Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إعداد غشاء البلازما على نطاق صغير لتحليل المبيضات albicans Cdr1-mGFPHis

Published: June 13, 2021 doi: 10.3791/62592
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

تقدم هذه المقالة بروتوكول عزل غشاء البلازما على نطاق صغير لتوصيف المبيضات albicans ABC (ATP ملزمة كاسيت) البروتين Cdr1، مفرط التعبير في Saccharomyces cerevisiae. تم تصميم علامة مزدوجة من طراز protease-cleavable C-terminal mGFPHis مع وصلة من 16 بقايا بين Cdr1 والعلامة لتسهيل تنقية وفحص المنظفات من Cdr1.

Abstract

يعتمد التوصيف الكيميائي الحيوي والبيوفيزيائي الناجح لناقلات ABC بشكل كبير على اختيار نظام التعبير heterologous. على مدى العقدين الماضيين، قمنا بتطوير منصة التعبير عن بروتين غشاء الخميرة التي تم استخدامها لدراسة العديد من البروتينات الغشاء الفطرية الهامة. يتم حذف التعبير المضيف Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ في سبع ناقلات ABC الذاتية الرئيسية ويحتوي على عامل النسخ Pdr1-3 مع طفرة في اكتساب الوظيفة التي تمكن من التعبير الزائد التأسيسي لجينات بروتين الغشاء heterologous متكاملة بشكل ثابت كنسخ واحدة في مكان PDR5 الجينومي. إن إنشاء ناقلات بلازميد متعددة الاستخدامات وتحسين استراتيجيات الاستنساخ من خطوة واحدة يمكن من الاستنساخ السريع والدقيق ، والتطين ، والتعبير عن ناقلات HETEROLOGOUS ABC. هنا، ونحن نصف تطوير واستخدام رواية protease-cleavable mGFPHis علامة مزدوجة (أي الخميرة أحادية الألوان تعزيز البروتين الفلوري الأخضر yEGFP3 تنصهر إلى علامة تنقية تقارب الستة الهستيدين) التي تم تصميمها لتجنب التدخل المحتمل للوسم مع البروتين من الفائدة وزيادة الكفاءة الملزمة للوسم له لراتنجات النيكل تقارب. إن دمج mGFPHis إلى بروتين الغشاء ORF (إطار القراءة المفتوح) يتيح سهولة تحديد كمية البروتين من خلال فحص المواد الهلامية البولي أكريلاميد والكشف عن منتجات التدهور التي تحتفظ بعلامة mGFPHis. نحن نظهر كيف تسهل هذه الميزة فحص المنظفات لتليين بروتين الغشاء. يتم تقديم بروتوكول لعزل فعالة وسريعة وموثوق بها من الاستعدادات غشاء البلازما على نطاق صغير من C-الميؤوس من شفائها المبيضات albicans متعددة المخدرات efflux الناقل Cdr1 مفرط التعبير في S. cerevisiae ADΔΔ. يولد بروتوكول عزل غشاء البلازما هذا على نطاق صغير أغشية بلازما عالية الجودة في غضون يوم عمل واحد. يمكن استخدام مستحضرات غشاء البلازما لتحديد أنشطة إنزيمات المتغيرات المتحولة Cdr1 و Cdr1.

Introduction

استخراج بروتينات الأغشية المتكاملة من بيئتها الدهنية الأصلية يمكن أن تؤثر بشكل كبير على هيكلها ووظيفتها1،2،3،4. التركيب الدهني المعقد للأغشية البيولوجية5 يضمن أن التفاعلات الهامة للغاية بين البروتين والدهون يمكن أن تحدث6. تحافظ الدهون على السلامة الهيكلية لبروتينات الأغشية ، مما يمكنها من العمل بشكل صحيح في وجهة (ق) مقصورة الغشاء الخاصة بها7،8. لذلك ، فإن الخطوة الأولى الحاسمة في تنقية بروتين الغشاء هي استخراج البروتين من بيئته الأصلية دون التأثير على بنيته و / أو وظيفته.

هناك العديد من العقبات التي تحول دون توصيف بنية بروتينات الأغشية ، ومعظمها يتعلق بطبيعتها الكارهة للماء ، وصعوبات التعبير عن بروتينات الأغشية المطوية والوظيفية بشكل صحيح بالكميات المطلوبة لتصوير البلورات بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM)9و10و11و12. هناك ثلاثة أنواع من أنظمة التعبير البروتيني الغشائي:متجانسة 9، heterologous13،14،15، ونظم التعبير في المختبر 16،17. مستويات التعبير المنخفضة في كثير من الأحيان ، أو التكاليف الباهظة ، للعديد من أنظمة التعبير لا تترك سوى عدد قليل من المضيفين كخيار مفضل لإنتاج بروتينات الأغشية. وهي تشمل المضيف البكتيري ، الإشريكية القولونية، والخمائر S. cerevisiae وPichia pastoris، وeukaryotes أعلى مثل خلايا الحشرات Sf9 أو خطوط خلايا الثدييات18. جميع تقنيات التعبير عن البروتين الغشاء لها مزايا وعيوب. ومع ذلك، S. cerevisiae هو ربما أفضل دراسة كائن حي نموذج eukaryotic مناسبة لإنتاج البروتين الغشاء. هو متعدد الاستخدامات للغاية مع التطبيقات في الهندسة الوراثية، واكتشاف المخدرات، والبيولوجيا الاصطناعية، والتعبير عن بروتينات الغشاء eukaryotic14،19،20،21.

