Summary
مسبار قوة الوميمبران الحيوي (BFP) هو تقنية التحليل الطيفي للقوة الديناميكية في الموقع (DFS). يمكن استخدام BFP لقياس ثابت الربيع من التفاعلات الجزيئية على الخلايا الحية. يقدم هذا البروتوكول تحليلا ثابتا لفصل الربيع للروابط الجزيئية التي اكتشفها BFP.
Abstract
وقد برز مؤخرا مسبار قوة الوميمبران الحيوي (BFP) كسطح الخلية الأصلية أو في الموقع التحليل الطيفي للقوة الديناميكية (DFS) nanotool التي يمكن قياس الحركية ملزمة جزيئية واحدة، وتقييم الخصائص الميكانيكية للتفاعلات مستقبلات ليجاند، تصور التغيرات تشكيلية ديناميكية البروتين ومستقبلات أكثر إثارة توضيح آليات mechanosensing الخلية بوساطة. وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام BFP لقياس ثابت الربيع من الروابط الجزيئية. يصف هذا البروتوكول الإجراء خطوة بخطوة لإجراء تحليل DFS ثابت الربيع الجزيئي. على وجه التحديد، يتم مناقشة وضعي تشغيل BFP، وهما أوضاع خلية الخرز والخرز. يركز هذا البروتوكول على اشتقاق ثوابت الربيع للروابط الجزيئية والخلايا من البيانات الخام DFS.
Introduction
كما تقنية DFS الخلايا الحية، BFP المهندسين خلية الدم الحمراء البشرية (RBC؛ 1000000000000000000000000000000000000000000 الشكل 1) إلى محول قوة فائق الحساسية وغير قادر مع مجموعة ثابتة ربيعية متوافقة عند 0.1-3 pN/nm1،2،3. للتحقيق في التفاعل بين مستقبلات ليغاند، BFP تمكن قياسات DFS في ~ 1 pN (10-12 N)، ~ 3 نانومتر (10-9 م)، و ~ 0.5 مللي ثانية (10-3 ثانية) في القوة والمكانية، والقرار الزمني4،5. يتكون تكوينه التجريبي من اثنين من micropipettes المتعارضة ، وهي التحقيق والهدف. التحقيق micropipette aspirates RBC ولصق حبة في ذروتها عن طريق التفاعل البيوتين streptavidin. الخرزة مغلفة مع ليغاند من الفائدة (الشكل 1A). الهدف micropipette aspirates إما خلية أو حبة تحمل مستقبلات الاهتمام ، المقابلة لخلية الخرز(الشكل 1B)والخرزة حبة (الشكل 1C) وسائط ، على التوالي5.
وقد وصفت BFP البناء والتجميع والبروتوكولات التجريبية DFS بالتفصيل سابقا1،6. باختصار، دورة لمسة BFP يتكون من 5 مراحل: نهج، Impinge، الاتصال، تراجع وتفكك(الشكل 1D). ويشار إلى موقف قمة RBC الأفقي على أنه ΔxRBC. في البداية، تشوه RBC غير المجهد (قوة الصفر) هو 0 ( الجدول 1). ثم يتم دفع الهدف من قبل piezotranslator إلى impinge على وتراجع من حبة التحقيق(الشكل 1D). يتم ضغط أول مسبار RBC من قبل الهدف مع تشوه RBC السلبي ΔxRBC < 0. في حدث بوند، تنتقل مرحلة التراجع من مرحلة ضغط إلى مرحلة الشد مع تشوه RBC الإيجابي ΔxRBC > 0 (الشكل 2C و D). وفقا لقانون هوك، فإن قوة تحمل BFP قادرة على أن تقاس على أنها F = kRBC × ΔxRBC، حيث KRBC ( الجدول1) هو ثابت الربيع RBC من BFP. عند تمزق السندات والانتهاء من دورة لمسة واحدة، يعود حبة التحقيق إلى موقف قوة الصفر مع ΔxRBC = 0(الشكل 1D).
