Summary
Una sonda de fuerza de biomembrana (BFP) es una técnica de espectroscopia de fuerza dinámica in situ (DFS). BFP se puede utilizar para medir la constante de resorte de las interacciones moleculares en las células vivas. Este protocolo presenta análisis constantes de resorte para enlaces moleculares detectados por BFP.
Abstract
Una sonda de fuerza de biomembrana (BFP) ha surgido recientemente como una nanoherramienta de espectroscopia de fuerza dinámica (DFS) de superficie celular nativa o in situ que puede medir la cinética de unión molecular única, evaluar las propiedades mecánicas de las interacciones ligando-receptor, visualizar los cambios conformacionales dinámicos de proteínas y dilucidar de manera más emocionante los mecanismos de menosensión celular mediados por el receptor. Más recientemente, BFP se ha utilizado para medir la constante de resorte de los enlaces moleculares. Este protocolo describe el procedimiento paso a paso para realizar el análisis DFS constante de resorte molecular. Específicamente, se discuten dos modos de operación BFP, a saber, los modos Bead-Cell y Bead-Bead. Este protocolo se centra en derivar constantes de resorte del enlace molecular y la célula a partir de datos brutos de DFS.
Introduction
Como una técnica de DFS de células vivas, BFP diseña un glóbulo rojo humano (RBC; Figura 1) en un transductor de fuerza ultrasensible y sintonizable con un rango constante de resorte compatible a 0.1-3 pN/nm1,2,3. Para sondear la interacción ligando-receptor, BFP permite mediciones de DFS a ~1 pN(10 -12 N), ~3 nm(10 -9 m) y ~0.5 ms (10-3 s) en resolución de fuerza, espacial y temporal4,5. Su configuración experimental consiste en dos micropipetas opuestas, a saber, la sonda y el objetivo. La micropipeta de la sonda aspira un glóbulo rojo y una cuenta se pega en su ápice a través de una interacción biotina-estreptavidina. La cuenta está recubierta con el ligando de interés(Figura 1A). La micropipeta objetivo aspira una célula o una cuenta que lleva el receptor de interés, correspondiente a los modos Bead-Cell (Figura 1B) y Bead-Bead (Figura 1C), respectivamente5.
La construcción de BFP, el montaje y los protocolos experimentales DFS se describieron en detalle anteriormente1,6. Brevemente, un ciclo táctil BFP consta de 5 etapas: Aproximación, Incidente, Contacto, Retracción y Disociación(Figura 1D). La posición horizontal del ápice de RBC se denota como ΔxRBC. Al principio, la deformación de RBC no astresada (fuerza cero) ΔxRBC es 0 (Tabla 1). El objetivo es entonces impulsado por un piezotraduclador para inmisionar y retraerse de la cuenta de sonda (Figura 1D). La sonda RBC es comprimida primero por el Target con deformación negativa de RBC ΔxRBC < 0. En un evento de Bond, la etapa de retracción pasa de una fase compresiva a una fase de tracción con deformación positiva deRBC ΔxRBC > 0 ( Figura2C y D). De acuerdo con la ley de Hooke, la fuerza de soporte BFP puede medirse como F = kRBC × ΔxRBC, donde kRBC (Tabla 1)es la constante de resorte RBC del BFP. Tras la ruptura del enlace y la finalización de un ciclo de toque, la cuenta de sonda vuelve a la posición de fuerza cero con ΔxRBC = 0 (Figura 1D).
Para determinar el kRBC,medimos y registramos los radios del orificio interno de la micropipeta de la sonda (Rp), el RBC (R0) y el área de contacto circular (Rc) entre el RBC y la cuenta de la sonda ( Figura1A). Luego se calcula kRBC de acuerdo con el modelo de Evan (Eq. 1)7,8 utilizando un programa LabVIEW que actúa como un instrumento virtual (VI) para operar el BFP(Figura S1A)8,9.
