En arbeidsflyt for rask screening for å identifisere potensiell kombinasjonsterapi for GBM ved bruk av pasientavledede gliomastammeceller

Summary

Glioma stamceller (GSC) er en liten brøkdel av kreftceller som spiller viktige roller i tumorinitiering, angiogenese og legemiddelresistens i glioblastom (GBM), den mest utbredte og ødeleggende primære hjernesvulsten. Tilstedeværelsen av GSC-er gjør GBM svært ildfast for de fleste individuelle målrettede midler, så det kreves screeningmetoder med høy gjennomstrømning for å identifisere potensielle effektive kombinasjonsterapeutiske midler. Protokollen beskriver en enkel arbeidsflyt for å muliggjøre rask screening for potensiell kombinasjonsterapi med synergistisk interaksjon. De generelle trinnene i denne arbeidsflyten består i å etablere luciferase-taggede GSC-er, forberede matrigelbelagte plater, kombinere legemiddelscreening, analysere og validere resultatene.

Abstract

Glioma stamceller (GSC) er en liten brøkdel av kreftceller som spiller viktige roller i tumorinitiering, angiogenese og legemiddelresistens i glioblastom (GBM), den mest utbredte og ødeleggende primære hjernesvulsten. Tilstedeværelsen av GSC-er gjør GBM svært ildfast for de fleste individuelle målrettede midler, så det kreves screeningmetoder med høy gjennomstrømning for å identifisere potensielle effektive kombinasjonsterapeutiske midler. Protokollen beskriver en enkel arbeidsflyt for å muliggjøre rask screening for potensiell kombinasjonsterapi med synergistisk interaksjon. De generelle trinnene i denne arbeidsflyten består i å etablere luciferase-taggede GSC-er, forberede matrigelbelagte plater, kombinere legemiddelscreening, analysere og validere resultatene.

Introduction

Glioblastom (GBM) er den vanligste og aggressive typen primær hjernesvulst. For tiden er den totale overlevelsen til GBM-pasienter som fikk maksimal behandling (en kombinasjon av kirurgi, kjemoterapi og strålebehandling) fortsatt kortere enn 15 måneder; så nye og effektive terapier for GBM er presserende nødvendig.

Tilstedeværelsen av glioma stamceller (GSC) i GBM utgjør en betydelig utfordring for den konvensjonelle behandlingen, da disse stamcellene spiller pivotroller i vedlikehold av tumormikromiljø, legemiddelresistens og tumorrescurrence¹. Derfor kan målretting av GSC-er være en lovende strategi for GBM-behandling². Likevel er en stor ulempe for legemiddeleffekten i GBM dens heterogenetiske natur, inkludert, men ikke begrenset til, forskjellen i genetiske mutasjoner, blandede undertyper, epigenetisk regulering og tumormikromiljø som gjør dem svært ildfaste for behandling. Etter mange mislykkede kliniske studier innså forskere og kliniske forskere at enkeltagent målrettet terapi sannsynligvis ikke er i stand til å kontrollere utviklingen av svært heterogene kreftformer som GBM. Mens nøye utvalgte legemiddelkombinasjoner har blitt godkjent for deres effektivitet ved synergistisk å forbedre effekten av hverandre, og dermed gi en lovende løsning for GBM-behandling.

Selv om det er mange måter å evaluere legemiddelinteraksjonene i en legemiddelkombinasjon, for eksempel CI (Combination Index), HSA (Highest Single Agent) og Bliss-verdier, etc.^3,4, er disse beregningsmetodene vanligvis basert på flere konsentrasjonskombinasjoner. Faktisk kan disse metodene gi bekreftende vurdering av legemiddelinteraksjon, men kan være svært arbeidskrevende hvis de brukes i screening med høy gjennomstrømning. For å forenkle prosessen ble det utviklet en screeningarbeidsflyt for raskt å identifisere de potensielle legemiddelkombinasjonene som hemmer veksten av GSC-er fra kirurgiske biopsier av pasienten GBM. En sensitivitetsindeks (SI) som gjenspeiler forskjellen på forventet kombinert effekt og den observerte kombinerte effekten ble introdusert i denne metoden for å kvantifisere synergiserende effekten av hvert legemiddel, slik at potensielle kandidater lett kan identifiseres av SI-rangeringen. I mellomtiden demonstrerer denne protokollen et eksempelskjermbilde for å identifisere potensielle kandidater som kan synergisere anti-glioma-effekten med temozolomid, førstelinje kjemoterapi for GBM-behandling, blant 20 små molekylære hemmere.