في هذه الدراسة، تم استخدام براءة اختراع S. cerevisiae غشاء البروتين التعبير التكنولوجيا21، مع S. cerevisiae ADΔ14 و ADΔΔ22 كمضيفين المفضل(الشكل 1A)،إلى الإفراط في التعبير ودراسة الرئيسية C. albicans مضخة efflux متعددة المخدرات Cdr1. كل من سلالات S. cerevisiae هي مشتقات AD1-8u- 23 التي تحتوي إما على ura3 (ADΔ) أو كل من جينات ura3 و his1 (ADΔΔ) المحذوفة للقضاء على أي uracil إيجابي زائف أو محولات الهستيدين الأولية الناشئة من خلال التكامل غير المرغوب فيه في URA3 أو loci الجينوم HIS1. حذف مضخات efflux 7 الرئيسية متعددة المخدرات23، المشار إليها في الشكل 1A، يجعل ADΔΔ حساسة بشكل رائع لمعظم xenobiotics. مكسب من وظيفة معامل النسخ المتحول Pdr1-3 يسبب التعبير الزائد التأسيسية من البروتينات غشاء heterologous مثل Cdr1 (المثمنات الحمراء في الشكل 1A)بعد دمج كاسيت التحول heterologous-ORF التي تحتوي على (الشكل 1A) في الموضع PDR5 الجينومي (المستطيل الأزرق في الشكل 1A) عن طريق اثنين من أحداث إعادة التركيب متجانسة. يمكن تأكيد توطين غشاء البلازما المناسب لبروتينات MGFPHis الموسومة C-terminally عن طريق المجهر الكونفوجال(الشكل 1A)، ويمكن استخدام العلامة الخاصة به لتنقية تقارب النيكل للبروتين الموسوم. غير أن استنساخ بعض ناقلات ABC الفطرية (مثل المبيضات krusei ABC1)إلى البلازميدات المشتقة من pABC3 لم يكن ممكنا لأنه لم يكن من الممكن نشرها في الإشريكية القولونية بسبب سمية الخلية. هذا دفع إلى تطوير استنساخ خطوة واحدة من البروتينات الغشائية14،24 الموسومة إما في N - أو C - terminus مع تقارب مختلف ، epitope ، أو مراسل العلامات مباشرة إلى S. cerevisiae ADΔΔ (الشكل 1C). س. سيريفيسياي ADΔΔ سلالات التعبير عن مختلف المسوخ CDR1 يمكن أيضا أن تنشأ بكفاءة بهذه الطريقة باستخدام ما يصل إلى خمسة شظايا PCR الفردية التي تتداخل من قبل 25 نقطة أساس (الشكل 1C). باستخدام هذا البروتوكول، يمكن استنساخ العديد من ORFs ذات الأهمية، والتعبير عنها، ووصفها بتكلفة منخفضة وكفاءة عالية في غضون فترة زمنية قصيرة جدا. كفاءة التحول يقلل فقط ~ 2 أضعاف مع كل جزء PCR إضافية.

إذا رغبت في ذلك، يمكن أيضا أن يتم التلاعب مستويات التعبير بسهولة من قبل تصميم التمهيدي لضبط مستويات التعبير المتوقع وصولا الى أي مكان بين 0.1٪-50٪ من مستويات التعبير عادة عالية، التأسيسية25. الأمثل، متعدد الوظائف، pABC314 ناقلات استنساخ مشتق، pABC3-XLmGFPHis26 (الشكل 1B) يحتوي على موقع شق بروتياز HRV-3C (X؛ ليفلفك| سباق الجائزة الكبرى), بروتياز أن أداء أفضل في 4 °C من فيروس التبغ حفر المستخدمة بشكل متكرر (TEV) بروتياز27. L هو خمسة الأحماض الأمينية (GSGGS) الرابط، mGFP هو متحولة أحادية (A206K)28،29 نسخة من الخميرة تعزيز البروتين الأخضر الفلوري البديل yEGFP330،وله هو ربط الأحماض الأمينية الثلاثة (GGS) تليها ستة الهستيدين (HHHHHH) النيكل تقارب البروتين الوسم.

وقد استخدمت هذه التكنولوجيا التعبير بنجاح في اكتشاف المخدرات ودراسة البروتينات الغشاء. تم حل الهيكل الأول لهدف عقار أزول الفطري ، S. cerevisiae Erg1131، باستخدام هذه التكنولوجيا. كما مكنت من التوصيف المفصل ل C. albicans Cdr132،33،34 وإنشاء جزيء Cdr1 ناقص السيستين35 مناسب للدراسات المترابطة السيستين للتحقق من أي بنية عالية الدقة في المستقبل. العديد من ناقلات ABC الأخرى من مسببات الأمراض الفطرية البشرية الرئيسية (أي، C. albicans، المبيضات glabrata، المبيضات أوريس، المبيضات krusei، المبيضات استخدام، Cryptococcus neoformans، أسبيرجيلوس fumigatus، البنسليوم marneffei، ومجمع الأنواع سوساريوم سولاني) كما درست بالتفصيل باستخدام هذا التعبير منصة24،36،37،38،39. وقد مكن هذا من توليد لوحة من سلالات S. cerevisiae overexpressing مضخات efflux التي تم استخدامها في شاشات عالية الإنتاجية لاكتشاف رواية الفلورسنت efflux مضخة ركيزة النيل الأحمر40 ومحددة 41 وواسعة الطيف14,33,42,43,44 مثبطات مضخة efflux. استخدام هذا النظام مكن أيضا من اكتشاف clorgyline كأول من نوعه واسع الطيف الفطرية متعددة الأدوية efflux مضخة المانع42.

solubilization كاملة من البروتينات الغشاء وإنشاء غشاء متجانس البروتين- micelle إعداد خالية من الدهون الذاتية، ويتطلب تركيزات المنظفات عالية45. ولكن للأسف، وهذا أيضا في كثير من الأحيان تعطيل البروتين غشاء5،8،45،46. تتأثر خصائص مونومرات المنظفات وتجميعها في المحلول بالخصائص الفيزيائية للذيل الكاره للماء ، وطول وتفريع سلسلة الألكيل ، أو وجود نواة عطرية أو سلسلة جانبية من الفلوروالكيل ، أو عدد وحدات البوليوكسيثيلين. وبالتالي، فإن فحص المنظفات هو خطوة أولى مهمة لتحديد المنظفات الأكثر ملاءمة لتزيل بروتين الغشاء وتنقية.

