coinvolgono le GSC utilizzate in questo protocollo sono stati condotti <15 passaggi.

2. Preparazione delle GSC con tag luciferasi

1. Raccogliere le GSC dalla mediacoltura e centrifugarle a 70 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
2. Rimuovere il surnatante, digerire le cellule con l'accutasi per 4 minuti a 37 °C. Utilizzare ripetutamente una punta e una pipetta da 200 μL per dissociare e risusciare il pellet cellulare.
3. Diluire le cellule a 2 x 10⁵ cellule per pozzetti in una piastra di coltura a 12 pozzetti e farle in coltura durante la notte.
4. Aggiungere 30 μL di surnatante del virus luciferasi-EGFP (titolo >10⁸ TU /mL) in ciascun pozzo della piastra e quindi centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 ore a 25 °C. Coltura le cellule durante la notte.
5. Aggiorna il mezzo il giorno successivo e coltivate le cellule per altre 48 ore.
6. Osservare le cellule al microscopio fluorescente per confermare l'aspetto delle cellule GFP positive.
7. Utilizzare un selezionatore di celle a flusso per ordinare e selezionare le GSC con elevata fluorescenza GFP per far coltura ulteriormente le cellule.

3. Misurazione della vitalità cellulare basata sulla bioluminescenza

1. Piastre di rivestimento con la miscela a matrice extracellulare (ECM) (ad esempio, Matrigel): aggiungere 40 μL di miscela ECM da 0,15 mg/mL a ciascun pozzetti e incubare la piastra per 1 ora a 37 °C. Rimuovere la miscela ECM in eccesso e risciacquare delicatamente una volta con PBS.
2. Aggiungere un terreno di coltura da 100 μL contenente 15.000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000 e 500 cellule XG387-Luc insieme a un mezzo vuoto da 100 μL come controllo in ciascun pozzetti per 6 repliche in una piastra inferiore ottica a 96 pozzetti e colturare le cellule durante la notte a 37 °C.
3. Rimuovere il surnatante, aggiungere 50 μL di terreno di coltura contenente 150 ng/μL di D-luciferina in ciascun pozzo e incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C.
4. Scatta immagini della bioluminescenza cellulare nella piastra utilizzando il sistema di imaging dello spettro IVIS. Utilizzare il software integrato per creare più aree circolari della regione di interesse (ROI) e quantificare la bioluminescenza cellulare.

4. Trattamento con Temozolomide e screening di combinazione

1. Preverare quattro piastre da 96 pozzi come descritto sopra, prima del trattamento.
2. Semina cellule XG387-Luc ad una densità di 1.000 cellule in un terreno di coltura da 100 μL in ciascun pozzetti di una piastra di fondo ottica a 96 pozzetti e coltura le cellule durante la notte.
3. Preparare in anticipo temozolomide e gli agenti mirati dalla soluzione stock. Preparare una serie di concentrazioni composta da 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM e 50 μM temozolomide in terreno di coltura per il trattamento con un singolo agente. Temozolomide diluito e gli agenti bersaglio in soluzione stock nel terreno di coltura, rispettivamente, per ottenere concentrazioni finali di 200 μM e 2 μM per lo screening farmacologico combinato (Tabella 2).
4. Rimuovere il terreno di coltura quando la maggior parte delle GSC aderisce al fondo delle piastre; aggiungere il mezzo sopra preparato contenente temozolomide in ciascun pozzetto per tre repliche tecniche per trattamento.
5. Per trattare Temozolomide e per esaminare le combinazioni di farmaci rimuovere il mezzo vuoto e aggiungere il mezzo sopra preparato contenente 200 μM temozolomide, o 2 μM agente mirato, o una combinazione di entrambi in ciascun pozzetto per tre repliche tecniche per trattamento.
6. Incubare tutte le piastre a 37 °C, 5% CO2 per 3 giorni.
7. Rimuovere il mezzo contenente il farmaco, aggiungere 50 μL di terreno bianco contenente 150 ng/μL di D-luciferina in ciascun pozzo e incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C.
8. Scatta immagini della bioluminescenza cellulare nella piastra utilizzando il sistema di imaging dello spettro IVIS. Utilizza il software integrato per creare più ROI circolari e quantificare la bioluminescenza cellulare.

