Summary
神経膠腫幹細胞(GSC)は、最も流行し、壊滅的な原発性脳腫瘍である神経膠芽腫(GBM)における腫瘍開始、血管新生、薬剤耐性に不可欠な役割を果たす癌細胞のごく一部である。GSCの存在は、GBMを個々の標的剤のほとんどに非常に難治性にするため、潜在的な有効な組み合わせ治療薬を同定するためにハイスループットスクリーニング方法が必要です。プロトコルは、相乗的相互作用と潜在的な併用療法のための迅速なスクリーニングを可能にする簡単なワークフローを記述します。このワークフローの一般的なステップは、ルシメラーゼタグ付きGSCの確立、マトリゲルコーティングされたプレートの調製、併用薬物スクリーニング、分析、および結果の検証を行う。
Abstract
神経膠腫幹細胞(GSC)は、最も流行し、壊滅的な原発性脳腫瘍である神経膠芽腫(GBM)における腫瘍開始、血管新生、薬剤耐性に不可欠な役割を果たす癌細胞のごく一部である。GSCの存在は、GBMを個々の標的剤のほとんどに非常に難治性にするため、潜在的な有効な組み合わせ治療薬を同定するためにハイスループットスクリーニング方法が必要です。プロトコルは、相乗的相互作用と潜在的な併用療法のための迅速なスクリーニングを可能にする簡単なワークフローを記述します。このワークフローの一般的なステップは、ルシメラーゼタグ付きGSCの確立、マトリゲルコーティングされたプレートの調製、併用薬物スクリーニング、分析、および結果の検証を行う。
Introduction
神経膠芽腫(GBM)は、最も一般的で積極的なタイプの原発性脳腫瘍である。現在、最大治療(手術、化学療法、放射線療法の組み合わせ)を受けたGBM患者の全体的な生存期間は、まだ15ヶ月よりも短い。したがって、GBMのための新しく効果的な治療法が緊急に必要です。
GBMにおけるグリオーマ幹細胞(GSC)の存在は、これらのステム様細胞が腫瘍微小環境、薬剤耐性、および腫瘍再発1の維持においてピボット役割を果たすため、従来の治療に対してかなりの課題を構成している。したがって、GSCをターゲットにすることは、GBM治療2の有望な戦略である可能性があります。しかし、GBMにおける薬物有効性の大きな欠点は、遺伝子変異、混合サブタイプ、エピジェネティック調節、腫瘍微小環境の違いを含むがこれらに限定されない異遺伝学的性質であり、治療のために非常に難治性となる。多くの臨床試験に失敗した後、科学者や臨床研究者は、単剤標的療法はおそらくGBMのような非常に異質な癌の進行を完全に制御することができないことに気づいた。一方、慎重に選択された薬物の組み合わせは、互いの効果を相乗的に増強することによってその有効性が承認されており、GBM治療のための有望な解決策を提供する。
CI(組合せ指数)、HSA(最高単一剤)、ブリス値など、薬物の組み合わせの薬物相互作用を評価する方法は多いが、これらの計算方法は通常、複数の濃度の組み合わせに基づいている。実際、これらの方法は、薬物と薬物相互作用の肯定的な評価を提供することができますが、ハイスループットスクリーニングに適用される場合、非常に面倒なことができます。このプロセスを簡素化するために、患者GBMの外科的生検に由来するGSCの成長を阻害する潜在的な薬物組み合わせを迅速に同定するためのスクリーニングワークフローが開発された。各薬剤の相乗効果を定量化するために、期待される組み合わせ効果と観測された組み合わせ効果の差を反映した感度指数(SI)をこの方法に導入し、SIランキングで候補を容易に特定することができます。一方、このプロトコルは、20の小分子阻害剤の中で、GBM治療のための第一線化学療法であるテモゾロミドと抗グリオーマ効果を相乗効果できる潜在的な候補を特定するスクリーンの例を示しています。
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Protocol
GBM検体は、南京医科大学第一付属病院の人間研究倫理委員会による完全なインフォームド・コンセントを得た後、定期的な手術中に患者から取得した。
1. 患者由来GSCの分離と培養
- 無菌PBSで満たされた15 mL遠心分離管に新鮮な外科的に切除された神経膠芽腫組織を入れ、さらに手術するまで氷の上に組織を保管する。
- 脱解はさみを使用して約0.5〜1mmの直径の部分にGBM組織をミンチし、生体安全キャビネット内の細胞の破片を除去するために神経基底媒体で組織標本を洗浄する。
- 37°Cで1mg/mLコラゲターゼAで組織断片を消化し、遠心分離機を400xgで4°Cで5分間消化します。
