Summary
Die Gliomstammzellen (GSCs) sind ein kleiner Teil der Krebszellen, die eine wesentliche Rolle bei der Tumorinitiierung, Angiogenese und Arzneimittelresistenz beim Glioblastom (GBM), dem häufigsten und verheerendsten primären Hirntumor, spielen. Das Vorhandensein von GSCs macht das GBM sehr refraktär gegenüber den meisten einzelnen Zielerregern, so dass Hochdurchsatz-Screening-Methoden erforderlich sind, um potenziell wirksame Kombinationstherapeutika zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt einen einfachen Workflow, um ein schnelles Screening auf eine mögliche Kombinationstherapie mit synergistischer Interaktion zu ermöglichen. Die allgemeinen Schritte dieses Workflows bestehen aus der Einrichtung von Mit Luciferase markierten GSCs, der Vorbereitung von matrigelbeschichteten Platten, dem Kombinations-Drug-Screening, der Analyse und Validierung der Ergebnisse.
Abstract
Die Gliomstammzellen (GSCs) sind ein kleiner Teil der Krebszellen, die eine wesentliche Rolle bei der Tumorinitiierung, Angiogenese und Arzneimittelresistenz beim Glioblastom (GBM), dem häufigsten und verheerendsten primären Hirntumor, spielen. Das Vorhandensein von GSCs macht das GBM sehr refraktär gegenüber den meisten einzelnen Zielerregern, so dass Hochdurchsatz-Screening-Methoden erforderlich sind, um potenziell wirksame Kombinationstherapeutika zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt einen einfachen Workflow, um ein schnelles Screening auf eine mögliche Kombinationstherapie mit synergistischer Interaktion zu ermöglichen. Die allgemeinen Schritte dieses Workflows bestehen aus der Einrichtung von Mit Luciferase markierten GSCs, der Vorbereitung von matrigelbeschichteten Platten, dem Kombinations-Drug-Screening, der Analyse und Validierung der Ergebnisse.
Introduction
Das Glioblastom (GBM) ist die häufigste und aggressivste Art von primärem Hirntumor. Derzeit ist das Gesamtüberleben von GBM-Patienten, die eine maximale Behandlung (eine Kombination aus Operation, Chemotherapie und Strahlentherapie) erhalten haben, immer noch kürzer als 15 Monate; daher sind neuartige und wirksame Therapien für GBM dringend erforderlich.
Das Vorhandensein von Gliomstammzellen (GSCs) in GBM stellt eine erhebliche Herausforderung für die konventionelle Behandlung dar, da diese stammähnlichen Zellen eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Tumormikroumgebung, der Arzneimittelresistenz und des Tumorrezidials spielen1. Daher könnte die Ausrichtung auf GSCs eine vielversprechende Strategie für die GBM-Behandlungsein 2. Ein großer Nachteil für die Wirksamkeit des Medikaments bei GBM ist jedoch seine heterogene Natur, einschließlich, aber nicht beschränkt auf den Unterschied in genetischen Mutationen, gemischten Subtypen, epigenetischer Regulation und Tumormikroumgebung, was sie für die Behandlung sehr refraktär macht. Nach vielen gescheiterten klinischen Studien erkannten Wissenschaftler und klinische Forscher, dass eine zielgerichtete Einzelwirkstofftherapie wahrscheinlich nicht in der Lage ist, das Fortschreiten von hochgradig heterogenen Krebsarten wie GBM vollständig zu kontrollieren. Während sorgfältig ausgewählte Arzneimittelkombinationen für ihre Wirksamkeit zugelassen wurden, indem sie synergistisch die Wirkung voneinander verstärken und somit eine vielversprechende Lösung für die GBM-Behandlung bieten.