لتحديدRBC ك، ونحن قياس وتسجيل شعاعي من فتحة التحقيق micropipette الداخلية (ص ر)، وRBC (R0) ومنطقة الاتصال الدائري (Rج) بين RBC والخرزة التحقيق ( الشكل1A). ثم يتمحساب كRBC وفقا لنموذج ايفان (Eq. 1)7،8 باستخدام برنامج LabVIEW الذي يعمل كأداة افتراضية (VI) لتشغيل BFP ( الشكلS1A)8،9.
(Eq. 1)
مع BFP المنشأة وDFS البيانات الخام التي تم الحصول عليها، وهنا نقدم كيفية تحليل ثابت الربيع من زوج مستقبلات ليجند أو الخلايا. البيانات الخام DFS على التفاعل بين البروتين الجليكوسيلات Thy-1 و K562 خلية تحمل integrin α5β1 (Thy-1-α5β1; الشكلان 3A و 3B)10 و 10 من الفيبرينوجين والخرز المغلفة integrin αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; الشكل 3C) 11,12 وقد استخدمت لإثبات الخرز الخلية والخرز حبة وسائط التحليل, على التوالي.
BFP التحضير التجريبي
للحصول على تفاصيل إعداد BFP التجريبي والأجهزة، يرجى الرجوع إلى البروتوكولات المنشورة سابقا3. وباختصار، تم تطين RBC البشري باستخدام البيوتين-PEG3500-NHS في العازلة الكربون/ بيكربونات. وقد اقترنت البروتينات ذات الأهمية بشكل مشترك بالخرز الزجاجي البوروسيليكات باستخدام MAL-PEG3500-NHS في حاجز الفوسفات. لإرفاق RBC البيوتينية ، يتم أيضا طلاء حبة المسبار بالستريبتافيدين (SA) باستخدام MAL-SA. يرجى الاطلاع على جدول المواد والجدول 2.
لتجميع BFP (الشكل 1، إلى اليسار) ، سيتم استخدام micropipette الثالثة التي يطلق عليها "المساعد" لتسليم حبة التحقيق والغراء إلى قمة RBC1،3. التفاعل التساهمي بين حبة التحقيق المغلفة SA وRBC البيوتينية هو أقوى بكثير من رابطة مستقبلات ليغاند من الفائدة. وهكذا، يمكن تفسير المرحلة التفككية على أنها تمزق السندات مستقبلات ليغاند بدلا من مفرزة من حبة التحقيق من RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الحصول على أحداث DFS قابلة للتحليل
- بدء التجربة في البرنامج (على سبيل المثال، LabVIEW VI) للتحكم BFP وإعداد المعلمة(الشكل S1A).
- مراقبة خرزة الهدف التحقيق المتكررة / لمسات الخلية في البرنامج لBFP مونيتور (الشكل S1B).
- اختبار وتحقيق تردد التصاق ≤ 20٪ ضمن أول 50 لمسات عن طريق ضبط قوة المساس ووقت الاتصال، والتي تضمن أن ≥ 89٪ من حدث التصاق DFS يتم التوسط من قبل سندات واحدة12،13،14.
ملاحظة: لكل زوج حبة الخلية/ حبة، ونحن تنفيذ 200 دورات اللمس المتكررة. للحصول على جودة بيانات قابلة للنشر، نقوم عادة بإجراء n ≥ 3 أزواج من الخرز أو الخرز الخلية.- حفظ البيانات، في شكل قوة مقابل الوقت، إلى المجلد الموجه للمستخدم بنهاية كل زوج، التي دفعها البرنامج للتحكم BFP وإعداد المعلمة.
- جمع القوة مقابل الوقت البيانات الخام للأحداث بوند، كما يتضح في الشكل 2A،وذلك باستخدام منصة اقتناء BFP(الشكل S1C).
- افتح برنامج تحليل بيانات BFP. انقر على رمز المجلد الأصفر وحدد ملف البيانات الخام المقابلة عن طريق النقر المزدوج عليها.
- تشغيل البرنامج، ومن ثم انقر فوق الزر لأعلى ول لأسفل للتبديل بين الأحداث. استخدم معايير الاستبعاد المتطرفة (الشكل S2) لحجب الأحداث غير الصالحة. حدد نوع البيانات المصدرة بتنسيق القوة مقابل الوقت وانقر على زر تصدير بيانات المؤامرات.
