Summary
En biomembrane force probe (BFP) er en in situ dynamic force spektroskopi (DFS) teknikk. BFP kan brukes til å måle vårkonstanten av molekylære interaksjoner på levende celler. Denne protokollen presenterer vårkonstantanalyse for molekylære bindinger oppdaget av BFP.
Abstract
En biomembrane force probe (BFP) har nylig dukket opp som en innfødt-celle-overflate eller in situ dynamisk kraft spektroskopi (DFS) nanoverktøy som kan måle enkeltmolekylære binding kinetikk, vurdere mekaniske egenskaper av ligand-reseptor interaksjoner, visualisere protein dynamiske konformasjonsendringer og mer spennende belyse reseptormediert celle mechanosensing mekanismer. Mer nylig har BFP blitt brukt til å måle vårkonstanten av molekylære bindinger. Denne protokollen beskriver den trinnvise prosedyren for å utføre molekylær vårkonstant DFS-analyse. Nærmere bestemt diskuteres to BFP-operasjonsmoduser, nemlig Bead-Cell- og Bead-Bead-modusene. Denne protokollen fokuserer på å utlede vårkonstanter av molekylærbindingen og cellen fra DFS-rådata.
Introduction
Som en live-celle DFS-teknikk utvikler BFP en menneskelig rød blodlegeme (RBC; Figur 1) inn i en ultrasensitiv og justerbar krafttransduser med et kompatibelt fjærkonstantområde på 0,1-3 pN/nm1,2,3. For å undersøke ligandreseptorinteraksjon aktiverer BFP DFS-målinger ved ~1 pN (10-12 N), ~3 nm (10-9 m) og ~0,5 ms (10-3 s) i kraft, romlig og tidsmessig oppløsning4,5. Den eksperimentelle konfigurasjonen består av to motsatte mikropipetter, nemlig sonden og målet. Probemikropipetten aspirerer en RBC og en perle limes på toppen via en biotin-streptavidin interaksjon. Perlen er belagt med ligaen av interesse (Figur 1A). Målmikropipetten aspirerer enten en celle eller en perle som bærer reseptoren av interesse, tilsvarende bead-celle (figur 1B) og perle(figur 1C) modi, henholdsvis5.
BFP-konstruksjon, montering og DFS eksperimentelle protokoller ble beskrevet i detalj tidligere1,6. Kort sagt består en BFP-berøringssyklus av 5 trinn: Approach, Impinge, Contact, Retract and Dissociate (Figur 1D). Den horisontale RBC apex-posisjonen er betegnet som ΔxRBC. I begynnelsen er den ubenyttede (nullkrafts) RBC-deformasjonen ΔxRBC 0 (Tabell 1). Målet drives deretter av en piezotranslator for å hindre og trekke seg tilbake fra sondeperlen (figur 1D). RBC-sonden komprimeres først av Target med negativ RBC-deformasjon ΔxRBC < 0. I en Bond-hendelse går tilbaketrekningsfasen fra et kompressiv til en strekkfase med positiv RBC-deformasjon ΔxRBC > 0 (Figur 2C og D). I henhold til Hookes lov kan BFP-lagerkraften måles som F = kRBC × ΔxRBC, der kRBC ( tabell1) er RBC-fjærkonstanten til BFP. Ved bindingsbrudd og fullføring av en berøringssyklus går sondeperlen tilbake til nullkraftposisjon med ΔxRBC = 0 (Figur 1D).
For å bestemme kRBCmåler og registrerer vi radiene til sondens mikropipette indre åpning (Rp), RBC (R0) og det sirkulære kontaktområdet (Rc) mellom RBC og sondeperlen ( figur1A). Deretter beregnes kRBC i henhold til Evans modell (Eq. 1)7,8 ved hjelp av et LabVIEW-program som fungerer som et virtuelt instrument (VI) for å betjene BFP ( FigurS1A)8,9.