- 上清を取り除き、白紙の神経基底培地でペレットを懸濁し、氷の上で繰り返しピペットを入れてペレットを機械的に解化します。
- GSC培養培地を充填した超低結合6ウェル培養プレート(レシピについては表1)で、5%CO2と湿度90%の37°Cで、神経圏形成まで培養する。
- 十分な神経球形成では、1.5 mLマイクロチューブ内のピペットを使用し、室温で5分間800 x g の遠心分離機を使用して収集します。
- ペレットを再懸濁し、一次GSCを維持するために上記の培地で満たされたいくつかのフラスコに分割する。
注:例で使用される患者由来のGSCは、WHOグレードIV再発GBMを有する34歳の男性患者の外科的生検に由来した。GSCは、将来の実験のためにXG387と命名されました。上記のGSCに対してPCRベースのマイコプラズマ試験を実施し、マイコプラズマ汚染がないことを確認した。このプロトコルで使用されるGSCを含むすべての実験は、15個のパッセージ<行った。
2. ルシメラーゼタグ付きGSCの準備
- 培地培養からGSCを回収し、室温で3分間70 x g で遠心分離します。
- 上清を取り除き、37°Cで4分間アキュターゼで細胞を消化する。 200 μL のチップとピペットを繰り返し使用して、細胞ペレットの解約と再中断を行います。
- 12ウェル培養プレートでウェル当たり2 x 105細胞 に希釈し、細胞を一晩培養する。
- プレート内の各ウェルに30 μLルシメラーゼ-EGFPウイルス上清(力素>108 TU /mL)を加え、25°Cで2時間1,000 x g の細胞を遠心分離します。 細胞を一晩培養する。
- 翌日培地をリフレッシュし、さらに48時間培養します。
- GFP陽性細胞の外観を確認するために、フローレス顕微鏡下で細胞を観察します。
- フローセルソーターを使用して、GFP蛍光が高いGSCを選別して選択し、細胞をさらに培養します。
3. 細胞生存率のバイオ・ルミネッセンスベースの測定
- 細胞外マトリックス(ECM)混合物を含むコーティングプレート(例えば、マトリゲル):各ウェルに0.15mg/mL ECM混合物の40 μLを加え、37°Cで1時間プレートをインキュベートします。 余分なECM混合物を取り除き、PBSで一度穏やかにすすいだ。
- 15,000、10,000、8,000、6,000、4,000、2,000、1,000、および500 XG387-Luc細胞を含む100 μL培養培地を100 μLのブランク培地と共に加え、それぞれ6回のウェル底プレート培養で6回の複製を行います。
- 上清を取り除き、150 ng/μL D-ルシフェリンを含む50μLの培地を各ウェルに加え、37°Cで5分間培養します。
- IVISスペクトルイメージングシステムを使用して、プレート内の細胞のバイオ発光の画像を撮ります。内蔵のソフトウェアを使用して、対象領域(ROI)の複数の円形領域を作成し、細胞のバイオ発光を定量化します。
4. テモゾロミド治療と併用スクリーニング
- 処理前に、上記の4つの96ウェルプレートをプレコートする。
- XG387-Luc細胞を100μL培養培地中の1,000個の細胞の密度で96ウェルの光学底板の各ウェルに入れ、細胞を一晩培養します。
- テモゾロミドと対象薬剤をストック溶液から事前に準備します。800 μM、600 μM、400 μM、300 μM、200 μM、100 μM、および 50 μM のテモゾロミドを単剤処理用培地に濃縮シリーズを用意します。培養液中のセストック溶液中のテモゾロミドと標的剤を希釈し、それぞれ、併用薬物スクリーニング用に200μMおよび2μMの最終濃度を得た(表2)。
- ほとんどのGSCがプレートの底に付着したら、培養培地を取り除きます。テモゾロミドを含む上記の調製された培地を各井戸に加え、治療ごとに3回の技術的複製を行います。
- テモゾロミドを治療し、薬物の組み合わせをスクリーニングするには、ブランク培地を除去し、200 μMテモゾロミド、または2μM標的剤、または各ウェルに両方の組み合わせを含む上記の調製培地を追加して、1回の治療につき3回の技術的複製を行います。
- 37°C、5%のCO2で3日間、すべてのプレートをインキュベートします。
- 薬物含有培地を取り出し、150ng/μL D-ルシフェリンを含む50μLのブランク培地を各ウェルに加え、37°Cで5分間培養します。
- IVISスペクトルイメージングシステムを使用して、プレート内の細胞のバイオ発光の画像を撮ります。内蔵のソフトウェアを使用して、複数の円形ROIを作成し、細胞のバイオ発光を定量化します。