2. تحويل القوة مقابل منحنى الوقت إلى القوة مقابل منحنى التشريد
- تصدير مقطع البيانات المقابل لمرحلة السحب إلى جدول بيانات (الشكل 2A، سرادق مربع) ، وهو ما يرتبط بالتحليل المستمر الربيع.
- رسم القوة مقابل منحنى الوقت باستخدام برنامج جدول البيانات. للحصول على منحنى القوة مقابل الإزاحة، قم بتحويل قيم الوقت(الشكل 2A، x-axis)إلى قيم الإزاحة الإجمالية (Δxtot)عن طريق ضرب قيم الوقت بسرعة حركة بيزو (أي 4000 نانومتر / ثانية بواسطة الضبط المسبق).
- صفر نقطة البيانات الأولى بطرح أصغر قيمة إزاحة من كل قيمة إزاحة مكتسبة. هذا التحول الأفقي لا يؤثر على المنحدرات الصاعدة لمرحلة التراجع ولا على حساب ثابت الربيع اللاحق.
- وتجدر الإشارة إلى أن BFP يعتبر نظام ربيع تسلسلي حيث Δxtot (الجدول 1) مجموع التشوهات في RBC ، ΔxRBC ( الجدول1) ، الرابط الجزيئي ، Δxmol (الجدول 1) ، والخلية المستهدفة ، Δxالخلية (الجدول 1) ، كما Eq. 2:
(Eq. 2) - رسم القوة (F) مقابل الإزاحة (Δxtot) منحنى كما هو موضح في الشكل 2B.
(Eq. 2)3. الربيع Cnstant تحليل الخرز - وضع الخلية
- في منحنى القوة مقابل الإزاحة ، يمكن تحديد اثنين من المنحدرين المتميزين ، حيث يمكن لكل منهما تمثيل المرحلة الضاغطة ومرحلة الشد. احتواء خط انحدار لكل مجموعة بيانات (الشكل 2B)، حيث يمثل الميل الملاءمة الخطية الأكبر ثابت الربيع الكلي في المرحلة الضغطية (الشكل 2B، أحمر)،ويشار إليه ب k1 (الجدول 1)؛ ويمثل المنحدر الأصغر الخطي ثابت الربيع الكلي في مرحلة الشد (الشكل 2B، الأزرق) ، معنوما ك2 (الجدول 1).
- بالنسبة للينابيع المتصلة في سلسلة لكل وصف الخطوة 2.2، والتعبير عن المعاملة بالمثل من مجموع ثابت الربيع، كتوت (الجدول 1)،ومجموع من عكس ثابت الربيع من RBC، كRBC ( الجدول1)،الرابط الجزيئي، كمول (الجدول 1)،والخلية المستهدفة، كالخلية (الجدول 1). خلال المرحلة الضاغطة من وضع خلية الخرز ، لا يتم تمديد الرابطة الجزيئية ، وبالتالي لا يؤخذ kmol في الاعتبار. يتم التعبير عن المعاملة بالمثل من كتوت في هذا السيناريو (1 /ك1) كما
(Eq. 3).
في المثال البيانات، يتم تحديدRBC kمسبقا (0.25 pN/nm بشكل افتراضي). يمكن اشتقاق الخلية k من Eq. 3 مع k1 و kRBC المكتسبة ( الشكل3B). - خلال مرحلة الشد ، يتم تشكيل التصاق بين زوج مستقبلات الليغند. التعبير عن المعاملة بالمثل من كتوت في هذا السيناريو (1 /ك2) كما
(Eq. 4)
حيث k2 (الجدول 1) يمثل ثابت الربيع الإجمالي خلال مرحلة الشد. - اشتقاق kمول من طرح 1/ك1 من 1 /ك2 (مقارنة Eq. 3 مقابل Eq. 4).
(Eq. 3).