5. Trattamento combinato di temozolomide e UMI-77 in linee cellulari XG387-Luc e XG328-Luc

1. Prevere tre piastre da 96 pozzi come descritto sopra, prima del trattamento.
2. Semina cellule XG387-Luc e XG328-Luc ad una densità di 1.000 cellule rispettivamente in 100 μL di terreno di coltura in ciascun pozzetti di una piastra di fondo ottica a 96 pozzetti e coltura le cellule durante la notte.
3. Preparare una serie di concentrazioni composta da 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM e 0 μM temozolomide e una serie di concentrazione composta da 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM e 0 μM UMI-77 nel terreno di coltura per trattamenti con matrice di titolazione a dose sei per sei.
4. Rimuovere il supporto vuoto quando la maggior parte delle GSC aderisce al fondo della piastra; aggiungere il mezzo sopra preparato in ogni pozzo per tre repliche tecniche per trattamento.
5. Incubare queste piastre per 3 giorni a 37 °C, 5% CO₂.
6. Rimuovere il mezzo contenente farmaci; aggiungere 50 μL di mezzo bianco contenente 150 ng/μL di D-luciferina in ciascun pozzo e incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C per la misurazione della bioluminescenza.

6. Analisi dei dati

1. Calcolare il punteggio dell'indice di sensibilità (SI) di temozolomide e agente mirato secondo la formula in Figura 2A.
   NOTA: Il punteggio SI è quello di quantificare l'influenza dell'aggiunta di un altro farmaco. Variava da -1 a +1, con valori positivi che indicavano effetti sinergici di temozolomide.
2. Calcola i valori dell'indice di combinazione (CI) tra temozolomide e UMI-77 utilizzando il software CompuSyn per analizzare le loro interazioni combinate. Il valore CI <1 indica la sinergia; Il valore CI >1 indica l'antagonismo.
3. Calcolare gli elevati valori di agente singolo (HSA) tra temozolomide e UMI-77 utilizzando il software Combenefit. Il valore HSA indica l'effetto inibitorio combinato. Il valore HSA >0 indica sinergia e il valore HSA <0 indica antagonismo.

Representative Results

Le cellule XG387 hanno formato neurosfere nel terreno di coltura descritto nella Tabella 1 in una piastra di coltura a 6 pozzetti di attacco ultra-basso o in una piastra non rivestita⁵ (Figura 1A). In primo luogo, è stato eseguito un test per verificare se l'intensità di bioluminescenza delle cellule XG387-Luc fosse proporzionale al numero di cellule. Come mostrato in Figura 1B,l'intensità della bioluminescenza è aumentata proporzionalmente alla densità cellulare e ha comportato una correzione lineare tra di loro (Pearson r = 0,9872; p < 0,0001; Figura 1C). Poiché la bioluminescenza delle cellule marcate con luciferasi è facile e veloce da misurare, questo fornisce un metodo semplice per misurare la densità delle GSC vitali. Successivamente, è stata valutata l'attività anti-proliferativa di temozolomide. Come mostrato nella Figura 1D,400 μM di temozolomide hanno causato circa il 20% di inibizione della proliferazione delle cellule XG387-Luc, suggerendo che è utile ma il suo effetto anti-GBM può essere ulteriormente migliorato. La concentrazione di 200 μM è stata selezionata per lo screening combinato.

Per fare un esempio, 20 inibitori target-selettivi di piccole molecole sono stati utilizzati per lo screening della combinazione di farmaci per identificare i potenziali candidati che migliorano l'effetto anti-GBM di temozolomide. Di conseguenza, i valori dell'indice sensibile (SI) di 13 agenti bersaglio erano superiori a 0 e 5 di essi erano superiori a 0,1 (Figura 2B,C). In particolare, il SI dei primi due farmaci candidati UMI-77 e A 83-01 era superiore a 0,25, suggerendo il loro potenziale di sinergia con temozolomide.

Per convalidare il risultato di cui sopra, sono stati applicati i modelli di sinergia classici di HSA e Bliss^3,4,6 per determinare l'effetto combinato di temozolomide e UMI-77 nelle GSC. Inoltre, XG328 - un altro modello GSC derivato dal paziente stabilito precocemente - è stato utilizzato per eseguire la stessa valutazione. Il saggio anti-proliferativo del trattamento combinato di temozolomide e UMI-77 è stato eseguito in una matrice di titolazione della dose sei per sei. I risultati sono stati analizzati per acquisire i valori HSA e Bliss che sono readout per l'inibizione sinergica e descrivono la differenza tra l'inibizione attesa e l'inibizione osservata. Come mostrato nella Figura 3B-D,i valori dell'indice di combinazione (CI) <1 e i valori elevati di singolo agente (HSA) >0 per la maggior parte delle combinazioni di temozolomide e UMI-77 a diverse concentrazioni, suggerisce un'interazione sinergica complessiva di temozolomide e UMI-77 sia nelle GSC XG387 che XG328.