Obwohl es viele Möglichkeiten gibt, die Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen einer Arzneimittelkombination zu bewerten, wie z. B. CI (Combination Index), HSA (Highest Single Agent) und Bliss-Werte usw.3,4, basieren diese Berechnungsmethoden in der Regel auf mehreren Konzentrationskombinationen. In der Tat können diese Methoden eine positive Bewertung der Wechselwirkung zwischen Arzneimitteln ermöglichen, können jedoch sehr mühsam sein, wenn sie im Hochdurchsatz-Screening angewendet werden. Um den Prozess zu vereinfachen, wurde ein Screening-Workflow zur schnellen Identifizierung der potenziellen Arzneimittelkombinationen, die das Wachstum von GSCs hemmen, aus chirurgischen Biopsien von Patienten-GBM entwickelt. Ein Sensitivitätsindex (SI), der die Differenz zwischen der erwarteten kombinierten Wirkung und der beobachteten kombinierten Wirkung widerspiegelt, wurde in diese Methode eingeführt, um die synergisierende Wirkung jedes Arzneimittels zu quantifizieren, so dass die potenziellen Kandidaten leicht durch das SI-Ranking identifiziert werden können. In der Zwischenzeit zeigt dieses Protokoll ein Beispiel-Screening, um die potenziellen Kandidaten zu identifizieren, die den Anti-Gliom-Effekt mit Temozolomid, der Erstlinien-Chemotherapie für die GBM-Behandlung, unter 20 kleinen molekularen Inhibitoren synergisieren können.
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Protocol
Die GBM-Probe wurde von einem Patienten während einer Routineoperation erworben, nachdem die Ethikkommission für humane Forschung des ersten angeschlossenen Krankenhauses der Nanjing Medical University die Zustimmung vollständig informiert erhalten hatte.
1. Isolierung und Kultur von patientenbasierten GSCs
- Legen Sie frisches chirurgisch reseziertes Glioblastomgewebe in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, das mit sterilem PBS gefüllt ist, und lagern Sie das Gewebe bis zur weiteren Operation auf Eis.
- Das GBM-Gewebe mit einer Dissektionsschere in Stücke mit einem Durchmesser von etwa 0,5 bis 1 mm zerlegen und die Gewebeproben mit neuronalem Basalmedium waschen, um Zelltrümmer in einer Biosicherheitswerkbank zu entfernen.
- Verdauen Sie die Gewebefragmente mit 1 mg/ml Kollagenase A bei 37 °C für 30 min und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet mit leerem neuronalem Basalmedium und dissoziieren Sie das Pellet mechanisch durch wiederholtes Pipettieren auf Eis.
- Die Mischung wird in mit GSC-Kulturmedium gefüllten 6-Well-Kulturplatten mit ultra-niedrigem Aufsatz (siehe Rezeptur Tabelle 1) in einem sterilen Zellinkubator mit 5% CO2 und 90% Luftfeuchtigkeit bei 37 °C bis zur Neurosphärenbildung kultiviert.
- Bei ausreichender Neurosphärenbildung mit einer Pipette in einer 1,5 ml Mikroröhrchen und Zentrifuge bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur sammeln.
- Das Pellet wird wieder aufgewählt und in mehrere Kolben aufgeteilt, die mit dem oben genannten Kulturmedium gefüllt sind, um die primären GSCs zu erhalten.
HINWEIS: Die im Beispiel verwendeten patientenbezogenen GSCs wurden aus chirurgischen Biopsien eines 34-jährigen männlichen Patienten mit rezidivierendem GBM des WHO-Grades IV abgeleitet. Die GSCs wurden für die zukünftigen Experimente als XG387 bezeichnet. PcR-basierte Mykoplasmentests wurden für die oben genannten GSCs durchgeführt, um zu bestätigen, dass keine Mykoplasmenkontamination vorliegt. Alle in diesem Protokoll verwendeten Experimente mit GSCs wurden <15 Passagen durchgeführt.
2. Vorbereitung von Luciferase-getaggten GSCs
- Sammeln Sie die GSCs aus der Mediumkultur und zentrifugieren Sie sie bei 70 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand, verdauen Sie die Zellen mit Accutase für 4 min bei 37 °C. Verwenden Sie eine 200 μL-Spitze und pipetetten Sie wiederholt, um das Zellpellet zu dissoziieren und wieder aufzulösen.
- Verdünnen Sie die Zellen auf 2 x 105 Zellen pro Vertiefung in einer 12-Well-Kulturplatte und kultivieren Sie die Zellen über Nacht.