5. XG387-LucおよびXG328-Luc細胞株におけるテモゾロミドとUMI-77の併用処理
- 上記のとおり、治療前に3つの96ウェルプレートをプレコートする。
- 種子XG387-LucおよびXG328-Luc細胞は、それぞれ100μLの培養培地中の密度1,000個の細胞を96ウェルの光学底板の各ウェルに入れ、細胞を一晩培養した。
- 600 μMから構成される濃度シリーズを準備し、 400 μM、300 μM、200 μM、100 μM、50 μM、および0 μMのテモゾロミドと、6 μM、4 μM、3 μM、2 μM、1 μM、0.5 μM、および0 μMの培地で構成される濃度シリーズ
- ほとんどのGSCがプレートの底部に付着している場合は、ブランクメディアを取り外します。治療ごとに3つの技術的な複製のために各井戸に上記の準備された媒体を追加します。
- これらのプレートを37°C、5%CO2で3日間インキュベートします。
- 薬物含有培地を除去する;150 ng/μL D-ルシフェリンを含む50μLのブランク培地を各ウェルに加え、37°Cで5分間細胞をインキュベートして生物発光測定を行います。
6. データ分析
- 図2Aの式に従って、テモゾロミドおよび標的剤の感度指数(SI)スコアを計算する。
注:SIスコアは、別の薬物の添加の影響を定量化することです。それは-1から+1の範囲で、正の値はテモゾロミド相乗効果を示した。 - CompuSynソフトウェアを使用してテモゾロミドとUMI-77の間の組み合わせインデックス(CI)値を計算し、それらの組み合わせ相互作用を分析します。CI 値 <1 は相乗効果を示します。CI 値 >1 は拮抗を示します。
- Combenefitソフトウェアを使用して、テモゾロミドとUMI-77の間の高い単一エージェント(HSA)値を計算します。HSA値は、組み合わせた阻害効果を示す。HSA値>0は相乗効果を示し、HSA値<0は拮抗を示す。
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Representative Results
XG387細胞は、超低添付着6-ウェル培養板または非被覆板5で表1に記載の培養培地に神経球を形成した(図1A)。まず、XG387-Luc細胞からのバイオ発光強度が細胞数に比例したかどうかを確認する試験を行った。図1Bに示すように、生物発光強度は細胞密度に比例して増加し、それらの間に線形補正をもたらした(Pearson r = 0.9872;p < 0.0001;図1C)。ルシファーゼタグ付き細胞の生体発光は測定が容易かつ迅速であるため、これは、実行可能なGSCの密度を測定する簡単な方法を提供します。次に、テモゾロミドの抗増殖活性を評価した。図1Dに示すように、400μMのテモゾロミドはXG387-Luc細胞の約20%増殖阻害を引き起こし、有用であるが、その抗GBM効果はさらに改善され得る。組み合わせスクリーニングに200μMの濃度を選択した。
例を挙げるには、20の標的選択的低分子阻害剤を、テモゾロミドの抗GBM効果を増強する候補を同定するために、薬物併用スクリーニングに利用した。その結果、13の標的エージェントのセンシティブインデックス(SI)値は0を超え、そのうち5個は0.1を超えていた(図2B,C)。特に、上位2種の候補薬UMI-77およびA83-01のSIは0.25より高く、テモゾロミドと相乗する可能性を示唆した。
上記の発見を検証するために、HSAとBliss3、4、6の古典的な相乗モデルを適用し、GSCにおけるテモゾロミドとUMI-77の組み合わせ効果を決定した。また、早期に確立された別の患者由来GSCモデルを用い、同じ評価を行った。テモゾロミドとUMI-77の併用処理の抗増殖アッセイは、6対6回の用量滴定マトリックスで行った。結果を分析し、相乗的阻害のための読み出しであるHSA値とBliss値を取得し、予想される阻害と観察された阻害の差を描写した。図3B-Dに示すように、組み合わせ指数(CI)値<1と高単一薬剤(HSA)値は、異なる濃度でのテモゾロミドとUMI-77の組み合わせの大部分で>0、XG387およびXG328GSCsの両方におけるテモゾロミドとUMI-77の全体的な相乗相互作用を示唆している。
図1:GBM患者由来GSCs XG387. (A) 神経球形成(B)GCSをタグ付きルシパラーゼのバイオ発光生成(C)XG387-Luc細胞により生成したバイオルミネッセンスは、細胞密度に比例した。(D) XG387のテモゾロミド処理各処置は、2つの独立した実験で三重で行った。データはSDの平均±として表されます。