(Eq. 1)
Med en BFP etablert og DFS rådata oppnådd, presenterer vi herved hvordan vi analyserer vårkonstanten til ligandreseptorpar eller celler. DFS-rådataene om samspillet mellom det glykosylerte proteinet Thy-1 og K562 cellebærende integrin α5β1 (Thy-1-α5β1; Figur 3A og 3B)10 og fibrinogen og perle belagt integrin αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figur 3C) 11,12 har blitt brukt til å demonstrere bead-cell og perle analyse moduser, henholdsvis.
BFP eksperimentell forberedelse
Hvis du vil ha mer informasjon om BFP eksperimentell forberedelse og instrumentering, kan du se de tidligere publiserte protokollene3. Kort fortalt har human RBC blitt biotinylert ved hjelp av Biotin-PEG3500-NHS i karbon/bikarbonatbufferen. Proteiner av interesse har blitt kovalent koblet til borosilikatglassperler ved hjelp av MAL-PEG3500-NHS i fosfatbufferen. For å feste til den biotinylerte RBC, er sondeperlen også belagt med streptavidin (SA) ved hjelp av MAL-SA. Se Materialtabellen og tabell 2.
For å montere BFP (Figur 1, venstre), vil den tredje mikropipetten kalt 'Hjelper' bli brukt til å levere sondeperlen og lime den til RBCs apex1,3. Den kovalente interaksjonen mellom SA-belagt sondeperle og biotinylert RBC er mye sterkere enn den ligandreseptorbindingen av interesse. Dermed kan Dissociate-scenen tolkes som ligandreseptorbindingsbruddet i stedet for løsrivelse av sondeperle fra RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Få tak i analyserbare DFS-hendelser
- Start eksperimentet i programvaren (f.eks. LabVIEW VI) for BFP-kontrollen og parameterinnstillingen (Figur S1A).
- Vær oppmerksom på de repeterende sondeperle-bead/celleinnslagene i programvaren for BFP Monitor (Figur S1B).
- Test og oppnå vedheftsfrekvensen ≤ 20 % i løpet av de første 50 berøringene ved å justere impingementkraften og kontakttiden, der den sikrer at ≥ 89 % av DFS-vedheftshendelsen formidles av enkeltobligasjoner12,13,14.
MERK: For hvert perlecelle/perlepar utfører vi 200 repeterende berøringssykluser. For å oppnå publiseringsverdig datakvalitet utfører vi vanligvis n ≥ 3 Perle-perle- eller perlecellepar.- Lagre data, i form av Force vs. Time, til den brukerstyrte mappen ved slutten av hvert par, bedt om av programvaren for BFP-kontroll og parameterinnstilling.
- Samle inn rådataene Force vs. Time for Bond-hendelser, som eksemplifisert i figur 2A, ved hjelp av BFP-oppkjøpsplattformen (Figur S1C).
- Åpne BFP-dataanalyseprogramvaren. Klikk på det gule mappeikonet og velg den tilsvarende rådatafilen ved å dobbeltklikke på dem.
- Kjør programmet, og klikk deretter opp- og nedknappen for å bytte mellom hendelser. Bruk de ytterste utelatelseskriteriene (Figur S2) til å sile ut ugyldige hendelser. Velg eksportdatatypen som Force vs. Time-format, og klikk på Eksporter plottdata-knappen.
2. Konverter Force vs. Time Curve til Force vs. Displacement Curve
- Eksporter datasegmentet som tilsvarer tilbaketrekksfasen, til et regneark (Figur 2A, firkantet rulletekst), som er relevant for vårkonstantanalysen.
- Tegn inn Force vs. Time Curve ved hjelp av regnearkprogramvare. Hvis du vil hente kurven Fremtving i forhold til forskyvning , konverterer du tidsverdiene (Figur 2A, x-aksen) til de totale forskyvningsverdiene (Δxtot) ved å multiplisere tidsverdier med piezo-bevegelseshastighet (dvs. 4 000 nm/s ved forhåndsinnstilling).
- Nullstille det første datapunktet ved å trekke den minste forskyvningsverdien fra hver anskaffede forskyvningsverdi. Denne horisontale transformasjonen påvirker ikke de stigende skråningene i tilbaketrekningsfasen eller den påfølgende vårkonstantberegningen.