(Eq. 4)4. الربيع التحليل المستمر للخرزة - وضع حبة
- احتواء خط انحدار إلى بيانات المرحلة الضغط للحصول على k1 (مشابهة الشكل 2B, أحمر). من الجدير بالذكر، في وضع حبة حبة، يتم استبدال الخلية الهدف من قبل حبة زجاجية المغلفة مع مستقبلات الفائدة(الشكل 1C). منذ تشوه حبة لا يكاد يذكر، يمكن إزالة مصطلحالخلية 1 /كمن Eq. 3 و Eq. 4 وفقا لذلك. يمكن التعبير عن الكميةالمتبادلة ktot للمرحلة الضغطية (1/k1)على النحو التالي:
(Eq. 5) - احتواء خط انحدار إلى بيانات مرحلة الشد للحصول على k2 (مشابهة الشكل 2B، أزرق). يمكن التعبير عن الكمية المتبادلةktot من مرحلة الشد (1/k2)على النحو التالي:
(Eq. 6) - اشتقاق kمول من طرح 1/ك1 من 1 /ك2 (مقارنة مكافئ 5 مقابل مكافئ 6).
(Eq. 5)
(Eq. 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا العمل، لقد أظهرنا بروتوكول تحليل الربيع BFP المستمر. لوضع تحليل حبة الخلية، قمنا بتحليل kمول من الرابط الجزيئي بين البروتين الجليكوسيلات Thy-1 المغلفة على حبة التحقيق و integrin α5β1 أعرب عن على الخلية K562 الهدف (Thy-1-integrin α5β1; الشكل 3A) 10.الخلية k مشتقة أيضا من وضع خلية الخرز (K562 الخلية; الشكل 3ب). لوضع حبة حبة، السندات الجزيئية التي تشكلت بين الفيبرينوجين و integrin αبنك الاستثمار الدوليβ3 (FGN-integrin αبنك الاستثمار الدوليβ3؛ الشكل 3C) 11،12 يستخدم لشرح وضع تحليل حبة حبة.
لوضع خلية الخرز، قمنا بقياس ثوابت الربيع من Thy-1-integrin α5β1 السندات وخلية K562 كمول = 0.45 ± ± 0.28 pN/nm (الشكل 3A) وk الخلية = 0.18 ± 0.07 pN/nm ( الشكل3B) من 27 أحداث قابلة للتحليل تم فحصها مسبقا. لوضع حبة حبة، قمنا بقياس ثوابت الربيع من FGN-integrin αIIbβ3 السندات كما كمول = 0.53 ± 0.29 pN/nm (الشكل 3C) من 33 الأحداث التي تم فحصها مسبقا تحليل.
| رمز | تعريف | رمز | تعريف |
| Δxتوت | الإزاحة الإجمالية للفطيرة ، والتي يمكن تفسيرها أيضا على أنها تشوه إجمالي ل RBC والخلية المستهدفة والروابط الجزيئية. | ΔxRBC | تشوه RBC ، والذي يمكن تفسيره أيضا على أنه إزاحة حبة المسبار. |
| كتوت | ثابت الربيع الإجمالي لنظام الربيع التسلسلي BFP بأكمله. | كآر بي سي | ثابت الربيع من RBC يستنشق من قبل micropipette التحقيق. |
| كمول | ثابت الربيع من BFP الكشف عن السندات الجزيئية | كالخلية | ثابت الربيع للخلية الهدف. |
| ك1 | كتوت من المرحلة ضاغط في مرحلة التراجع. | ك2 | كتوت من مرحلة الشد في مرحلة التراجع. |
| ΔF1 | زيادة القوة التي يشعر بها حبة التحقيق في المرحلة الضغط. | ΔF2 | زيادة القوة التي يشعر بها حبة التحقيق في مرحلة الشد. |
| Δx1 | زيادة الإزاحة في المرحلة الضاغطة. | Δx2 | زيادة الإزاحة في مرحلة الشد. |
الجدول 1 - الجداول تعريفات الرمز لتحليل BFP الجزيئي الربيع المستمر. يتم تعريف المواضع الأفقية لجميع الكائنات على أنها x، بينما تشير Δx [nm] إلى التشوه بالنسبة إلى الموضع الأصلي. يشير F [pN] إلى زيادة القوة التي تقاس ب BFP. k [pN/nm] يشير إلى ثابت الربيع. تتوافق النقوش الفرعية 1 و2 مع مرحلتي الضغط والشد على التوالي. مشتق من ثابت الربيع الجزيئي من القوة (F) مقابل. منحنى الإزاحة (Δxtot).