(Eq. 1)
Con un BFP establecido y datos brutos DFS obtenidos, a continuación presentamos cómo analizar la constante de resorte del par ligando-receptor o células. Los datos brutos de DFS sobre la interacción de la proteína glicosilada Thy-1 y la integrina portadora de células K562 α5β1 (Thy-1-α5β1; Figuras 3A y 3B)10 y la de la integrina recubierta de fibrinógeno y cuentas αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figura 3C) 11,12 se han utilizado para demostrar los modos de análisis Bead-Cell y Bead-Bead, respectivamente.
Preparación experimental BFP
Para obtener detalles sobre la preparación experimental y la instrumentación de BFP, consulte los protocolos publicados anteriormente3. En resumen, los glóbulos rojos humanos se han biotinilado utilizando la biotina-PEG3500-NHS en el tampón de carbono / bicarbonato. Las proteínas de interés se han acoplado covalentemente a las perlas de vidrio de borosilicato utilizando MAL-PEG3500-NHS en el tampón de fosfato. Para adherirse al RBC biotinilado, la perla de la sonda también está recubierta con estreptavidina (SA) utilizando el MAL-SA. Consulte la Tabla de materiales y la Tabla 2.
Para ensamblar el BFP(Figura 1, izquierda),se utilizará la tercera micropipeta denominada 'Ayudante' para entregar la cuenta de sonda y pegarla al vértice1,3del RBC. La interacción covalente entre la cuenta de sonda recubierta de SA y los glóbulos rojos biotinilados es mucho más fuerte que el enlace ligando-receptor de interés. Por lo tanto, la etapa disociada puede interpretarse como la ruptura del enlace ligando-receptor en lugar del desprendimiento de la cuenta de sonda del RBC.
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Protocol
1. Obtener eventos DFS analizables
- Inicie el experimento en el software (por ejemplo, LabVIEW VI) para el control BFP y la configuración de parámetros(Figura S1A).
- Observe los toques repetitivos de perlas/celdas de la sonda en el software para BFP Monitor(Figura S1B).
- Pruebe y logre la frecuencia de adhesión ≤ 20% dentro de los primeros 50 toques ajustando la fuerza de pinzamiento y el tiempo de contacto, por lo que se asegura que ≥ el 89% del evento de adhesión DFS esté mediado por enlaces simples12,13,14.
NOTA: Para cada par Bead-Cell/Bead, realizamos 200 ciclos táctiles repetitivos. Para obtener la calidad de los datos publicables, generalmente realizamos n ≥ 3 pares Bead-Bead o Bead-Cell.- Guarde los datos, en forma de Fuerza vs. Tiempo, en la carpeta dirigida por el usuario al final de cada par, según lo solicite el software para el control BFP y la configuración de parámetros.
- Recopile los datos brutos de Fuerza vs. Tiempo de los eventos de Bond, como se ejemplifica en la Figura 2A,utilizando la plataforma de adquisición BFP(Figura S1C).
- Abra el software de análisis de datos BFP. Haga clic en el icono de la carpeta amarilla y seleccione el archivo de datos sin procesar correspondiente haciendo doble clic en ellos.
- Ejecute el programa y, a continuación, haga clic en el botón arriba y abajo para cambiar entre eventos. Utilice los criterios de exclusión de valores atípicos (Figura S2) para descartar eventos no válidos. Seleccione el tipo de datos de exportación como formato Fuerza vs. Tiempo y haga clic en el botón Exportar datos de gráficos.
2. Convierta la curva fuerza vs. tiempo a la curva Fuerza vs. Desplazamiento
- Exporte el segmento de datos correspondiente a la etapa de retracción a una hoja de cálculo(Figura 2A, marquesina cuadrada),que es relevante para el análisis de constantes de resorte.
- Traza la curva de fuerza vs. tiempo usando un software de hoja de cálculo. Para obtener la curva Fuerza vs. Desplazamiento, convierta los valores de tiempo(Figura 2A,eje x)a los valores de desplazamiento total (Δxtot)multiplicando los valores de tiempo con la velocidad de movimiento piezoeléctrico (es decir, 4.000 nm/s por preset).