- BFP betraktes som et serielt fjærsystem der Δxtot (Tabell 1) summerer deformasjoner av RBC, ΔxRBC (Tabell 1), den molekylære bindingen, Δxmol (Tabell 1) og Målcellen, Δxcelle (Tabell 1), som Eq. 2:
(Eq. 2) - Tegn inn kurven Fremtving (F) kontra forskyvning (Δxtot) som vist i figur 2B.
(Eq. 2)3. Vår cnstant analyse av perle-celle modus
- I force vs. forskyvningskurven kan to forskjellige slop identifiseres, hvor hver kan representere den kompressive fasen og strekkfasen. Tilpasse en regresjonslinje til hver datagruppe (Figur 2B), der den større lineære tilpasningshellingen representerer den totale fjærkonstanten i komprimeringsfasen (Figur 2B, rød), merket som k1 (Tabell 1); og den mindre lineære tilpasningshellingen representerer den totale fjærkonstanten i tenslilefasen (Figur 2B, blå), denotatert som k2 (Tabell 1).
- For fjærer som er koblet sammen i serie per trinn 2.2-beskrivelse, uttrykker du resiprokalen til den totale fjærkonstanten, ktot (Tabell 1), som summen av vårkonstantens inverser av RBC, kRBC (Tabell 1), den molekylære bindingen, kmol ( Tabell1) og Målcellen,k-cellen (Tabell 1). Under den kompresjonsfasen av Bead-Cell-modusen strekkes ikke molekylær binding, derfor tas det ikke hensyn til kmol. Den gjensidige av k-tot i dette scenariet (1/k1) uttrykkes som
(Eq. 3).
I eksempeldataene er kRBC forhåndsbestemt (0,25 pN/nm som standard). k-cellen kan avledes fra Eq. 3 med den oppkjøpte k1 og kRBC ( Figur3B). - I strekkfasen dannes vedheft mellom ligandreseptorparet. Uttrykk stempeletfor k-tot i dette scenariet (1/k2) som
(Eq. 4)
der k2 (Tabell 1) representerer den totale fjærkonstanten i strekkfasen. - Utlede kmol fra å trekke 1/k1 fra 1 /k2 (sammenlign Eq. 3 vs. Eq. 4).
(Eq. 3).
(Eq. 4)4. Vår konstant analyse av perle-perle modus
- Tilpass en regresjonslinje til komprimeringsfasedataene for å hente k1 (ligner på figur 2B, rød). Vær oppmerksom på at i Bead-Bead-modus erstattes Target-cellen av en glassperle belagt med reseptoren av interesse (Figur 1C). Siden perledeformasjon er ubetydelig, kancelletermen på 1/kfjernes fra Eq. 3 og Eq. 4 tilsvarende. Den gjensidige ktot av kompresjonsfasen (1/k1) kan uttrykkes som:
(Eq. 5) - Tilpass en regresjonslinje til strekkfasedataene for å hente k2 (på samme måte som figur 2B, blå). Den gjensidige ktot av strekkfasen (1/k2) kan uttrykkes som:
(Eq. 6) - Utlede kmol fra å trekke 1/k1 fra 1 /k2 (sammenlign Eq. 5 vs. Eq. 6).
(Eq. 5)
(Eq. 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette arbeidet har vi demonstrert protokollen til BFP vårens konstante analyse. For Bead-Cell analysemodus analyserte vi kmol av molekylær binding mellom det glykosylerte proteinet Thy-1 belagt på sondeperlen og den integrinske α5β1 uttrykt på Target K562-cellen (Thy-1-integrin α5β1; Figur 3A) 10. K-cellen er også avledet fra Bead-Cell-modus (K562 Cell; Figur 3B). For Bead-Bead-modus dannet det molekylære båndet mellom fibrinogen og integrinsk αIIbβ3 (FGN-integrinsk αIIbβ3; Figur 3C) 11,12 brukes til å demonstrere Bead-Bead analysemodus.