الشكل 1: تكوين BFP ودورة اللمس DFS. (أ) نظام BFP يجمع اثنين من micropipettes معارضة، وهي التحقيق(يسار)والهدف (يمين). المسبار micropipette أسبيراتس RBC(أحمر)مع حبة زجاجية لصقها في ذروتها لتكون بمثابة محول القوة. الهدف micropipette أسبيراتس خلية المستقبلات الحاملة (الأزرق). يتم تحديد ثابت الربيع RBC(كRBC)من ضغط الطموح (Δp)وradi من RBC يستنشق (R0)، مجهر التحقيق (Rp) ومنطقة الاتصال الدائري (Rج) بين RBC والخرزة التحقيق. (ب و ج) ميكروجرافات من الخرز الخلية (ب) والخرز حبة (C) وسائط BFP. أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر (D) دورة لمس BFP تتكون من المراحل النهج، Impinge، الاتصال، التراجع والتفكك. يشير خط ΔxRBC = 0 dash إلى موضع BFP غير المجهد أو ذو القوة الصفرية. تتضمن مرحلة التراجع مرحلة ضغط (ΔxRBC < 0 والأحمر)وموضع القوة الصفرية (ΔxRBC = 0 والأسود) ومرحلة الشد (ΔxRBC > 0 والأزرق)في التسلسل. السهم الأسود يشير إلى موقف الحدث بوند. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: اشتقاق ثوابت الربيع الجزيئية من البيانات الخام DFS. (أ) القوة التمثيلية (F) مقابل الوقت (ر) منحنى البيانات الخام DFS في دورة لمس BFP واحدة. (ب) ممثل تحويل القوة (F) مقابل الإزاحة (Δxtot) منحنى الذي يصور مرحلة التراجع. k1 و k2 يمثلان الميل المناسب لممراحل الضغط والشد المتتالية على التوالي. تمثل ΔF1 و ΔF2 زيادات القوة في المرحلة الضاغطة وبيانات مرحلة الشد، على التوالي، حيث تمثل Δx1 و Δx2 زيادات الإزاحة في المرحلة الضاغطة وبيانات مرحلة الشد، على التوالي. R2 قيم ثابت الربيع خلال مرحلة الضغط (R12) ومرحلة الشد (R2 2) وصفت على الرسم البياني للإشارة إلى اللياقة الإحصائية الجيدة. (C و D) الرسوم التوضيحية لمرحلة التراجع في وسائط تجريبية بين خلية الخرز (C) والخرزة (D). كRBC يمثل ثابت الربيع من RBC; كالخلية وkمول تمثلثوابت الربيع من الخلية المستهدفة والسندات الجزيئية، على التوالي. خلال مرحلة الشد، يتم تشكيل التصاق بين الزوج مستقبلات ليغاند، وRBC ينحرف في نفس الاتجاه كما يتراجع بيزو وراء موقف قوة الصفر (Δ×RBC > 0). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:مخططات بيانية تمثيلية لثوابت الربيع المقاسة BFP. رقم الحدث(المحور ص الأيسر)وتوزيع التردد(يمين المحور ص)من ثوابت الربيع المقاسة ل Thy-1-integrin α5β1 بوند (A) و K562 الخلية المستهدفة (B) في وضع خلية الخرز وFGN-integrin αIIbβ3 بوند (C) في وضع الخرز والخرز. الرسم البياني هي مناسبة مع منحنى توزيع الغاوسية(الوردي)والمعلمة الإحصائية، R2،ويستخدم للإشارة إلى قوة اللياقة البدنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل S1: واجهة BFP محلية الصنع. (أ) BFP التحكم والمعلمة واجهة الإعداد. يتم إدخال المعلمات لتحديد ثابت الربيع RBC من لوحة المعلمات الفيزيائية الحيوية. (ب) رصد برنامج BFP. سيتم ملاحظة دورات اللمس المباشرة BFP من طريقة عرض الكاميرا هذه. (ج) واجهة تحليل DFS BFP حيث يتم