- 30 μL Luciferase-EGFP-Virusüberstand (Titer >108 TU /ml) in jede Vertiefung in der Platte geben und dann die Zellen bei 1.000 x g für 2 h bei 25 °C zentrifugieren. Kulturieren Sie die Zellen über Nacht.
- Erfrischen Sie das Medium am nächsten Tag und kulturieren Sie die Zellen für weitere 48 h.
- Beobachten Sie die Zellen unter einem floreszierenden Mikroskop, um das Auftreten der GFP-positiven Zellen zu bestätigen.
- Verwenden Sie einen Flusszellensortierer, um die GSCs mit hoher GFP-Fluoreszenz zu sortieren und auszuwählen, um die Zellen weiter zu kulturieren.
3. Biolumineszenz-basierte Messung der Zelllebensfähigkeit
- Beschichtungsplatten mit der extrazellulären Matrixmischung (ECM) (z. B. Matrigel): Fügen Sie 40 μL 0,15 mg/ ml ECM-Mischung zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37 °C. Entfernen Sie die überschüssige ECM-Mischung und spülen Sie sie vorsichtig einmal mit PBS ab.
- Fügen Sie 100 μL Kulturmedium mit 15.000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000 und 500 XG387-Luc-Zellen zusammen mit 100 μL-Leermedium als Kontrolle in jede Vertiefung für 6 Replikate in einer optischen Bodenplatte mit 96 Wellen hinzu und kulturieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C.
- Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 50 μL Kulturmedium mit 150 ng/μL D-Luciferin in jede Vertiefung ein und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 °C.
- Nehmen Sie Bilder der zellulären Biolumineszenz in der Platte mit dem IVIS-Spektrum-Bildgebungssystem auf. Verwenden Sie die integrierte Software, um mehrere kreisförmige Bereiche der Region of Interest (ROI) zu erstellen und die zelluläre Biolumineszenz zu quantifizieren.
4. Temozolomid-Behandlung und Kombinationsscreening
- Vor der Behandlung vier 96-Well-Platten wie oben beschrieben vorbeschichten.
- XG387-Luc-Zellen mit einer Dichte von 1.000 Zellen in 100 μL-Kulturmedium in jede Vertiefung einer optischen 96-Well-Bodenplatte einsäen und die Zellen über Nacht kulturieren.
- Bereiten Sie Temozolomid und die anvisierten Wirkstoffe aus der Stammlösung im Voraus vor. Bereiten Sie eine Konzentrationsserie aus 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM und 50 μM Temozolomid in Kulturmedium für die Einzelmittelbehandlung vor. Verdünnen Sie Temozolomid und die zielgerichteten Wirkstoffe in Stammlösung im Kulturmedium, um Endkonzentrationen von 200 μM bzw. 2 μM für das Kombinationsdrogenscreening zu erhalten (Tabelle 2).
- Entfernen Sie das Kulturmedium, wenn die meisten GSCs am Boden der Platten haften. Fügen Sie das oben hergestellte Medium, das Temozolomid enthält, in jede Vertiefung für drei technische Replikate pro Behandlung hinzu.
- Zur Behandlung von Temozolomid und zum Screening der Arzneimittelkombinationen wird das leere Medium entfernt und das oben hergestellte Medium, das entweder 200 μM Temozolomid oder 2 μM zielgerichtetes Mittel oder eine Kombination aus beidem enthält, in jede Vertiefung für drei technische Replikate pro Behandlung hinzugefügt.
- Alle Platten bei 37 °C, 5% CO2 für 3 Tage inkubieren.
- Entfernen Sie das arzneimittelhaltige Medium, fügen Sie 50 μL Leeres Medium mit 150 ng/μL D-Luciferin in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 °C.
- Nehmen Sie Bilder der zellulären Biolumineszenz in der Platte mit dem IVIS-Spektrum-Bildgebungssystem auf. Verwenden Sie die integrierte Software, um mehrere zirkuläre ROIs zu erstellen und die zelluläre Biolumineszenz zu quantifizieren.
5. Kombinationsbehandlung von Temozolomid und UMI-77 in XG387-Luc- und XG328-Luc-Zelllinien
- Vor der Behandlung drei 96-Well-Platten wie oben beschrieben vorbeschichten.