C. albicans هو الممرض الفطري البشري الرئيسي للأفراد الذين يعانون من نقص المناعة التي يمكن أن تسبب خطيرة، وتهدد الحياة الالتهابات الغازية47،ويمكن أن تصبح مقاومة للأدوية المضادة للفطريات أزول48،49. واحدة من الآليات الرئيسية للمقاومة C. albicans multidrug هو التعبير المفرط عن Cdr150، وهو نوع II ATP ملزمة كاسيت (ABC) الناقل51 من عائلة ABCG الفرعية الموجودة في غشاء البلازما. كامل الحجم الناقلات ABCG الفطرية (التي تتكون من اثنين من نطاقات الربط النيوكليوتيدات [NBDs] واثنين من المجالات transmembrane [TMDs]) هي أكثر شيوعا المعروفة باسم مقاومة الأدوية الجنبية (PDR) الناقلين وتتميز طوبولوجيا المجال المقلوب فريدة من نوعها [NBD-TMD]2. توجد ناقلات PDR فقط في النباتات52و53 والفطريات54. على الرغم من أهميتها، لا توجد هياكل لنقل PDR، على الرغم من أن هياكل لنقل ABCG نصف الحجم البشري قد تم حلها مؤخرا مما ساعد على إنشاء النموذج الأولي الأول لCDR133. ومع ذلك، تشير أدلتنا التجريبية الأخيرة إلى أن هذا النموذج معيب ربما لأن ناقلات PDR الفطرية لديها NBDs غير متماثلة مميزة مما يؤدي إلى آلية نقل فريدة من نوعها. ولذلك، فإن هناك حاجة إلى هيكل عالي الدقة من Cdr1 لكل من التصميم العقلاني لمثبطات مضخة efflux الجديدة التي قد تساعد في التغلب على مقاومة الأدوية بوساطة efflux ، وتقديم رؤى حول آلية عمل هذه العائلة الناقلة ABC الهامة.

كان الهدف من هذه الدراسة هو وضع بروتوكولات موثوقة للتعبير ، والتشحيم ، وتنقية Cdr1 في مضيف التعبير S. cerevisiae المعدل وراثيا ، بهدف نهائي هو الحصول على بنية عالية الدقة ل Cdr1. كجزء من هذه العملية، تم تصميم علامة مزدوجة mGFPHis protease-cleavable(الشكل 1B)مع وصلة 16 بقايا فصل العلامة من C-terminus من Cdr1، والتي تحسنت ملزمة من 6x المرفقة له علامة تقارب لراتنج تقارب النيكل ومكن من رصد مستويات التعبير Cdr1 في الخلايا الحية وخلال عملية تنقية كامل. كما تم تطوير بروتوكول قابل للاستنساخ لمستحضرات بروتين غشاء بلازما الخميرة الصغيرة التي تحتوي على حوالي 10٪ C. albicans Cdr1 (كما يقدر تلطيخ Coomassie بعد SDS-PAGE) ، والذي يمكن استخدامه لتوصيف البيوكيميائية ل Cdr1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المخزونات الطازجة أو المجمدة من التحول الخلايا ADΔ و ADΔΔ المختصة

  1. تلقيح 25 مل من 2x YPCD [أي 2x YPD; 2٪ (ث / v) استخراج الخميرة، 2٪ (ث / v) بيبتون، 4٪ (ث / v) dextrose)، 0.079 ٪ (ث / الخامس) CSM (خليط الملحق الكامل)]35 المتوسطة مع مستعمرة خميرة واحدة واحتضان بين عشية وضحاها (س / ن) لمدة 16 ساعة في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 ثورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة).
  2. تلقيح 225 مل من 2x YPCD المتوسطة مع الثقافة 25 مل س / ن والتحقق من كثافة الخلايا البصرية في 600 نانومتر (OD600); OD600 عادة ~ 0.5-1.0.
    ملاحظة: في هذه المرحلة تأكد من أن كافة المواد المطلوبة لتجربة التحويل التالية متوفرة بسهولة.
  3. تنمو الثقافة في 30 درجة مئوية لمزيد من ~ 6-8 ساعة مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة حتى كثافة الخلية تصل إلى OD600 من ~ 6-8.
    ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية في درجة حرارة الغرفة (RT) ما لم ينص على خلاف ذلك.
  4. حصاد هذه الخلايا المرحلة اللوغاريتمية عن طريق الطرد المركزي في 3000 × ز لمدة 3 دقائق.
  5. إعادة مسك الخلايا وغسلها مرتين بالماء المقطر المزدوج العقيم (ddH2O؛ أي 200 مل ثم 20 مل).
  6. حصاد الخلايا في 3000 x ز لمدة 3 دقائق.
  7. ببطء (أي، إضافة 30 aliquots متساوية من الخلية المجمدة المختصة (FCC) حل كل دقيقة لمدة 30 دقيقة) resuspend بيليه الخلية في X مل من FCC [5٪ (ث / الخامس) الجلسرين، 10٪ (v/v) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)] على الجليد (حيث X = OD600؛ على سبيل المثال، إذا كان OD600 = 6 resuspend في 6 مل، أو إذا OD600 = 3 إعادة الإنفاق في 3 مل).
    ملاحظة: تكوين FCC الصحيحة حاسمة لنجاح التحويل.
  8. إبقاء الخلايا على الجليد لمدة 2 ساعة قبل التحول أو تخزين aliquots في -80 درجة مئوية حتى المطلوبة.
    ملاحظة: خلايا ADΔ و ADΔΔ حساسة جدا للتجميد. وهكذا، يجب تبريد الخلايا ببطء إلى -80 درجة مئوية: ضع أنابيب الطرد المركزي المجهري الباردة التي تحتوي على 50-600 ميكرولتر من الخلايا في صندوق تخزين بلاستيكي (RT). ضع الصندوق في حاوية البوليسترين الأكبر حجما (RT) واغلق الحاوية بغطاء البوليسترين المناسب. ثم ضع الحاوية في الثلاجة -80 درجة مئوية.
    تنبيه: التجميد البطيء أمر بالغ الأهمية لبقاء الخلية.