図2:GSCを用いた薬剤併用スクリーニング(A)組み合わせ画面におけるテモゾロミド(TMZ)を有する20の標的剤のSI(感受性指数)を算出する式。(B) 対象となるエージェント 20 個の SI 値の分布。赤い点:トップ5候補薬。(C)上位5人のターゲットエージェントの情報。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:XG387-LucおよびXG328-Luc細胞株におけるテモゾロミド(TMZ)とUMI-77の併用処理(A)XG387-LucおよびXG328-Luc細胞株における増殖アッセイにおけるテモゾロミドおよびUMI-77の単一および組み合わせ滴定(B)イソボログラムおよびXG387-LucおよびXG328-Luc細胞における増殖阻害の組み合わせ指標分析を、テモゾロミドおよびUMI-77で処理した。CI <1は相乗効果を示す。(C,D)テモゾロミドとUMI-77の相互作用を示すコンベネフィットによって生成された相乗効果プロット。相互作用の分析は、HSA(高単剤)値およびBliss値をもたらし、予想から計算された相乗効果を示す。HSA と Bliss 値 >0 は相乗効果を示します。各処置は、2つの独立した実験で三重で行った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、患者由来のGSCを用いたGBMの潜在的な併用療法を同定するために適用できるプロトコルについて説明した。Loewe、BLISS、HSAの方法などの標準的な相乗効果/加算率メトリックモデルとは異なり、従来の方法として完全な要因論的方法で複数の濃度で組み合わせる薬物ペアを必要としないシンプルで迅速なワークフローが使用されました。本ワークフローにおいて、siRNAの感作効果を小分子阻害剤と組み合わせて評価する研究から生じたSI(感度指標)は、2つの小分子阻害剤の相乗効果を定量化するために導入された。SI値の範囲は-1~1で、陽性のSI値は各薬剤間の感作効果を示す。SI値が高いほど、相乗効果は強くなります。SI値だけでは、薬物と薬物相互作用の種類(相乗的、添加剤、または拮抗的)に関する肯定的な答えを提供することができないが、それらのトップランクの候補者は関心のある薬物と相乗する可能性が高く、したがってさらなる検証に値する。それに比べて、現在のハイスループット薬物併用スクリーニング方法論のほとんどは依然として面倒であり、難しいアルゴリズム8,9を伴う。
この方法の実現可能性を例示するために、小規模なテスト画面を実施した。その結果、選択的MCL1阻害剤であるUMI-77を、GSC増殖抑制においてテモゾロミドと相乗する20の標的剤の中で最有力候補として同定することが可能となった。実際、以前の研究では、UMI-77は、確立されたGBM細胞10におけるテモゾロミドの抗グリオーマ活性を相乗的に増強することも発見された。現在の研究では、UMI-77とテモゾロミドの相乗的相互作用が、古典的なチョウタラレー組み合わせ指数、BLISSまたはHSA法を用いてGSCで再び承認された。このプロトコルのもう一つの利点は、細胞の生存可能な割合を測定するためのルシファーゼタグ付きGSCの使用である。細胞のルシフェラーゼ活性は、ルシフェリン、ルシファーゼの基質の添加により容易に測定することができ、そして、ルミノメトリック測定の機能を有する任意の器具によって発光を捕捉する。ルシフラーゼ-ルシフェリン反応は速いため、従来のMTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-yl)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化)、MTS(3-3-) (4,5-ジメチルチアゾール-2-yl)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2Hテトラゾリウム)、またはCCK-8(細胞計数キット-8)アッセイ、 そのすべては、長いインキュベーション時間を必要とします。このプロトコルは、GBMの潜在的な薬剤の組み合わせのハイスループットスクリーニングを提示します。このプロトコルは、標準的な相乗効果評価方法に加えて、薬物の組み合わせ画面に対するオプションの迅速かつ簡単なソリューションも提供します。
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Disclosures
著者らは、開示する矛盾を宣言しない。
Acknowledgments