- Cero el primer punto de datos restando el valor de desplazamiento más pequeño de cada valor de desplazamiento adquirido. Esta transformación horizontal no afecta a las pendientes ascendentes de la etapa de retracción ni al cálculo posterior de la constante de resorte.
- En particular, el BFP se considera como un sistema de resorte en serie en el que Δxtot (Tabla 1) suman las deformaciones del RBC, ΔxRBC (Tabla 1), el enlace molecular, Δxmol (Tabla 1), y la célula objetivo, Δxcelda (Tabla 1), como el Eq. 2:
(Eq. 2) - Grafíe la curva Fuerza (F) vs. Desplazamiento (Δxtot) como se muestra en la Figura 2B.
(Eq. 2)3. Análisis de Cnstant de resorte del modo de celda de perla
- En la curva Fuerza vs. Desplazamiento, se pueden identificar dos pendientes distintas, donde cada una puede representar la fase de compresión y la fase de tracción. Ajuste una línea de regresión a cada grupo de datos (Figura 2B), donde la pendiente de ajuste lineal más grande representa la constante total del resorte en fase de compresión (Figura 2B, rojo), denotada como k1 (Tabla 1); y la pendiente de ajuste lineal más pequeña representa la constante total del resorte en fase tensilla(Figura 2B, azul),denotada como k2 (Tabla 1).
- Para los resortes conectados en serie por la descripción del paso 2.2, exprese el recíproco de la constante de resorte total, ktot (Tabla 1), como la suma de los inversos constantes de resorte de RBC, kRBC (Tabla 1), el enlace molecular, kmol (Tabla 1), y la celda objetivo, kcelda (Tabla 1). Durante la fase de compresión del modo Bead-Cell, el enlace molecular no se estira, porlo tanto, kmol no se tiene en cuenta. El recíproco del ktot en este escenario (1/k1) se expresa como
(Eq. 3).
En los datos de ejemplo, kRBC está predeterminado (0,25 pN/nm de forma predeterminada). kcelda se puede derivar de la Eq. 3 con el k1 adquirido y kRBC ( Figura3B). - Durante la fase de tracción, se forma adhesión entre el par ligando-receptor. Expresar el recíproco del ktot en este escenario (1/k2) como
(Eq. 4)
donde k2 (Tabla 1) representa la constante total de resorte durante la fase de tracción. - Derive kmol de restar 1/k1 de 1/k2 (compare Eq. 3 vs. Eq. 4).
(Eq. 3).
(Eq. 4)4. Análisis constante de resorte del modo de cuentas
- Ajuste una línea de regresión a los datos de la fase de compresión para obtener k1 (similar a la Figura 2B, rojo). Cabe destacar que, en el modo Perla-Perla, la célula diana es reemplazada por una cuenta de vidrio recubierta con el receptor de interés(Figura 1C). Dado que la deformación de la perla es insignificante, el términode celda 1 /kse puede eliminar de los Eq. 3 y Eq. 4 en consecuencia. El ktot recíproco de la fase compresiva (1/k1) puede expresarse como:
(Eq. 5) - Ajuste una línea de regresión a los datos de la fase de tracción para obtener k2 (similar a la Figura 2B, azul). El ktot recíproco de la fase de tracción (1/k2) puede expresarse como:
(Eq. 6) - Derive kmol de restar 1/k1 de 1/k2 (compare Eq. 5 vs. Eq. 6).
(Eq. 5)
(Eq. 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En este trabajo, hemos demostrado el protocolo del análisis de constantes de resorte BFP. Para el modo de análisis Bead-Cell, se analizó el kmol del enlace molecular entre la proteína glicosilada Thy-1 recubierta en la cuenta probe y la integrina α5β1 expresada en la célula Target K562 (Thy-1-integrina α5β1; Figura 3A) 10. Lacelda ktambién se deriva del modo Bead-Cell (K562 Cell; Figura 3B). Para el modo Bead-Bead, el enlace molecular formado entre fibrinógeno e integrina αIIbβ3 (FGN-integrina αIIbβ3; Figura 3C) 11,12 se utiliza para demostrar el modo de análisis Bead-Bead.