- XG387-Luc- und XG328-Luc-Zellen mit einer Dichte von jeweils 1.000 Zellen in 100 μL Kulturmedium in jede Vertiefung einer optischen 96-Well-Bodenplatte einsenden und die Zellen über Nacht kultiviert.
- Bereiten Sie eine Konzentrationsserie aus 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM und 0 μM Temozolomid und einer Konzentrationsserie aus 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM und 0 μM UMI-77 im Kulturmedium für Titrationsmatrixbehandlungen mit sechs mal sechs Dosen vor.
- Entfernen Sie das leere Medium, wenn die meisten GSCs an der Unterseite der Platte haften. Fügen Sie das oben vorbereitete Medium in jede Vertiefung für drei technische Replikate pro Behandlung hinzu.
- Inkubieren Sie diese Platten für 3 Tage bei 37 °C, 5% CO2.
- Entfernen Sie das arzneimittelhaltige Medium; 50 μL Blindmedium mit 150 ng/μL D-Luciferin in jede Vertiefung geben und die Zellen für 5 min bei 37 °C zur Biolumineszenzmessung inkubieren.
6. Datenanalyse
- Berechnen Sie den Sensitivitätsindex (SI) von Temozolomid und Zielmittel gemäß der Formel in Abbildung 2A.
HINWEIS: Der SI-Score soll den Einfluss der Zugabe eines anderen Arzneimittels quantifizieren. Es reichte von -1 bis +1, wobei positive Werte auf synergistische Effekte von Temozolomid hindeuteten. - Berechnen Sie die Werte des Kombinationsindex (CI) zwischen Temozolomid und UMI-77 mit der CompuSyn-Software, um ihre kombinierten Wechselwirkungen zu analysieren. CI-Wert <1 zeigt Synergie an; Der CI-Wert >1 weist auf Antagonismus hin.
- Berechnen Sie die hohen Einzelmittelwerte (HSA) zwischen Temozolomid und UMI-77 mit der Combenefit-Software. Der HSA-Wert gibt die kombinierte hemmende Wirkung an. Der HSA-Wert >0 zeigt Synergie und der HSA-Wert <0 an.
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Representative Results
Die XG387-Zellen bildeten Neurosphären in dem in Tabelle 1 beschriebenen Kulturmedium in einer ultra-low attachment 6-Well-Kulturplatte oder einer nicht beschichteten Platte5 (Abbildung 1A). Zunächst wurde ein Test durchgeführt, um zu überprüfen, ob die Biolumineszenzintensität von XG387-Luc-Zellen proportional zur Zellzahl war. Wie in Abbildung 1Bgezeigt, nahm die Biolumineszenzintensität proportional zur Zelldichte zu und führte zu einer linearen Korrektur zwischen ihnen (Pearson r = 0,9872; p < 0,0001; Abbildung 1C). Da die Biolumineszenz von Luciferase-markierten Zellen einfach und schnell zu messen ist, bietet dies eine einfache Methode, um die Dichte lebensfähiger GSCs zu messen. Als nächstes wurde die antiproliferative Aktivität von Temozolomid bewertet. Wie in Abbildung 1Dgezeigt, verursachte 400 μM Temozolomid eine Proliferationshemmung von XG387-Luc-Zellen von etwa 20%, was darauf hindeutet, dass es nützlich ist, aber seine Anti-GBM-Wirkung weiter verbessert werden kann. Für das Kombinationsscreening wurde die Konzentration von 200 μM gewählt.
Um ein Beispiel zu nennen, wurden 20 zielselektive niedermolekulare Inhibitoren für das Arzneimittelkombinationsscreening verwendet, um die potenziellen Kandidaten zu identifizieren, die die Anti-GBM-Wirkung von Temozolomid verstärken. Infolgedessen lagen die empfindlichen Indexwerte (SI) von 13 Zielerregern über 0 und 5 von ihnen über 0,1 (Abbildung 2B, C). Insbesondere die SI der beiden Top-Kandidaten UMI-77 und A 83-01 waren höher als 0,25, was auf ihr Potenzial zur Synergie mit Temozolomid hindeutet.