2. تحويل ADΔ و ADΔΔ مع CaCDR1-XLmGFPHis وتأكيد المحولات الصحيحة من قبل PCR مستعمرة وتسلسل الحمض النووي

ملاحظة: تم إنشاء Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis باستخدام استراتيجيات الاستنساخ التقليدية الموصوفة بالتفصيل في Lamping et al., 201055 ويتضح في الشكل 1B. البرية من نوع C. albicans CDR1 تم عزله كما باكI /ليسأنا جزء من pABC3-CaCDR1A-GFP14 ومستنسخة في pABC3-XLmGFPHis26.

  1. PCR تضخيم كامل كاسيت التحول CDR1 مع البوليمرات الحمض النووي عالية الدقة والزوج التمهيدي PDR5-pro/PDR5-ter35 باستخدام 1-10 نانوغرام من pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis كقالب الحمض النووي أو، بدلا من ذلك، هضم 2 ميكروغرام من pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis إلى الانتهاء مع 10 U تقييد إنزيم AscI في 37 درجة مئوية (الشكل 1A، B).
    ملاحظة: شريط كاسيت تحويل CDR1 (الشكل 1A) يضم المروج PDR5 - CaCDR1-mGFPHis - المنهي PGK1 - علامة اختيار URA3 - منطقة المصب PDR5.
  2. أداء agarose هلام الكهربائي وهلام استخراج كاسيت التحول ~ 8 كيلوبايت.
    ملاحظة: تنقية هلام من الكاسيت تحويل CaCDR1 ~ 8 كيلو بايت يزيل أي الحمض النووي البلازميد غير مهضوم ممكن، والتي يمكن أن تؤدي إلى المحولات غير صحيحة التي لديها البلازميد بأكمله، بدلا من كاسيت التحول الخطي، ومتكاملة في الموضع PDR5 الجينوم.
  3. إزالة الكمية المطلوبة من الحمض النووي الناقل للحيوانات المنوية السلمون (2 ملغم / مل؛ 10 مللي متر تريس، 1 mM EDTA؛ درجة الحموضة 7.5) لمدة 10 دقائق في حمام الماء المغلي والحفاظ على الجليد. استخدام أنابيب المسمار توج لغلي الحمض النووي الحيوانات المنوية السلمون لتجنب فتح الغطاء.
  4. مزيج 50 ميكرولتر من الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون المشوه مع 14 ميكرولتر من كاسيت التحول (500-2000 نانوغرام) والحفاظ على 64 ميكروغرام من خليط الحمض النووي على الجليد حتى مزيد من الاستخدام.
    ملاحظة: استخدام 10 نانوغرام من E. القولونية-الخميرة مكوك البلازميد (على سبيل المثال، pYES2) كتحكم التحول الإيجابي(الشكل 2B).
  5. Resuspend الخلايا المختصة الطازجة أو المجمدة سرعان ما تذويب لمدة 5 دقائق في حمام مائي 30 درجة مئوية وتقسيمها إلى 50 ميكرولتر aliquots في أنابيب الطرد الدقيق 1.5 مل.
  6. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في ميكروفوج بأقصى سرعة (18000 × غرام).
  7. إزالة supernatant والحفاظ على بيليه الخلية في RT.
  8. لكل تحويل، اخلط 296 تركيبة ميكرولتر (RT) من 260 ميكرولتر من 50٪ (ث/v) بولي إيثيلين غليكول (PEG 3350) و 36 ميكرولتر من خلات الليثيوم 1 M (LiAc)، عن طريق تكرار الأنابيب، مع 64 ميكرولتر المناسبة من خليط الحمض النووي البارد الجليد.
  9. إضافة الخليط المناسب على الفور إلى 50 ميكرولتر الخلية المختصة بيليه aliquot.
  10. Resuspend بيليه الخلية في 360 ميكرولتر من PEG-LiAc-DNA خليط عن طريق دوامة تماما لحوالي 30 ثانية.
  11. احتضان خليط الخلية في حمام مائي 30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: تتحول خلايا ADΔ و ADΔΔ بشكل أفضل عند 30 درجة مئوية من 42 درجة مئوية35.
  12. حصاد الخلايا في 18،000 × ز لمدة 10 ق. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 80 ميكرولتر من DDH2O.
  13. نشر الخلايا على لوحة CSM-URA أجار35 [أي، 0.67٪ (ث / v) قاعدة النيتروجين الخميرة دون الأحماض الأمينية، 0.077٪ (ث / v) CSM ناقص uracil، 2٪ (ث / v) الجلوكوز، و 2٪ (ث / v) أجار].
  14. احتضان لوحات لمدة 2-3 أيام في 30 درجة مئوية حتى uracil بروتوتروف المحولات مرئية بوضوح.
    ملاحظة: توقع ~ 100 محولات لكل ميكروغرام من شريط التحويل الخطي ~8 kb CaCDR1 و ~ 4 × 104 محولات لكل μg pYES2.
  15. اختر خمسة محولات مستقلة ونشرها على لوحة CSM-URA جديدة لفصل محولات البروتوتتروف uracil من بقايا الخلايا المضيفة غير المحولة.
  16. إزالة أي المسوخ الصغيرة المحتملة عن طريق زراعة المحولات على لوحات YPG-أغار [1٪ (ث / v) استخراج الخميرة، 2٪ (ث / v) بيبتون، 2٪ (v/v) الجلسرين، و 2٪ (ث / v) أجار] (الشكل 2D).
    ملاحظة: المسوخ الصغيرة لديها الميتوكوندريا المعيبة، وبالتالي، لا يمكن أن تنمو على مصادر الكربون غير القابلة للتخمير. فهي شائعة جدا في S. cerevisiae56. س. سيريفيسياي ADΔ و ADΔΔ عرضة بشكل خاص للحصول على النمط الظاهري الصغير.
  17. أداء الخميرة مستعمرة PCR وتأكيد ما لا يقل عن ثلاثة المحولات المستقلة ليتم دمجها بشكل صحيح في الموضع PDR5 الجينوم(الشكل 1C)عن طريق تضخيم كامل ~ 8 kb كاسيت تحويل CaCDR1 مع بوليمرات الحمض النووي المحددة التي يتم تحسينها لتضخيم منتجات PCR من مصادر قالب الحمض النووي نجس. استخدم مجموعة من التهيئة التي تربط خارج موقع التكامل و1 ميكرولتر من تعليق الخلايا (في ddH2O) المستمدة من مستعمرات واحدة كنماذج الحمض النووي.
    ملاحظة: هذا بوليمراز الحمض النووي خاصة تضخيم موثوق ~ 8 كيلو بايت شظايا PCR من خلايا الخميرة سليمة. ومع ذلك، من أجل تضخيم موثوق بها، هناك حاجة إلى 45 دورات PCR، ويجب إعادة إنفاق خلايا الخميرة في OD600 1-10 في ddH2O.
  18. تأكيد الصحيح ~ 8 كيلو بايت PCR تضخيم المنتج بواسطة الحمض النووي agarose هلام electrophoresis من جزء 1 ميكرولتر من تفاعل PCR.
  19. إزالة التمهيديات التضخيم الزائدة من جزء 10 ميكرولتر من رد فعل PCR مع خليط إنزيم من إكسونوكليز الحمض النووي حبلا واحد وفوسفاتاز اتباع تعليمات الشركة المصنعة قبل تسلسل ORF كامل باستخدام أجزاء من عينة الحمض النووي المعالجة مع التمهيديات المناسبة.