中国国立自然科学財団(81672962)、江蘇省イノベーションチームプログラム財団、東南大学と南京医科大学の共同キープロジェクト財団の支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 50X |
| EGF | Gibco | PHG0313 | 20 ng/ml |
| FGF | Gibco | PHG0263 | 20 ng/ml |
| Gluta Max | Gibco | 35050061 | 100X |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | 1X |
| Penicillin-Streptomycin | HyClone | SV30010 | P: 10,000 units/ml S: 10,000 ug/ml |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 2088876 | 100 mM |
| Table 1. The formulation of GSC complete culture medium. | |||
| ABT-737 | MCE | Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor | |
| Adavosertib (MK-1775) | MCE | Wee1 inhibitor | |
| Axitinib | MCE | Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor | |
| AZD5991 | MCE | Mcl-1 inhibitor | |
| A 83-01 | MCE | Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase | |
| CGP57380 | Selleck | Potent MNK1 inhibitor | |
| Dactolisib (BEZ235) | Selleck | Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor | |
| Dasatinib | MCE | Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor | |
| Erlotinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Gefitinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Linifanib | MCE | Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family | |
| Masitinib | MCE | Inhibitor of c-Kit | |
| ML141 | Selleck | Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase | |
| OSI-930 | MCE | Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R | |
| Palbociclib | MCE | Selective CDK4 and CDK6 inhibitor | |
| SB 202190 | MCE | Selective p38 MAP kinase inhibitor | |
| Sepantronium bromide (YM-155) | MCE | Survivin inhibitor | |
| TCS 359 | Selleck | Potent FLT3 inhibitor | |
| UMI-77 | MCE | Selective Mcl-1 inhibitor | |
| 4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene) | Selleck | Selective estrogen receptor (ER) modulator | |
| Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table. |
References
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