Protocol

GBM-prøven ble anskaffet fra en pasient under en rutineoperasjon etter å ha fått fullt informert samtykke fra human forskningsetisk komité ved The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University.

1. Isolasjon og kultur av pasientavledede GSC-er

1. Legg ferskt kirurgisk resektert glioblastomvev i et 15 ml sentrifugerør fylt med steril PBS og oppbevar vevet på is inntil videre.
2. Hakk GBM-vevet i omtrent 0,5 til 1 mm diameter stykker ved hjelp av disseksjonssaks og vask vevsprøvene med nevronalt basalmedium for å fjerne cellulært rusk i et biosikkerhetsskap.
3. Fordøye vevsfragmentene med 1 mg/ml kollagenase A ved 37 °C i 30 minutter og sentrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
4. Fjern supernatanten og suspender pelletsen med blankt nevronalt basalmedium og fjern pellet mekanisk ved repeterende pipettering på is.
5. Kultur Blandingen i ultra-lav feste 6-brønns kulturplater fylt med GSC kulturmedium (se tabell 1 for oppskriften) i en steril celleinkubator med 5% CO₂ og 90% fuktighet ved 37 °C til nevrosfæren.
6. På tilstrekkelig nevrosfæredannelse, samle dem ved hjelp av en pipette i en 1,5 ml mikrotube og sentrifuge ved 800 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
7. Resuspend pellet og dele den i flere kolber fylt med det ovennevnte kulturmediet for å opprettholde de primære GSC-ene.
   MERK: Pasientavledede GSC-er som ble brukt i eksemplet, ble avledet fra kirurgiske biopsier av en 34 år gammel mannlig pasient med WHO grad IV tilbakevendende GBM. GSC-ene ble navngitt som XG387 for fremtidige eksperimenter. PCR-baserte mykoplasmatester ble utført for de ovennevnte GSC-ene for å bekrefte at det ikke finnes mykoplasmaforurensning. Alle forsøkene som involverte GSC-er som brukes i denne protokollen ble utført <15 passasjer.

2. Forbereder luciferase-merkede GSC-er

1. Samle GSC-ene fra den mellomstore kulturen og sentrifuger dem på 70 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
2. Fjern supernatanten, fordøye cellene med akkutase i 4 min ved 37 °C. Bruk en 200 μL spiss og pipette gjentatte ganger for å dissosiere og resuspendere cellepelleten.
3. Fortynn cellene til 2 x 10⁵ celler per brønn i en 12-brønns kulturplate og kultur cellene over natten.
4. Tilsett 30 μL luciferase-EGFP virus supernatant (titer >10⁸ TU /ml) i hver brønn i platen og sentrifuger deretter cellene ved 1000 x g i 2 timer ved 25 °C. Kultur cellene over natten.
5. Oppdater mediet neste dag og kultur cellene for en annen 48 h.
6. Vær oppmerksom på cellene under et blomstrende mikroskop for å bekrefte utseendet til GFP-positive celler.
7. Bruk en flytcellesortering til å sortere og velge GSC-ene med høy GFP-fluorescens for å dyrke cellene videre.

3. Bio luminescensbasert måling av celle levedyktighet

1. Beleggplater med den ekstracellulære matriseblandingen (ECM) (f.eks. matrigel): Tilsett 40 μL 0,15 mg/ml ECM-blanding til hver brønn og inkuber platen i 1 time ved 37 °C. Fjern den overflødige ECM-blandingen og skyll forsiktig en gang med PBS.
2. Legg til 100 μL kulturmedium som inneholder 15 000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000 og 500 XG387-Luc celler sammen med 100 μL blankt medium som kontroll inn i hver brønn for 6 replikerer i en 96-brønns optisk bunnplate og kultur cellene over natten ved 37 °C.
3. Fjern supernatanten, tilsett 50 μL kulturmedium som inneholder 150 ng/μL D-luciferin i hver brønn og inkuber cellene i 5 min ved 37 °C.
4. Ta bilder av den cellulære bio luminescensen i platen ved hjelp av IVIS-spektrumavbildningssystemet. Bruk den innebygde programvaren til å lage flere sirkulære områder av interesseområdet (ROI) og kvantifisere den cellulære bio-luminescensen.