3. صغيرة النطاق بروتوكول عزل غشاء البلازما الخميرة

  1. زراعة خلايا الخميرة
    1. قبل الثقافة مستعمرة خميرة واحدة في 10 مل من YPD في 30 درجة مئوية ل ~ 7-8 ساعة مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة.
    2. تلقيح 40 مل من متوسط YPD مع 10 مل قبل الثقافة واحتضان الخلايا في 30 درجة مئوية س / ن (~ 16 ساعة) مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة حتى كثافة الخلية تصل إلى OD600 من 1-3.
  2. حصاد خلايا الخميرة
    1. حصاد 40 وحدة OD (ODU؛ على سبيل المثال، 1 مل عند OD600 من 1 = 1 ODU) من خلايا المرحلة اللوغاريتمية عند 4200 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية.
    2. إعادة الإنفاق وغسل الخلايا مرتين مع الجليد الباردة ddH2O (أي 40 مل ثم 1 مل؛ حصاد الخلايا بين الخطوات عن طريق الطرد المركزي في 4200 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية).
    3. Resuspend بيليه في 1 مل من الجليد الباردة ddH2O ونقل تعليق الخلية في أنبوب الطرد الدقيق المبردة مسبقا (على الجليد) 1.5 مل.
    4. حصاد الخلايا في 3300 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية.
    5. يستنشق العملاق.
    6. Resuspend بيليه الخلية في 0.5 مل تجانس العازلة [HB; 50 mM تريس, 0.5 mM EDTA, 20٪ (v/v) الجلسرين; pH 7.5] تستكمل حديثا مع 1 mM phenylmethylsulfonyl فلوريد (PMSF).
      ملاحظة: قم دائما بإضافة PMSF طازجة لأن PMSF معطل بسرعة عند التعرض للمياه.
      تنبيه: PMSF هو مثبط سيرين بروتياز، وهو تآكل للغاية ومدمر للأنسجة. قد يسبب تلف العين لا رجعة فيه.
    7. تخزين تعليق الخلية في -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.
  3. عزل أغشية البلازما
    1. إذا المجمدة، تذويب الخلايا على الجليد ل ~ 1 ساعة.
    2. أضف حبات سيليكا قطرها 0.5 مم إلى تعليق الخلية 0.5 مل للوصول إلى حجم إجمالي قدره 1 مل.
    3. كسر الخلايا مع 6 دورات من الدوامة في أقصى كثافة اهتزاز لمدة 1 دقيقة تتخللها فترات تبريد 3 دقائق على الجليد.
    4. جعل ثقب رقيقة في الجزء السفلي من الأنبوب مع شفرة مشرط ساخنة.
    5. جمع الخلية المكسورة متجانسة من خلال الجزء السفلي من الأنبوب تركيبها في آخر الجليد الباردة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع 10 ق منخفضة السرعة (~ 200 دورة في الدقيقة) تدور.
      ملاحظة: هذا يضمن بقاء حبات السيليكا في الأنبوب الأصلي.
    6. الطرد المركزي تجانس الخلية في 5,156 x g لمدة 5 دقائق في 4 °C لإزالة حطام الخلية, الخلايا غير المنقطعة, والنوى.
    7. نقل 450 ميكرولتر من supernatant في الجليد الباردة 1.5 مل أنبوب الطرد الدقيق وإضافة 1 مل إضافية من HB الجليد الباردة تكملها PMSF الطازجة (1 mM).
      ملاحظة: هذه الخطوة التخفيف أمر بالغ الأهمية لاستعادة بروتين غشاء البلازما عالية الجودة.
    8. حصاد أغشية البلازما في 17,968 x g ل 1 ح في 4 °C وإعادة إنفاق بيليه غشاء البلازما, عن طريق تكرار pipetting, في 100 ميكرولتر من HB تكمل حديثا مع 1 م م PMSF. تخفيف بيليه الخلية لتجانس غشاء البلازما السليم عن طريق تحريك بيليه الخلية مع تلميح ماصة 100 ميكرولتر قبل الإفراج عن 100 ميكرولتر من HB صعودا وهبوطا pipetting.
    9. قياس تركيز البروتين لإعداد غشاء البلازما مع مجموعة من البروتين المقايسة التي تتوافق مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على عامل الحد والمنظفات.
    10. تخزين أغشية البلازما في -80 درجة مئوية أو الاحتفاظ بها على الجليد للاستخدام الفوري.