For Bead-Cell-modus, vi målte fjærkonstantene til Thy-1-integrin α5β1 binding og K562 celle som kmol = 0,45 ± 0,28 pN/nm (figur 3A) og kcelle = 0,18 ± 0,07 pN/nm (figur 3B) fra 27 forhåndsskjermede analyserbare hendelser. For Perle-perle-modus målte vi fjærkonstantene til FGN-integrin αIIbβ3-binding som kmol = 0,53 ± 0,29 pN/nm (figur 3C) fra 33 forhåndsskjermede analyserbare hendelser.
| Symbol | Definisjon | Symbol | Definisjon |
| Δxtot | Den totale forskyvningen av piezo, som også kan tolkes som den totale deformasjonen av RBC, målcelle og molekylær binding. | ΔxRBC | RBC-deformasjonen, som også kan tolkes som forskyvningen av sondeperlen. |
| ktot | Den totale fjærkonstanten til hele BFP-seriefjærsystemet. | kRBC | Vårkonstanten til den aspirerte RBC av probemikropipetten. |
| kmol | Fjærkonstanten til BFP oppdaget molekylær binding | kcelle | Fjærkonstanten for Mål-cellen. |
| k1 | ktot av kompresjonsfasen i tilbaketrekkingsfasen. | k2 | kstrekkfastheten i tilbaketrekkingsfasen. |
| ΔF1 | Kraftøkningen som sonden føler i kompresjonsfasen. | ΔF2 | Økningen av kraft som sonden føler i strekkfasen. |
| Δx1 | Økningen av forskyvning i komprimeringsfasen. | Δx2 | Økningen av forskyvning i strekkfasen. |
Tabell 1. Symboldefinisjoner for BFP molekylær vår konstant analyse. Vannrette plasseringer for alle objekter defineres som x, mens Δx [nm] refererer til deformasjonen i forhold til den opprinnelige plasseringen. ΔF [pN] refererer til kraftøkningen målt ved BFP. k [pN/nm] refererer til fjærkonstanten. Senket skrift 1 og 2 tilsvarer henholdsvis kompressive og strekkfaste faser. Den molekylære fjærkonstanten er avledet fra Force (F) vs. Forskyvningskurve (Δxtot).
Figur 1: BFP-konfigurasjon og DFS-berøringssyklus. (A) BFP-systemet setter sammen to motstående mikropipetter, nemlig proben (venstre) og målet (høyre). Probemikropipetten aspirerer en RBC (rød) med en glassperle limt på toppen for å fungere som en krafttransduser. Målmikropipetten aspirerer en reseptorbærende celle (blå). RBC fjærkonstanten (kRBC) bestemmes av aspirasjonstrykket (Δp) og radier av aspirert RBC (R0), sondemikropipette (Rp) og sirkulært kontaktområde (Rc) mellom RBC og sondeperlen. (B og C) Mikrografer i BFP-modusene Bead-Cell (B) og Bead-Bead (C). Skalastenger = 5 μm. (D) En BFP-berøringssyklus som består av approach, impinge, kontakt, tilbaketrekking og dissosiasjonsstadier. ΔxRBC = 0-streklinjen angir BFP-posisjonen som ikke er belastet, eller nullkraftsposisjon. Tilbaketrekningsfasen inkluderer kompressiv fase (ΔxRBC < 0, rød),nullkraftposisjon (ΔxRBC = 0, svart) og strekkfase (ΔxRBC > 0, blå) i rekkefølge. Svart pil angir plasseringen av Bond-hendelsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Utlede molekylære fjærkonstanter fra DFS-rådata. (A) Representative Force (F) vs. Time (t) kurve av DFS-rådata i én BFP-berøringssyklus. (B) Representant konverterte Force (F) vs. Forskyvning (Δxtot) kurve som viser tilbaketrekningsfasen. k1 og k2 representerer tilpasningshellingen til henholdsvis de påfølgende kompressive og strekkfaser. ΔF1 og ΔF2 representerer kraftintervallene i henholdsvis kompressivfasen og strekkfasedataene, der Δx1 og Δx2 representerer