Para el modo Bead-Cell, medimos las constantes de resorte de Thy-1-integrina αenlace 5β1 y la celda K562 como kmol = 0.45 ± 0.28 pN / nm ( Figura3A) y kcelda = 0.18 ± 0.07 pN / nm (Figura 3B) a partir de 27 eventos analizables preseleccionados. Para el modo Bead-Bead, medimos las constantes de resorte de FGN-integrina αIIbβenlace 3 como kmol = 0.53 ± 0.29 pN / nm (Figura 3C) a partir de 33 eventos analizables preseleccionados.
| Símbolo | Definición | Símbolo | Definición |
| Δxtot | El desplazamiento total del piezo, que también puede interpretarse como la deformación total de los glóbulos rojos, la célula diana y el enlace molecular. | ΔxRBC | La deformación de RBC, que también puede interpretarse como el desplazamiento de la cuenta de sonda. |
| ktot | La constante total de resorte de todo el sistema de resorte serie BFP. | kRBC | La constante de resorte del RBC aspirado por la micropipeta probeta. |
| kmol | La constante de resorte del enlace molecular detectado por BFP | celda k | Constante de resorte de la celda Target. |
| k1 | ktot de la fase de compresión en la etapa de retracción. | k2 | ktot de la fase de tracción en la etapa de retracción. |
| ΔF1 | El incremento de fuerza detectada por la cuenta de sonda en la fase de compresión. | ΔF2 | El incremento de la fuerza detectada por la cuenta de sonda en la fase de tracción. |
| Δx1 | Incremento del desplazamiento en la fase compresiva. | Δx2 | El incremento del desplazamiento en la fase de tracción. |
Tabla 1. Definiciones de símbolos para el análisis de constantes de resorte molecular BFP. Las posiciones horizontales de todos los objetos se definen como x, mientras que Δx [nm] se refiere a la deformación relativa a la posición original. ΔF [pN] se refiere al incremento de fuerza medido por BFP. k [pN/nm] se refiere a la constante de resorte. Los subíndices 1 y 2 corresponden a las fases de compresión y tracción, respectivamente. La constante de resorte molecular se deriva de la Fuerza (F) vs. Curva de desplazamiento (Δxtot).
Figura 1:Configuración de BFP y ciclo táctil DFS. (A) El sistema BFP ensambla dos micropipetas opuestas, a saber, la sonda(izquierda)y la diana(derecha). La micropipeta de la sonda aspira un RBC(rojo)con una cuenta de vidrio pegada en su ápice para servir como transductor de fuerza. La micropipeta Target aspira una célula portadora de receptores(azul). La constante de resorte RBC (kRBC) está determinada por la presión de aspiración (Δp) y los radios de RBC aspirado (R0), micropipeta de sonda (Rp) y área de contacto circular (Rc) entre el RBC y la cuenta de sonda. (B y C) Micrografías de los modos BFP Bead-Cell (B) y Bead-Bead (C). Barras de escala = 5 μm. (D) Un ciclo táctil BFP que consiste en las etapas de aproximación, incónsiono, contacto, retracción y disociación. La línea de guión ΔxRBC = 0 indica la posición BFP no astresada o de fuerza cero. La etapa de retracción incluye fase de compresión (ΔxRBC < 0, rojo),posición de fuerza cero (ΔxRBC = 0, negro)y fase de tracción (ΔxRBC > 0, azul)en secuencia. La flecha negra indica la posición del evento Bond. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Derivar constantes de resorte molecular a partir de datos brutos DFS. (A) Fuerza representativa (F) vs. Curva de tiempo (t) de datos brutos DFS en un ciclo táctil BFP. (B) Fuerza convertida representativa (F) vs. Desplazamiento (Δxtot) curva que representa la etapa de retracción. k1 y k2 representan la pendiente de ajuste de las fases consecutivas de compresión y tracción respectivamente. ΔF1 y ΔF2 representan los incrementos de fuerza en la fase de compresión y los datos de la fase de tracción, respectivamente, donde Δx1 