4. Temozolomidbehandling og kombinasjonsscreening

1. Precoat fire 96-brønns plater som beskrevet ovenfor, før behandlingen.
2. Frø XG387-Luc celler med en tetthet på 1000 celler i 100 μL kultur medium inn i hver brønn av en 96-brønns optisk bunnplate og kultur cellene over natten.
3. Forbered temozolomid og de målrettede agentene fra lagerløsningen på forhånd. Forbered en konsentrasjonsserie bestående av 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM og 50 μM temozolomid i kulturmedium for enkeltmiddelbehandling. Fortynn temozolomid og de målrettede midlene i lagerløsning i henholdsvis kulturmediet for å oppnå endelige konsentrasjoner på henholdsvis 200 μM og 2 μM for kombinasjonsscreening av legemidler (Tabell 2).
4. Fjern kulturmediet når de fleste GSC-ene holder seg til bunnen av platene; tilsett det ovennevnte mediet som inneholder temozolomid i hver brønn for tre tekniske repliker per behandling.
5. For å behandle Temozolomid og for å screene legemiddelkombinasjonene, fjern det tomme mediet og legg til det overlagde mediet som inneholder enten 200 μM temozolomid, eller 2 μM målrettet middel, eller en kombinasjon av begge i hver brønn for tre tekniske repliker per behandling.
6. Inkuber alle plater ved 37 °C, 5 % CO2 i 3 dager.
7. Fjern det legemiddelholdige mediet, tilsett 50 μL tomt medium som inneholder 150 ng /μL D-luciferin i hver brønn og inkuber cellene i 5 min ved 37 °C.
8. Ta bilder av den cellulære bio luminescensen i platen ved hjelp av IVIS-spektrumavbildningssystemet. Bruk den innebygde programvaren til å lage flere sirkulære ROIer og kvantifisere den cellulære bio luminescensen.

5. Kombinasjonsbehandling av temozolomid og UMI-77 i cellelinjene XG387-Luc og XG328-Luc

1. Precoat tre 96-brønns plater som beskrevet ovenfor, før behandlingen.
2. Frø-XG387-Luc- og XG328-Luc-celler med en tetthet på henholdsvis 1000 celler i 100 μL kulturmedium i hver brønn av en 96-brønns optisk bunnplate og kultur cellene over natten.
3. Forbered en konsentrasjonsserie bestående av 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM og 0 μM temozolomid og en konsentrasjonsserie bestående av 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM og 0 μM UMI-77 i kulturmediet for seks x seks dosetitreringsmatrisebehandlinger.
4. Fjern det tomme mediet når de fleste GSC-ene fester seg til bunnen av platen; legg det ovennevnte mediet inn i hver brønn for tre tekniske repliker per behandling.
5. Inkuber disse platene i 3 dager ved 37 °C, 5 % CO₂.
6. Fjern det stoffholdige mediet; tilsett 50 μL blankt medium som inneholder 150 ng/μL D-luciferin i hver brønn og inkuber cellene i 5 min ved 37 °C for bioluminescensmåling.

6. Dataanalyse

1. Beregn følsomhetsindeksen (SI) for temozolomid og målrettet middel i henhold til formelen i figur 2A.
   MERK: SI-poengsummen er å kvantifisere påvirkningen av tilsetningen av et annet stoff. Den varierte fra -1 til +1, med positive verdier som indikerer temozolomide synergistiske effekter.
2. Beregn kombinasjonsindeksverdiene (CI) mellom temozolomid og UMI-77 ved hjelp av CompuSyn-programvare for å analysere deres kombinerte interaksjoner. CI-verdien <1 indikerer synergi; CI-verdien >1 angir antagonisme.
3. Beregn de høye enkeltagentverdiene (HSA) mellom temozolomid og UMI-77 ved hjelp av Combenefit-programvaren. HSA-verdien indikerer den kombinerte hemmende effekten. HSA-verdien >0 indikerer synergi og HSA-verdien <0 indikerer antagonisme.