økningen avforskyvning i henholdsvis kompressiv fase og strekkfasedata. R2-verdier for fjærkonstanten under kompresjonsstadiet (R12) og strekkfasen (R22) er merket på grafen for å indikere god statistisk kondisjon. (C og D) Illustrasjoner av tilbaketrekningsfasen i eksperimentelle moduser for Bead-Cell (C) og Bead-Bead (D). kRBC representerer fjærkonstanten til RBC; kcelle og kmol representerer henholdsvis fjærkonstantene til Målcellen og den molekylære bindingen. I strekkfasen dannes vedheft mellom ligandreseptorparet, RBC avleder i samme retning som piezo trekker seg utover nullkraftposisjon (ΔxRBC > 0). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative histogrammer av BFP målte fjærkonstanter. Hendelsesnummeret (venstre y-akse) og frekvensfordelingen (høyre y-akse) av målte fjærkonstanter for Ty-1-integrinsk α5β1 binding (A) og K562 Målcelle (B) i Bead-Cell-modus og FGN-integrin αIIbβ3 bond (C) i Bead-Bead-modus. Histogrammer passer med gaussisk distribusjonskurve (rosa) og den statistiske parameteren R2brukes til å angi styrken på kondisjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur S1: Det hjemmelagde BFP-grensesnittet. (A) BFP-kontroll og parameterinnstillingsgrensesnitt. Parametrene for å bestemme RBC-fjærkonstanten kommer inn fra panelet av biofysiske parametere. (B) BFP-overvåking. Live BFP-berøringssykluser vil bli observert fra denne kameravisningen. (C) BFP DFS analysegrensesnitt der Force (F) vs. Time (t) kurver er frakoblet gjennomgått og forhåndsbehandlet for etterfølgende molekylær vår konstant analyse. Klikk her for å laste ned denne filen.
Figur S2. BFP analyserer datakvalitetskontroll og pre-screening kriterier. (A) Gode DFS-hendelser med høy kvalitet: (i) Bead-Cell bruddkrafthendelse; (ii) Bead-Cell livstidshendelse; (iii) Bead-Bead brudd kraft hendelse; (iv) Bead-Bead livstidshendelse. (B) Akseptable DFS-hendelser med noe støy: (i) Data som driver, men tilbaketrekkingsstadiet for zoom inn forblir gyldig; (ii) Små data som driver etter obligasjonsdissosiasjon; (iii) Data kink ved null-kraft regimet; (iv) Holdekraften er liten (< 10 pN). (F) Hendelser av dårlig kvalitet som bør forkastes: (i) Ingen vedheft; (ii) Dataoscillasjon; (iii) Data som driver hele tiden; (iv) Diskontinuerlige data; (v) Kompressiv kraft for liten (≈ 0 pN); (vi) Flere obligasjoner; (vii) Ugyldige data med avledet kmol < 0; (viii) Signalfeil. Null kraft indikeres av den grå periodiske linjen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oppsummert har vi gitt en detaljert dataanalyseprotokoll for forhåndsbehandling av DFS-rådata og avlede molekylære vårkonstanter i analysemodusene BFP Bead-Bead og Bead-Cell. Biomekaniske modeller og ligninger som kreves for å bestemme molekylære og cellulære vårkonstanter presenteres. Selv om forskjellige integriner studeres, har kmol målt ved Bead-Bead-modus og Bead-Cell-modus betydelige områdeforskjeller ( Figur3A vs. Figur 3C). Vær oppmerksom på at med Bead-Bead-modus er reseptoren kovalent knyttet til glassperlen. I motsetning til Bead-Cell-modusen er overflatereseptoren tilpasset av den underliggende plasmamembranen og cytoskeletonene, som mest sannsynlig påvirker den målte kmol.