استعراض القوة (F) مقابل الوقت (t) منحنيات حاليا ومعالجتها مسبقا للتحليل المستمر الربيع الجزيئي اللاحقة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل S2- الأرقام 2- الأرقام 2 BFP لمراقبة جودة البيانات القابلة للتحليل ومعايير ما قبل الفحص. (أ) أحداث DFS جيدة ذات جودة عالية: (1) حدث قوة تمزق خلية الخرز؛ '2' حدث عمر خلية الخرز؛ '3' حدث قوة تمزق حبة حبة؛ '4' حدث حياة حبة حبة. (ب) مقبولة DFS الأحداث مع بعض الضوضاء: (1) البيانات الانجراف ولكن مرحلة التكبير في تراجع لا تزال صالحة; '2' بيانات طفيفة الانجراف بعد تفكك السندات; '3' خلل البيانات في نظام القوة الصفرية؛ '4' القوة القابضة صغيرة (< 10 pN). (ج) الهيئة المعنية بالاتصالات والدوائر الأحداث ذات النوعية الرديئة التي ينبغي تجاهلها: '1' عدم التصاق؛ '2' عدم وجود أي أسئلة؛ '2' عدم وجود أية أنشطة أخرى؛ '2' عدم وجود أية أنشطة أخرى؛ '2' عدم وجود أية '2' تذبذب البيانات؛ '3' البيانات التي تنجرف طوال الوقت؛ '4' البيانات غير المتقطعة؛ '5' القوة الضاغطة صغيرة جدا (≈ 0 pN)؛ '6' السندات المتعددة؛ '7' البيانات غير الصالحة التي تستمد kmol < 0؛ '8' خطأ في الإشارة. تتم الإشارة إلى قوة صفر بواسطة خط متقطع رمادي. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باختصار ، قدمنا بروتوكول تحليل بيانات مفصل للمعالجة المسبقة للبيانات الخام DFS واشتقاق ثوابت الربيع الجزيئية في أوضاع تحليل BFP Bead-Bead و Bead-Cell. يتم تقديم نماذج ومعادلات الميكانيكا الحيوية اللازمة لتحديد ثوابت الربيع الجزيئية والخلوية. وإن كانت تدرس integrins مختلفة ، وkمول تقاس وضع حبة حبة ووضع الخرز الخلية تمتلك اختلافات كبيرة النطاق(الشكل 3A مقابل الشكل 3C). من الجدير بالذكر ، مع وضع حبة الخرز ، يرتبط المستقبلات بشكل متناقض بالخرز الزجاجي. في المقابل ، مع وضع خلية الخرز ، يتم تكييف مستقبلات السطح بواسطة غشاء البلازما الأساسي والهياكل الخلوية ، والتي تؤثر على الأرجح على kmolالمقاس.
10 - إن مراقبة جودة البيانات أمر حاسم لضمان إمكانية إعادة إنتاجها. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتنفيذ معايير الفحص المسبق للبيانات الخاصة ب DFS والاستبعاد المتطرف على مؤامرات القوة مقابل الوقت. لإثبات ذلك، تم اختيار مجموعة بيانات تمثيلية، حيث قمنا بتصنيف البيانات الخام DFS إلى ثلاثة مستويات من الجودة: جيد (الشكل S2A)، مقبول مع الضوضاء (الشكل S2B)، والفقراء غير مقبول(الشكل S2C). للمبتدئين من استخدام BFP، ونحن نوصي معايير صارمة لفحص البيانات مسبقا مع نوعية جيدة (الشكل S2A). وتجدر الإشارة إلى أنه استنادا إلى معايير ما قبل الفرز للبيانات، ينبغي أن يكون خط الانحدار المناسب للمرحلة الضاغطة أكثر حدة من خط مرحلة الشد، وتحديدا k1 > k2 (الشكل S2C، vii). عند قياس k1 < k2 ( الشكلS2C, vii) ، فإن kmol المشتقة < 0 هي مقابل الأساس المنطقي لكل حساب في الخطوة 4. وينبغي عندئذ اعتبار هذه الأحداث القيم المتطرفة غير الصالحة والتخلص منها.