Representative Results

XG387-cellene dannet nevrosfærer i kulturmediet beskrevet i tabell 1 i en ultra-lav feste 6-brønns kulturplate eller en ikke-belagt plate⁵ (Figur 1A). Først ble det utført en test for å sjekke om bio-luminescensintensiteten fra XG387-Luc-celler var proporsjonal med cellenummeret. Som vist i figur 1Bøkte bio-luminescensintensiteten proporsjonalt med celletettheten og resulterte i en lineær korreksjon mellom dem (Pearson r = 0,9872; p < 0,0001; Figur 1C). Siden bio luminescensen til luciferase taggede celler er enkel og rask å måle, gir dette en enkel metode for å måle tettheten til levedyktige GSC-er. Deretter ble den anti-proliferative aktiviteten til temozolomid vurdert. Som vist i figur 1Dforårsaket 400 μM temozolomid omtrent 20% proliferatjonsinhibering av XG387-Luc-celler, noe som tyder på at det er nyttig, men anti-GBM-effekten kan forbedres ytterligere. Konsentrasjonen på 200 μM ble valgt for kombinasjonsscreeningen.

For å gi et eksempel ble 20 mål-selektive små molekylhemmere brukt til legemiddelkombinasjonsscreening for å identifisere potensielle kandidater som forbedrer anti-GBM-effekten av temozolomid. Som et resultat var de sensitive indeksverdiene (SI) til 13 målrettede agenter over 0, og 5 av dem var over 0,1 (Figur 2B,C). Spesielt var SI for de to beste kandidatmedisinene UMI-77 og A 83-01 høyere enn 0,25, noe som tyder på deres potensial til å synergisere med temozolomid.

For å validere det ovennevnte funnet ble de klassiske synergimodellene til HSA og Bliss^3,4,6 brukt for å bestemme den kombinerte effekten av temozolomid og UMI-77 i GSC-er. I tillegg ble XG328-en annen pasientavledet GSC-modell etablert tidlig brukt til å utføre den samme evalueringen. Anti-proliferativ analyse av kombinert behandling av temozolomid og UMI-77 ble utført i en seks-seks dosetitreringsmatrise. Resultatene ble analysert for å skaffe seg HSA- og Bliss-verdiene som er avlesninger for synergistisk hemming og skildrer forskjellen mellom forventet hemming og observert hemming. Som vist i figur 3B-D,foreslår kombinasjonsindeksverdiene (CI) <1 og de høye enkeltagentverdiene (HSA) >0 for de fleste kombinasjoner av temozolomid og UMI-77 ved forskjellige konsentrasjoner, en samlet synergistisk interaksjon mellom temozolomid og UMI-77 i både XG387 og XG328 GSC.

Figur 1: GBM pasientavledede GSC XG387. (A) Neurosphere formasjon. (B) Bio-luminescensgenerering av luciferase-kodede GSC-er(C) Bio-luminescens generert av XG387-Luc-celler var proporsjonal med celletettheten. (D) Temozolomidbehandling av XG387. Hver behandling ble utført i triplikat med to uavhengige eksperimenter. Dataene uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Legemiddelkombinasjonsscreening ved hjelp av GSC( A) Formelen for å beregne SI (sensitivitetsindeksen) til 20 målrettede midler med temozolomid (TMZ) i kombinasjonsskjermen. (B) Fordelingen av SI-verdier for 20 målrettede agenter. Røde prikker: de fem beste kandidatmedisinene. (C) Informasjon om de fem beste kandidatrettede agentene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Kombinasjonsbehandling av temozolomid (TMZ) og UMI-77 i cellelinjene XG387-Luc og XG328-Luc. (A) Enkel og kombinatorisk titrering av temozolomid og UMI-77 i en spredningsanalyse i cellelinjene XG387-Luc og XG328-Luc. (B) Isobologram- og kombinasjonsindeksanalyse av spredningshemmingen i XG387-Luc- og XG328-Luc-celler behandlet med temozolomid og UMI-77. CI <1 indikerer en synergistisk effekt. (C,D) Synergiplott generert av Combenefit viser samspillet mellom temozolomid og UMI-77. Analyse av interaksjon resulterte i HSA-verdier (høy enkeltmiddel) og Bliss-verdier, noe som indikerer synergistisk effekt som beregnet fra forventet. HSA- og Bliss-verdier >0 indikerer synergistiske effekter. Hver behandling ble utført i triplikat med to uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