4. الصوديوم دودسيل كبريتات البولي أكريلاميد هلام electrophoresis (SDS-PAGE)

  1. تجميع الجهاز لإعداد المواد الهلامية البولي أكريلاميد.
  2. لاثنين من المواد الهلامية فصل (7٪ البولي أكريلاميد)، مزيج 2.1 مل من 40٪ أكريلاميد / بيس أكريلاميد، 3 مل من العازلة الفاصلة 4x (1.5 M تريس، 0.4٪ كبريتات دودسيل الصوديوم [SDS] (ث/v)؛ درجة الحموضة 8.8)، و6.9 مل من ddH2O. إضافة 8 ميكرولتر من رباعي ميثيل إيثيلينديامين (TEMED) و 60 ميكرولتر من 10٪ من بيرسولفوات الأمونيوم (APS) لبدء بلمرة الأكريلاميد.
    تنبيه: الأكريلاميد/ بيس أكريلاميد سام للغاية. يسبب تهيج الجلد، اعتلال الأعصاب المحيطية وهو مادة مسرطنة. TEMED ضار إذا ابتلع أو استنشق. وكالة الأنباء الجزائرية ضارة إذا ابتلع. يسبب تهيج العين والجلد خطيرة.
  3. صب ~ 4-5 مل من هذا الخليط في جهاز هلام تجميعها، تصل إلى ~ 2 سم من الأعلى.
  4. طبقة بعناية ~ 1-2 مل من 0.1٪ SDS على رأس لإنشاء الغضروف المفصلي بلاني.
  5. السماح للبولي أكريلاميد لتعيين ل ~ 60 دقيقة في RT.
  6. إعداد خليط هلام التراص لاثنين من المواد الهلامية عن طريق خلط 0.5 مل من 40٪ أكريلاميد / بيس أكريلاميد، 1 مل من 4x التراص العازلة (0.5 M تريس، 0.4٪ SDS (ث / v)؛ درجة الحموضة 6.8)، و 6.9 مل من ddH2O. إضافة 2 ميكرولتر من TEMED و 30 ميكروغرام من 10٪ APS لبدء بلمرة من الأكريلاميد.
  7. إزالة طبقة SDS 0.1٪ من هلام فصل البوليمر وشطف مع DDH2O لإزالة آثار SDS.
  8. صب مزيج هلام التراص على هلام فصل.
  9. وضع مشط في هلام التراص وإزالة أي فقاعات الهواء من جميع أنحاء المشط.
  10. السماح للجل التراص لتعيين ~ 60 دقيقة في RT.
  11. إزالة المشط وشطف فتحات هلام بالماء. وضع هلام في خزان هلام وملء خزان هلام إلى الأعلى مع 1x تشغيل العازلة (24.8 mM تريس، 190 mM الجليسين، 0.1٪ SDS).
    ملاحظة: تحضير المخزن المؤقت تشغيل 1x من مخزون المخزن المؤقت 10x (248 mM تريس، 1.9 M glycine، 1٪ SDS (ث/v) في ddH2O) المخزنة في RT.
  12. مزيج عينات غشاء البلازما 5-10 ميكرولتر (أي، 10-20 ميكروجرام بروتين) مع كميات متساوية من 2x البروتين تحميل صبغ [120 mM تريس-HCl (درجة الحموضة 6.8)، 20٪ الجلسرين، 0.02٪ بروموفينول الأزرق، 4٪ SDS، 200 mM dithiothreitol (DTT)] وتحميلها على الفور في فتحات هلام الفردية المغمورة في المخزن المؤقت تشغيل.
    تنبيه: DTT ضار إذا ابتلع. يسبب تهيج العين والجلد خطيرة.
    ملاحظة: جعل مخزون 10 مل من 2x البروتين تحميل صبغ، aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية. لا تسخين العينات المختلطة ولكن تحميلها على الفور في فتحات هلام الفردية بحيث لا يتم تدخر العلامة GFP، ويمكن الكشف عن إشارات الفلورسينس في هلام.
  13. تحميل البروتين علامات الوزن الجزيئي (10-245 كيلودا مجموعة) في فتحة منفصلة لتمكين تقدير حجم شظايا البروتين الفردية.
  14. إجراء الكهربائي هلام في 200 V حتى صبغة التحميل الأزرق تصل إلى الجزء السفلي من هلام (عادة 45-55 دقيقة).
  15. فحص هلام لGFP-fluorescence في هلام مع نظام التصوير هلام (الإثارة والأطوال الموجية الانبعاثات هي 475-485 نانومتر و 520 نانومتر، على التوالي).
  16. بعد التصوير الفلوري داخل الجل، قم بإصلاح البروتينات عن طريق التحريض اللطيف للجل في ~ 10-20 مل من محلول تحديد هلام البروتين (40٪ إيثانول، 10٪ حمض الخليك) لمدة 15 دقيقة في RT.
  17. شطف الجل مرتين لمدة 10 دقيقة مع 10 مل من ddH2O وتصور عصابات البروتين عن طريق وضع هلام في 10 مل حل وصمة عار كوماسي الغروية مع اهتزاز لطيف ل ~ 1 ساعة في RT.
  18. لتحسين التصور من عصابات البروتين، دي وصمة عار الجل مرة أو مرتين في ~ 20 مل من DDH2O ل ~ 1 ساعة قبل تسجيل الصور مع نظام التصوير هلام.