y Δx2 representan los incrementos de desplazamiento en los datos de fase de compresión y fase de tracción, respectivamente. Losvalores de R2 para la constante de resorte durante la etapa de compresión (R12) y la fase de tracción (R22) se etiquetan en el gráfico para indicar una buena aptitud estadística. (C y D) Ilustraciones de la etapa de retracción en los modos experimentales Bead-Cell (C) y Bead-Bead (D). kRBC representa la constante de resorte de RBC; kcélula y kmol representan las constantes de resorte de la célula diana y el enlace molecular, respectivamente. Durante la fase de tracción, la adhesión se forma entre el par ligando-receptor, el RBC se desvía en la misma dirección que el piezo se retrae más allá de la posición de fuerza cero (ΔxRBC > 0). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Histogramas representativos de constantes de resorte medidas por BFP. El número de evento(eje y izquierdo)y la distribución de frecuencia(eje y derecho)de las constantes de resorte medidas para Thy-1-integrina αenlace 5β1 (A) y K562 Celda objetivo (B) en el modo Bead-Cell y FGN-integrina αIIbβenlace 3 (C) en el modo Bead-Bead. Los histogramas se ajustan a la curva de distribución gaussiana(rosa)y el parámetro estadístico, R2,se utiliza para indicar la fuerza de la aptitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S1: La interfaz BFP casera. (A) Interfaz de control BFP y configuración de parámetros. Los parámetros para determinar la constante de resorte RBC se ingresan desde el panel de parámetros biofísicos. B) Supervisión del BFP. Los ciclos táctiles BFP en vivo se observarán desde esta vista de cámara. (C) Interfaz de análisis BFP DFS donde las curvas Fuerza (F) vs. Tiempo (t) se revisan fuera de línea y se prepueces para el posterior análisis constante de resorte molecular. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura S2. Control de calidad de datos analizables BFP y criterios de preselección. (A) Buenos eventos DFS con alta calidad: (i) evento de fuerza de ruptura de Bead-Cell; ii) Evento de vida útil de Bead-Cell; iii) Evento de fuerza de ruptura de perlas-perlas; (iv) Evento de por vida de Bead-Bead. (B) Eventos DFS aceptables con algo de ruido: (i) Deriva de datos pero la etapa de retracción de zoom sigue siendo válida; (ii) Ligera deriva de datos después de la disociación del enlace; iii) Torcedura de datos en el régimen de fuerza cero; iv) La fuerza de retención es pequeña (< 10 pN). (C) Eventos de mala calidad que deben descartarse: (i) Sin adhesión; ii) Oscilación de los datos; iii) Datos a la deriva todo el tiempo; iv) Datos discontinuos; v) Fuerza de compresión demasiado pequeña (≈ 0 pN); vi) Fianzas múltiples; vii) Datos no válidos con kmol derivado < 0; (viii) Error de señal. La fuerza cero se indica mediante la línea intermitente gris. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En resumen, hemos proporcionado un protocolo detallado de análisis de datos para preprocesar los datos brutos de DFS y derivar constantes de resorte molecular en los modos de análisis BFP Bead-Bead y Bead-Cell. Se presentan los modelos biomecánicos y las ecuaciones necesarias para determinar las constantes de resorte moleculares y celulares. Aunque se estudian diferentes integrinas, el kmol medido por el modo Bead-Bead y el modo Bead-Cell posee diferencias de rango significativas(Figura 3A vs. Figura 3C). Cabe destacar que, con el modo Bead-Bead, el receptor está unido covalentemente a la cuenta de vidrio. En contraste, con el modo Bead-Cell, el receptor de superficie está adaptado por la membrana plasmática subyacente y los citoesqueletos, que probablemente influyen en el kmolmedido.