لصالح قياس BFP على المستوى الجزيئي الواحد أثناء الحصول على البيانات ، تم تنفيذ تكوينات تجريبية متعددة وفقا للدراسة السابقة12. أولا، كثافة طلاء البروتين على الخرز وعادة ما يتم titrated وصولا الى مستوى الحد الأدنى (على سبيل المثال 60 ميكرومتر-2)عن طريق التحكم الصارم في تركيز الحل، وكمية من البروتين وظروف رد الفعل15. وبالتالي يقدر متوسط المسافة المكانية بين البروتينات على حبة أكبر بكثير من الأبعاد الخطية للبروتين، لصالح قياساتنا على المستوى الجزيئي واحد12،13،14. ثانيا، نحن نتحكم في تردد التصاق لكل زوج مستقبلات ليغاند ≤ 20٪، والتي بموجبها سوف تتبع أحداث الربط الجزيئي توزيع بواسون توقع ≥ 89٪ من الأحداث ستكون ملزمة واحدة الجزيئية14،15. لتحقيق ذلك ، يتم تعيين قوة المساس ووقت الاتصال وفقا لذلك ، وتحتاج إلى أن تكون متسقة طوال التجربة12. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الممكن أن السندات متعددة تحدث بشكل تسلسلي(الشكل S2C، 6). وفي مثل هذه الحالات، سننبذ الأحداث بتوقيعات على سندات متعددة. وأخيرا وليس آخرا، سيتم إجراء تجارب التحكم السلبية مع الخرز المغلفة بألبوم مصل البقر(جدول المواد)أو SA وحدها لضمان تردد التصاق غير محددة ≤ 2٪16،17.
على الرغم من أن BFP قوية للتحقيق في ديناميات البروتين على سطح الخليةالحية 10،11،12، هناك قيود تقنية. في BFP، يمكن التحقيق في زوج واحد فقط من مستقبلات الليغند في وقت واحد. وسيكون الحصول على بيانات كافية ذات أهمية إحصائية يستغرق وقتا طويلا. الى جانب ذلك ، فإن الإجراءات التجريبية كثيفة العمالة مع منحنيات التعلم حاد. تنفيذ الحكمة ، ونظام BFP الحالي هو عرضة للانجراف البيئي والاهتزاز الميكانيكي المحيطة بها. ونتيجة لذلك، يلزم إجراء تعديل يدوي مستمر لضمان جودة بيانات نظام إدارة الدعم الميداني. وتحقيقا لهذه الغاية، أدخلت واحدة من دراساتنا الحديثة خوارزميات مراقبة ردود الفعل BFP مستقرة للغاية لتحسين استقرار BFP القوة المشبك DFS المقايسات4. يتيح هذا التقدم التقني قياسات التفاعل الجزيئي الأقوى مثل ربط الأجسام المضادة للمضاد مع عمر السندات الطويل جدا (>50 s). ومع ذلك، نتوقع أن تبذل جهود في المستقبل لأتمتة ودمج الحصول على بيانات BFP وتحليل DFS في برنامج محوسب واحد، مما يجعل عملية BFP بأكملها وتحليل البيانات أكثر سهولة في الاستخدام وعالية الإنتاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن المؤلفان أنه ليس لديهما مصالح متنافسة لتقديم تقرير بشأن هذه الدراسة.
Acknowledgments
نشكر غيوم ترواديك على المناقشة المفيدة، وزيهاو وانغ على استشارة الأجهزة، ومركز سيدني للتصنيع، وجريج سوانينغ وسيمون رينغر لدعمهم شركتنا الناشئة في المختبر. تم دعم هذا العمل من قبل مشروع اكتشاف مجلس البحوث الأسترالي (DP200101970 - L.A.J.) ، وبرنامج بناء قدرات القلب والأوعية الدموية في نيو ساوث ويلز (منحة الباحث الوظيفي في منتصف مبكر - L.A.J.) ، جائزة مسرع أبحاث سيدني (SOAR - L.A.J.) ، مؤسسات راماسيوتي منحة الاستثمار الصحي (2020HIG76 - L.A.J.) ، ومنحة أفكار المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (APP2003904 - L.A.J.) ، وصندوق جامعة سيدني للشركات الناشئة في كلية الهندسة ومخطط المعدات الرئيسية (L.A.J.). بطانة أرنولد جو هو زميل مجلس البحوث الأسترالي DECRA (DE190100609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
- Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
- An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
- Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C.
- Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886 (2014).
- Passam, F., et al.
- Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
- Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447 (2016).