5. تحديد Cdr1 ATPase الأنشطة 57

  1. تمييع عينات غشاء البلازما >2.2 ملغم/ مل إلى 1-2 ملغم/مل في HB.
  2. موازنة كوكتيل ATPase المقايسة (75 mM MES-Tris، 75 مليون نترات البوتاسيوم، 0.3 مليون موليبيدات الأمونيوم، 7.5 مليون م من أزيد الصوديوم؛ درجة الحموضة 7.5) ومغ-ATP (28.8 مللي متر من ملح ديبووديوم ATP، 28.8 مللي متر ملغم2؛ درجة الحموضة 7.0) إلى 30 درجة مئوية في حاضنة 30 درجة مئوية.
    تنبيه: أزيد الصوديوم شديد السمية.
    ملاحظة: تأكد من أن جميع المخزونات العازلة والزجاجات خالية من الفوسفات؛ أي غسل الأواني الزجاجية مع 1٪ (vol/vol) HCl وشطفه عدة مرات مع ddH2O. أيضا، يبقيه منفصلة عن الأواني الزجاجية الأخرى التي تحتوي على الأرجح آثار الفوسفات موجودة عادة في المنظفات المستخدمة لغسل الأواني الزجاجية.
  3. إضافة 90 ميكرولتر من كوكتيل المقايسة مع أو بدون مثبط Cdr1-ATPase (20 ميكرومتر من أوليغوميسين) في الآبار الفردية من لوحة ميكروتتر 96 جيدا.
    ملاحظة: يتم إجراء المقايسة في ثلاثية.
  4. إضافة 5 ميكرولتر من أغشية البلازما المعزولة (~ 5-10 ميكروجرام بروتين) أو معايير الفوسفات (0-100 نانوميس بي) في الآبار المناسبة للوحة الميكروتيتر.
    ملاحظة: الاحتفاظ الأعمدة الأول والأخير لمجموعتين منفصلتين من معايير الفوسفات.
  5. ابدأ الفحص بإضافة 25 ميكرولتر من 28.8 مللي متر مجم-ATP (تركيز نهائي 6 مللي متر) مع ماصة متعددة القنوات في الآبار الفردية واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  6. وقف رد الفعل عن طريق إضافة 130 ميكرولتر من كاشف التنمية (1.6٪ الصوديوم L-أسكوربات، 1٪ SDS، 12٪ موليبيدات الأمونيوم في حمض الكبريتيك 6 M).
    تنبيه: يتفاعل حمض الكبريتيك المركز بعنف مع الماء. وهو تآكل ويمكن أن يسبب تلف الجلد والرئة.
  7. احتضان في RT لمدة 10 دقائق.
  8. قراءة امتصاص الآبار لوحة microtiter في 750 نانومتر مع قارئ لوحة microtiter.
    ملاحظة: التمسك 10 دقيقة وقت الحضانة لتطوير الصبغة الزرقاء (أي، انخفاض الفوسفور الموليبدينوم المعقدة) أمر بالغ الأهمية لدقة المقايسة لأن تطور الصبغة الزرقاء يستمر مع مرور الوقت.
  9. الحصول على نشاط ATPase CDR1 محددة (أي نشاط ATPase الحساسة oligomycin) عن طريق طرح نشاط ATPase في وجود أوليغوميسين من النشاط ATPase مجموع في غياب أوليغوميسين.