Datakvalitetskontroll er avgjørende for å sikre reproduserbarheten. For dette formål har vi implementert DFS-dataene før screening og ytre eksklusjonskriterier på Force vs. Time-plottene. For å demonstrere dette ble et representativt datasett valgt, der vi kategoriserte DFS-rådata i tre kvalitetsnivåer: God (Figur S2A), Akseptabelt med støy (Figur S2B) og Dårlig uakseptabelt (Figur S2C). For nybegynnere som bruker BFP, anbefaler vi de strenge kriteriene for å forhåndsscreene dataene med god kvalitet (Figur S2A). Vær oppmerksom på at basert på dataenes pre-screening-kriterier, bør regresjonstilpasningslinjen til kompresjonsfasen være brattere enn for strekkfasen, spesielt k1 > k2 ( FigurS2C, vii). Målt k1 < k2 ( FigurS2C, vii), er den avledede kmol < 0 mot begrunnelsen per beregning i trinn 4. Slike hendelser bør da betraktes som de ugyldige outliers og forkastes.
For å favorisere BFP-målingen på enmolekylært nivå under datainnsamling, har flere eksperimentelle konfigurasjoner blitt implementert i henhold til tidligere studie12. For det første titreres proteinbeleggtetthet på perler vanligvis ned til et minimalt nivå (f.eks. 60 μm-2) ved å kontrollere løsningskonsentrasjonen, mengden protein og reaksjonsbetingelser15. Den gjennomsnittlige romlige avstanden mellom proteiner på perlen er dermed estimert mye større enn proteinets lineære dimensjoner, og favoriserer våre målinger på enkeltmolekylelt nivå12,13,14. For det andre kontrollerer vi adhesjonsfrekvensen for hvert ligandreseptorpar ≤ 20%, under hvilke molekylære bindingshendelser vil følge Poisson-distribusjon som forutsier ≥ 89% av hendelsene vil være enmolekylær binding14,15. For å oppnå det, er impingement kraft og kontakttid satt tilsvarende og må være konsekvent gjennom hele eksperimentet12. Likevel er det fortsatt mulig at flere obligasjoner forekommer sekvensielt (Figur S2C, vi). I slike tilfeller vil vi forkaste hendelsene med signaturer av flere obligasjoner. Sist, men ikke minst, vil negative kontrolleksperimenter bli utført med perler belagt med bovint serumalbumin (Table of Materials) eller SA alene for å sikre at den ikke-spesifikke vedheftsfrekvensen er ≤ 2%16,17.
Selv om BFP er kraftig for å undersøke proteindynamikk på levende celle overflate10,11,12, er det tekniske begrensninger. I BFP kan bare ett ligandreseptorpar undersøkes om gangen. Det ville være tidkrevende å innhente tilstrekkelige data med statistisk signifikans. Dessuten er de eksperimentelle prosedyrene arbeidsintensive med bratte læringskurver. Implementeringsmessig er det nåværende BFP-systemet utsatt for miljødrift og omkringliggende mekanisk vibrasjon. Som et resultat er det nødvendig med kontinuerlig manuell justering for å sikre DFS-datakvaliteten. For dette formålet har en av våre nylige studier introdusert ultrastabile BFP-feedback control-algoritmer for å forbedre stabiliteten til BFP force-clamp DFS-analysene4. Dette tekniske fremskrittet muliggjør målinger av sterkere molekylær interaksjon som antigen-antistoffbinding med ultralang bindingstid (>50 s). Likevel forutser vi fremtidig innsats for å automatisere og integrere BFP-datainnsamlingen og DFS-analysen i ett datastyrt program, noe som gjør hele BFP-operasjonen og dataanalysen mer brukervennlig og høy gjennomstrømning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende interesser å rapportere om den nåværende studien.
Acknowledgments
Vi takker Guillaume Troadec for nyttig diskusjon, Zihao Wang for maskinvarekonsultasjon, og Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning og Simon Ringer for støtte til vår lab-oppstart. Dette arbeidet ble støttet av Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator Prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.), og University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund og Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju er en australsk forskningsråd DECRA fellow (DE190100609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
- Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
- An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
- Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C.
- Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886 (2014).
- Passam, F., et al.
- Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
- Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447 (2016).