Figura 1: GBM GSC derivate dal paziente XG387. ( A )Formazionedella neurosfera. (B) Generazione di bioluminescenza di GSC marcate con luciferasi. (C) La bioluminescenza generata dalle cellule XG387-Luc era proporzionale alla densità cellulare. (D) Temozolomide trattamento di XG387. Ogni trattamento è stato eseguito in triplice copia con due esperimenti indipendenti. I dati sono espressi come la media ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Screening delle combinazioni di farmaci mediante GSC. (A) La formula per calcolare il SI (indice di sensibilità) di 20 agenti mirati con temozolomide (TMZ) nella schermata di combinazione. (B) La distribuzione dei valori SI di 20 agenti bersaglio. Punti rossi: i primi cinque farmaci candidati. (C) Informazioni sui primi cinque agenti target candidati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Trattamento combinato di temozolomide (TMZ) e UMI-77 in linee cellulari XG387-Luc e XG328-Luc. (A) Titolazione singola e combinatoria di temozolomide e UMI-77 in un saggio di proliferazione in linee cellulari XG387-Luc e XG328-Luc. (B) Analisi dell'isobologramma e dell'indice di combinazione dell'inibizione della proliferazione in cellule XG387-Luc e XG328-Luc trattate con temozolomide e UMI-77. CI <1 indica un effetto sinergico. (C,D) Grafici sinergici generati da Combenefit che mostrano l'interazione tra temozolomide e UMI-77. L'analisi dell'interazione ha portato a valori HSA (high single agent) e Bliss, indicando l'efficacia sinergica calcolata dal previsto. I valori HSA e Bliss >0 indicano effetti sinergici. Ogni trattamento è stato eseguito in triplice copia con due esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Nel presente studio, è stato descritto un protocollo che può essere applicato per identificare potenziali terapie di combinazione per GBM utilizzando GSC derivate dal paziente. A differenza del modello metrico standard di sinergia / additività come i metodi Loewe, BLISS o HSA, è stato utilizzato un flusso di lavoro semplice e rapido che non richiede che una coppia di farmaci sia combinata a concentrazioni multiple in modo fattoriale completo come i metodi tradizionali. In questo flusso di lavoro, SI (indice di sensibilità) che ha avuto origine da uno studio per valutare l'effetto sensibilizzante dei siRNA in combinazione con piccoli inibitori molecolari è stato introdotto per quantificare l'effetto farmacologico sinergico di due piccoli inibitori molecolari⁷. L'intervallo di valori SI è compreso tra -1 e 1 e il valore SI positivo indica un effetto sensibilizzante tra ciascuno dei farmaci. Più alto era il valore SI raggiunto, più forte era la sinergia. Sebbene il valore SI da solo non sia in grado di fornire una risposta affermativa sul tipo (sinergico, additivo o antagonistico) di interazione farmaco-farmaco, quei candidati di alto livello hanno un'alta probabilità di sinergizzare con il farmaco di interesse e quindi sono degni di ulteriore convalida. In confronto, la maggior parte delle attuali metodologie di screening delle combinazioni di farmaci ad alto rendimento sono ancora laboriose e coinvolgono algoritmi difficili^8,9.

Per esemplificare la fattibilità di questo metodo, è stata eseguita una schermata di test su piccola scala. Di conseguenza, è stato possibile identificare UMI-77, un inibitore selettivo di MCL1, come il primo candidato tra i 20 agenti mirati a sinergizzare con temozolomide nella soppressione della crescita delle GSC. Infatti, in uno studio precedente, UMI-77 è stato anche trovato per migliorare sinergicamente l'attività anti-glioma di temozolomide nelle cellule GBM stabilite¹⁰. Nel presente studio, l'interazione sinergica tra UMI-77 e temozolomide è stata nuovamente approvata nelle GSC utilizzando il classico indice di combinazione Chou-Talalay, i metodi BLISS o HSA. Un altro vantaggio di questo protocollo è l'uso di GSC con tag luciferasi per misurare la proporzione vitale di cellule. L'attività della luciferasi delle cellule può essere facilmente misurata con l'aggiunta della luciferina, il substrato della luciferasi, e catturare la luminescenza da qualsiasi strumento con la funzione di misurazione luminometrica. Poiché la reazione luciferasi-luciferina è rapida, qui fornisce una soluzione economica e rapida rispetto ai tradizionali MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H tetrazolium), o CCK-8 (cell counting kit-8) assays, che richiedono tutti lunghi tempi di incubazione. Insieme, il protocollo presenta uno screening ad alto rendimento della potenziale combinazione di farmaci per GBM. Il protocollo fornisce anche una soluzione opzionale rapida e semplice per lo screening di combinazione di farmaci oltre ai metodi di valutazione della sinergia standard.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.