Um den obigen Befund zu validieren, wurden die klassischen Synergiemodelle von HSA und Bliss3,4,6 angewendet,um die kombinierte Wirkung von Temozolomid und UMI-77 in GSCs zu bestimmen. Darüber hinaus wurde XG328 - ein weiteres patientenbasiertes GSC-Modell, das früh etabliert wurde - verwendet, um die gleiche Bewertung durchzuführen. Der antiproliferative Assay der kombinierten Behandlung von Temozolomid und UMI-77 wurde in einer Titrationsmatrix mit sechs x sechs Dosen durchgeführt. Die Ergebnisse wurden analysiert, um die HSA- und Bliss-Werte zu erhalten, die Auslesungen für die synergistische Hemmung sind und die Differenz zwischen der erwarteten Hemmung und der beobachteten Hemmung darstellen. Wie in Abbildung 3B-Ddargestellt, deuten die Kombinationsindexwerte (CI) <1 und die hohen Einzelmittelwerte (HSA) >0 für die meisten Kombinationen von Temozolomid und UMI-77 in unterschiedlichen Konzentrationen auf eine synergistische Gesamtinteraktion von Temozolomid und UMI-77 in XG387 und XG328 GSCs hin.
Abbildung 1: GBM-Patienten-abgeleitete GSCs XG387. (A) Neurosphärenbildung. (B) Biolumineszenzerzeugung von Luciferase-markierten GSCs. (C) Die von XG387-Luc-Zellen erzeugte Biolumineszenz war proportional zur Zelldichte. (D) Temozolomid Behandlung von XG387. Jede Behandlung wurde in dreifacher Ausfertigung mit zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt.
Abbildung 2: Arzneimittelkombinationsscreening mit GSCs. (A) Die Formel zur Berechnung des SI (Sensitivitätsindex) von 20 zielgerichteten Wirkstoffen mit Temozolomid (TMZ) im Kombinationsscreen. (B) Die Verteilung der SI-Werte von 20 Zielerregern. Rote Punkte: die fünf besten Kandidaten medikamente. (C) Informationen über die fünf kandidaten zielgerichteten Wirkstoffe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Kombinationsbehandlung von Temozolomid (TMZ) und UMI-77 in XG387-Luc- und XG328-Luc-Zelllinien. (A) Einmalige und kombinatorische Titration von Temozolomid und UMI-77 in einem Proliferationsassay in XG387-Luc- und XG328-Luc-Zelllinien. (B) Isobologram- und Kombinationsindexanalyse der Proliferationshemmung in XG387-Luc- und XG328-Luc-Zellen, die mit Temozolomid und UMI-77 behandelt wurden. CI <1 weist auf einen synergistischen Effekt hin. (C,D) Von Combenefit generierte Synergiediagramme, die die Wechselwirkung zwischen Temozolomid und UMI-77 zeigen. Die Analyse der Interaktion ergab HSA-Werte (High Single Agent) und Bliss-Werte, was auf eine synergistische Wirksamkeit hinweist, die aus den erwarteten Werten berechnet wurde. HSA- und Bliss-Werte >0 weisen auf synergistische Effekte hin. Jede Behandlung wurde in dreifacher Ausfertigung mit zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In der vorliegenden Studie wurde ein Protokoll beschrieben, das angewendet werden kann, um eine mögliche Kombinationstherapie für GBM mit patientenbasierten GSCs zu identifizieren. Im Gegensatz zum Standard-Synergie-/Additivitätsmetrikmodell wie Loewe-, BLISS- oder HSA-Methoden wurde ein einfacher und schneller Workflow verwendet, bei dem kein Arzneimittelpaar bei mehreren Konzentrationen in einer vollständig faktoriellen Weise wie bei den traditionellen Methoden kombiniert werden muss. In diesem Workflow wurde SI (Sensitivitätsindex) eingeführt, der aus einer Studie zur Bewertung der sensibilisierenden Wirkung von siRNAs in Kombination mit einem kleinen molekularen Inhibitor stammt, um die synergistische Arzneimittelwirkung von zwei kleinen molekularen Inhibitoren zu quantifizieren7. Der Bereich der SI-Werte liegt zwischen -1 und 1, und der positive SI-Wert zeigt eine sensibilisierende Wirkung zwischen jedem der Medikamente an. Je höher der SI-Wert, desto stärker war die Synergie. Obwohl der SI-Wert allein nicht in der Lage ist, eine positive Antwort auf die Art (synergistisch, additiv oder antagonistisch) der Arzneimittel-Arzneimittel-Interaktion zu geben, haben diese Top-Kandidaten eine hohe Wahrscheinlichkeit, mit dem interessierenden Medikament zu synergisieren und sind daher einer weiteren Validierung würdig. Im Vergleich dazu sind die meisten der derzeitigen Hochdurchsatz-Screening-Methoden für Arzneimittelkombinationen immer noch mühsam und beinhalten schwierige Algorithmen8,9.