I den nåværende studien ble det beskrevet en protokoll som kan anvendes for å identifisere potensiell kombinasjonsterapi for GBM ved hjelp av pasientavledede GSC-er. I motsetning til standard synergy/additivity metrisk modell som Loewe, BLISS eller HSA metoder, ble det brukt en enkel og rask arbeidsflyt som ikke krever at et legemiddelpar kombineres ved flere konsentrasjoner på en full factorial måte som de tradisjonelle metodene. I denne arbeidsflyten ble SI (sensitivitetsindeks) som stammer fra en studie for å evaluere den sensibiliserende effekten av siRNAer i kombinasjon med liten molekylær hemmer introdusert for å kvantifisere den synergistiske legemiddeleffekten av to små molekylære hemmere⁷. Området for SI-verdier er fra -1 til 1, og den positive SI-verdien indikerer en sensibiliserende effekt mellom hvert av legemidlene. Jo høyere SI-verdien som ble oppnådd, jo sterkere var synergien. Selv om SI-verdien alene ikke er i stand til å gi et bekreftende svar om typen (synergistisk, additiv eller antagonistisk) av legemiddelinteraksjon, har de topprangerte kandidatene stor sannsynlighet for å synergisere med stoffet av interesse og er derfor verdig ytterligere validering. Til sammenligning er de fleste av de nåværende high-throughput narkotika kombinasjon screening metoder fortsatt arbeidskrevende og involverer vanskelige algoritmer^8,9.

For å eksemplifisere gjennomførbarheten av denne metoden, ble det utført en liten testskjerm. Som et resultat var det mulig å identifisere UMI-77, en selektiv MCL1-hemmer, som toppkandidat blant 20 målrettede agenter for å synergisere med temozolomid i GSC-vekstundertrykking. Faktisk, i en tidligere studie, UMI-77 ble også funnet å synergistisk forbedre anti-glioma aktivitet av temozolomid i etablerte GBM celler¹⁰. I den nåværende studien ble det synergistiske samspillet mellom UMI-77 og temozolomid godkjent igjen i GSC ved hjelp av den klassiske Chou-Talalay-kombinasjonsindeksen, BLISS- eller HSA-metodene. En annen fordel med denne protokollen er bruken av luciferase-taggede GSC-er for å måle den levedyktige andelen celler. Luciferaseaktiviteten til celler kan enkelt måles ved tilsetning av luciferin, substratet av luciferase, og fange luminescensen av ethvert instrument med funksjonen til luminometrisk måling. Fordi luciferase-luciferin-reaksjonen er rask, gir den heri en billig og rask løsning i forhold til tradisjonell MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), MTS(3-(24,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-karboksymetoksyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H tetrazolium), eller CCK-8 (celletellingssett-8) analyser, alt dette krever lange inkubasjonstider. Sammen presenterer protokollen en høy gjennomstrømningsscreening av potensiell legemiddelkombinasjon for GBM. Protokollen gir også valgfri rask og enkel løsning for legemiddelkombinasjonsskjerm i tillegg til standard synergy evalueringsmetoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Table 1. The formulation of GSC complete culture medium.
ABT-737	MCE		Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 inhibitor
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor
AZD5991	MCE		Mcl-1 inhibitor
A 83-01	MCE		Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Potent MNK1 inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family
Masitinib	MCE		Inhibitor of c-Kit
ML141	Selleck		Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selective CDK4 and CDK6 inhibitor
SB 202190	MCE		Selective p38 MAP kinase inhibitor
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin inhibitor
TCS 359	Selleck		Potent FLT3 inhibitor
UMI-77	MCE		Selective Mcl-1 inhibitor
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selective estrogen receptor (ER) modulator
Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table.