El control de calidad de los datos es crucial para garantizar la reproducibilidad. Con este fin, hemos implementado los criterios de preselección de datos DFS y exclusión de valores atípicos en las gráficas Force vs. Time. Para demostrar esto, se seleccionó un conjunto de datos representativo, en el que categorizamos los datos brutos de DFS en tres niveles de calidad: Bueno (Figura S2A), Aceptable con ruido (Figura S2B) y Pobre inaceptable (Figura S2C). Para los principiantes en el uso del BFP, recomendamos los criterios estrictos para preseleccionar los datos con la Buena calidad (Figura S2A). Cabe destacar que, sobre la base de los criterios de preselección de datos, la línea de ajuste de regresión de la fase de compresión debe ser más pronunciada que la de la fase de tracción, específicamente k1 > k2 (Figura S2C,vii). Cuando se mide k1 < k2 (Figura S2C,vii), el kmol derivado < 0 va en contra de la justificación por cálculo en el paso 4. Tales eventos deben considerarse como valores atípicos no válidos y descartarse.
Para favorecer la medición de BFP a nivel molecular único durante la adquisición de datos, se han implementado múltiples configuraciones experimentales según estudio previo12. En primer lugar, la densidad del recubrimiento de proteínas en las perlas generalmente se titula a un nivel mínimo (por ejemplo, 60 μm-2) controlándoloestrictamente la concentración de la solución, la cantidad de la proteína y las condiciones de reacción15. La distancia espacial promedio entre las proteínas en la cuenta se estima así mucho mayor que las dimensiones lineales de la proteína, favoreciendo nuestras mediciones sobre el nivel molecular único12,13,14. En segundo lugar, controlamos la frecuencia de adhesión para cada par ligando-receptor ≤ 20%, bajo el cual los eventos de unión molecular seguirán la distribución de Poisson prediciendo ≥ el 89% de los eventos serían de unión molecular única14,15. Para lograrlo, la fuerza de pinzamiento y el tiempo de contacto se establecen en consecuencia y deben ser consistentes a lo largo del experimento12. Sin embargo, todavía es posible que se produzcan múltiples enlaces secuencialmente(Figura S2C,vi). En tales casos, descartaremos los eventos con firmas de múltiples bonos. Por último, pero no menos importante, los experimentos de control negativo se realizarán con perlas recubiertas con albúmina sérica bovina(Tabla de Materiales)o SA sola para garantizar que la frecuencia de adhesión inespecífico sea ≤2% 16,17.
Aunque BFP es potente para investigar la dinámica de proteínas en la superficie de células vivas10,11, 12,existen limitaciones técnicas. En BFP, solo se puede investigar un par ligando-receptor a la vez. Llevaría mucho tiempo obtener datos suficientes con significación estadística. Además, los procedimientos experimentales son intensivos en mano de obra con curvas de aprendizaje pronunciadas. En cuanto a la implementación, el sistema BFP actual es susceptible a la deriva ambiental y la vibración mecánica circundante. Como resultado, se requiere un ajuste manual continuo para garantizar la calidad de los datos DFS. Con este fin, uno de nuestros estudios recientes ha introducido algoritmos de control de retroalimentación BFP ultraestablos para mejorar la estabilidad de los ensayos DFS de pinza de fuerza BFP4. Este avance técnico permite mediciones de una interacción molecular más fuerte, como la unión antígeno-anticuerpo con una vida útil de enlace ultra larga (>50 s). Sin embargo, prevemos que se realizarán esfuerzos futuros para automatizar e integrar la adquisición de datos BFP y el análisis DFS en un programa computarizado, haciendo que toda la operación BFP y el análisis de datos sean más fáciles de usar y de alto rendimiento.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos que informar con respecto al presente estudio.
Acknowledgments
Agradecemos a Guillaume Troadec por la útil discusión, a Zihao Wang por la consulta de hardware y a Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning y Simon Ringer por el apoyo a nuestra startup de laboratorio. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Descubrimiento del Consejo australiano de Investigación (DP200101970 - L.A.J.), el Programa de Desarrollo de Capacidades Cardiovasculares de NSW (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), el premio Sydney Research Accelerator (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.), y The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju es miembro del Consejo Australiano de Investigación DECRA (DE190100609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
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