Um die Machbarkeit dieser Methode zu veranschaulichen, wurde ein kleines Testsieb durchgeführt. Infolgedessen war es möglich, UMI-77, einen selektiven MCL1-Inhibitor, als Top-Kandidaten unter 20 zielgerichteten Wirkstoffen zu identifizieren, die mit Temozolomid bei der Wachstumsunterdrückung von GSCs synergistisch wirken. In einer früheren Studie wurde auch festgestellt, dass UMI-77 die Antigliomaktivität von Temozolomid in etablierten GBM-Zellen synergistisch verstärkt10. In der aktuellen Studie wurde die synergistische Wechselwirkung zwischen UMI-77 und Temozolomid bei GSCs mit dem klassischen Chou-Talalay-Kombinationsindex, BLISS oder HSA-Methoden erneut zugelassen. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von Luciferase-markierten GSCs zur Messung des lebensfähigen Anteils von Zellen. Die Luciferase-Aktivität von Zellen kann leicht durch Zugabe des Luciferins, dem Substrat der Luciferase, gemessen werden und die Lumineszenz von jedem Instrument mit der Funktion der luminometrischen Messung erfassen. Da die Luciferase-Luciferin-Reaktion schnell ist, bietet sie hierin eine kostengünstige und schnelle Lösung im Vergleich zu herkömmlichen MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H tetrazolium) oder CCK-8 (Zellzählkit-8) Assays, die alle lange Inkubationszeiten erfordern. Zusammen stellt das Protokoll ein Hochdurchsatz-Screening einer potenziellen Wirkstoffkombination für GBM dar. Das Protokoll bietet zusätzlich zu den Standard-Synergiebewertungsmethoden auch eine optionale schnelle und einfache Lösung für das Arzneimittelkombinationsscreen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Konflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken der National Natural Science Foundation of China (81672962), der Jiangsu Provincial Innovation Team Program Foundation und der Joint Key Project Foundation der Southeast University und der Nanjing Medical University für ihre Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 50X |
| EGF | Gibco | PHG0313 | 20 ng/ml |
| FGF | Gibco | PHG0263 | 20 ng/ml |
| Gluta Max | Gibco | 35050061 | 100X |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | 1X |
| Penicillin-Streptomycin | HyClone | SV30010 | P: 10,000 units/ml S: 10,000 ug/ml |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 2088876 | 100 mM |
| Table 1. The formulation of GSC complete culture medium. | |||
| ABT-737 | MCE | Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor | |
| Adavosertib (MK-1775) | MCE | Wee1 inhibitor | |
| Axitinib | MCE | Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor | |
| AZD5991 | MCE | Mcl-1 inhibitor | |
| A 83-01 | MCE | Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase | |
| CGP57380 | Selleck | Potent MNK1 inhibitor | |
| Dactolisib (BEZ235) | Selleck | Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor | |
| Dasatinib | MCE | Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor | |
| Erlotinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Gefitinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Linifanib | MCE | Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family | |
| Masitinib | MCE | Inhibitor of c-Kit | |
| ML141 | Selleck | Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase | |
| OSI-930 | MCE | Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R | |
| Palbociclib | MCE | Selective CDK4 and CDK6 inhibitor | |
| SB 202190 | MCE | Selective p38 MAP kinase inhibitor | |
| Sepantronium bromide (YM-155) | MCE | Survivin inhibitor | |
| TCS 359 | Selleck | Potent FLT3 inhibitor | |
| UMI-77 | MCE | Selective Mcl-1 inhibitor | |
| 4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene) | Selleck | Selective estrogen receptor (ER) modulator | |
| Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table. |
References
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