6. شاشة المنظفات الصغيرة الحجم

  1. الجمع بين الاستعدادات غشاء البلازما (أي، 2.5 ملغ من بروتين غشاء البلازما) من الخلايا الإفراط في التعبير Cdr1-mGFPHis مع GTED-20 العازلة [10 mM تريس، 0.5 mM EDTA, 20 ٪ (ث / v) الجلسرين; pH 7.5; تستكمل حديثا مع 1 م م PMSF] تحتوي على 5 ملغ من المنظفات اختبار, للوصول إلى حجم إجمالي قدره 0.5 مل تكملها مع 1٪ (ث / v) المنظفات.
  2. تدوير الخليط في 4-8 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، مع جهاز دوران.
  3. طارد مركزي الخليط في 141،000 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. نقل supernatant تحتوي على مواد مشحمة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الطازجة.
  5. إضافة 0.5 مل من العازلة GTED-20 تكملها مع 2٪ (ث / v) SDS إلى جزء بيليه غير قابلة للذوبان واحتضان في 30 درجة مئوية س / ن في حاضنة اهتزاز لاستخراج جميع المنظفات غير قابلة للذوبان بروتين الغشاء.
  6. تحليل ومقارنة الكسور بيليه فائقة وslubilized بواسطة SDS-PAGE.
  7. صور المواد الهلامية التي تحتوي على البروتينات الموسومة GFP لفلورسينس GFP في هلام قبل تلطيخ Coomassie وقياس مستويات التعبير مع نظام التصوير.
  8. استخدم كسر بروتين الغشاء القابل للذوبان لتطبيقات المصب مثل كروماتوغرافيا استبعاد حجم الفلورسينس (FSEC)58 لتحديد المنظفات المناسبة(المنظفات).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تحقيق وتيرة عالية من التحول من S. cerevisiae ADΔΔ (~ 4 ×10 4 المحولات / ميكروغرام) مع pYES2 (الشكل 2B). كما هو متوقع، لم يعط التحكم في الحمض النووي (أي ddH2O فقط) أي محولات، وأعطى 1 ميكروغرام من CDR1الخطي - شريط كاسيت التحولmGFPHis (الشكل 1A) ~ 50 محولات(الشكل 2C)مع بروتوكول التحويل ADΔΔ الأمثل. كما تم اختبار محولات CDR1-mGFPHis لقدرتها على النمو على مصدر كربون غير قابل للتخمير للقضاء على أي طفرات صغيرة محتملة مع الميتوكوندريا المعيبة. ثلاثة (دوائر صفراء؛ الشكل 2D) من بين 25 محولا من ال uracil-prototroph تم اختبارها لم تتمكن من النمو على لوحات أغار وحدات حماية الشعب وتم التخلص منها من المزيد من التحقيقات. وCDR1-mGFPHis التي أعرب عنها سلالة أنشئت حديثا ADΔΔ-CDR1-mGFPHis هو موضعية بشكل صحيح في غشاء البلازما (الشكل 1A) وأعرب في مستويات كافية لتوصيف الهيكلية والوظيفية من Cdr1 (الشكل 3). تصميم العلامة المزدوجة الأمثل(الشكل 1B)يتيح أيضا إزالة علامة مزدوجة mGFPHis بعد تنقية النيكل تقارب Cdr1-mGFPHis لمنع التداخل المحتمل من العلامة في التطبيقات المصب. النتائج الأولية, ومع ذلك, وقد أظهرت أن الرابط 3 الأحماض الأمينية بين Cdr1 وHRV-3C protease الانقسام الموقع قد تضطر إلى توسيع لتحقيق أسرع, أكثر فعالية, الانقسام. وقد أبلغ مؤخرا عن ملاحظات مماثلة لN-النهاية الموسومة الناقل Escherichia coli NupC, التي تتطلب 15 بدلا من مصممة أصلا 3 وصلة الأحماض الأمينية لانشقاق كفاءة من المنظفات (DDM) NupC solubilized ملزمة الراتنج النيكل تقارب59. ال 5 الأحماض الأمينية الرابط C-المحطة الطرفية للموقع انشقاق HRV-3C يمنع تداخل steric من علامة مزدوجة mGFPHis مع البروتين المرفقة من الفائدة, التي لاحظناها سابقا لC. استخدام الناقل ABC Cdr139. تم إنشاء طفرة yEGFP3-A206K لمنع GFP-dimerization الاصطناعي بتركيزات عالية من البروتين28، ويضمن رابط الأحماض الأمينية الإضافي 3 بين mGFP وعلامة تقارب النيكل الخاصة به التعرض السطحي المناسب للوسم الخاص به لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة الملزمة للبروتين الموسوم لراتنج تقارب النيكل (البيانات غير المعروضة).

Figure 1
الشكل 1:منصة التعبير عن بروتين غشاء الخميرة لاستنساخ وتعبير فعالين عن ناقلات غشاء البلازما الفطرية. (أ) كاسيت تحويل يضم مروج PDR5 (أزرق) وCDR1 (أحمر) C-terminally الموسوم ب XLmGFPHis (أخضر) ، ومنهي PGK1 (برتقالي) ، وعلامة اختيار URA3 (الأزرق الفاتح) ، ويتم استخدام قطعة من منطقة المصب PDR5 (الأزرق) لتحويل مضيف التعبير S.cer evisiae ADΔΔ عن طريق التكامل في الموضع PDR5 الجينومي. يؤدي عامل النسخ المتحول كسب الوظيفة Pdr1-3 إلى التعبير الزائد التأسيسي ل Cdr1 (المثمنات الحمراء) في غشاء البلازما (انظر صورة المجهر الكونف البؤري تحته). (ب) Plasmid pABC3-XLmGFPHis، والتي يمكن استخدامها في استراتيجية الاستنساخ التقليدية أو كقالب PCR لتوليد كاسيت التحول. يتم سرد تحسينات من pABC3-XLmGFPHis plasmid على pABC3-GFP14 تحت خريطة البلازميد. (ج) بديل أكثر كفاءة استراتيجية استنساخ خطوة واحدة لدمج كاسيت التحول في الموضع PDR5 الجينومي من ADΔΔ. يمكن تضخيم ORF (أحمر) PCR باستخدام التمهيديات (الأسهم) التي تخلق تداخلات مع الذراع الأيسر (الأزرق؛ PDR5 المروج) والذراع اليمنى (الأخضر; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 المصب) شظايا. يمكن إدخال الطفرات (الخطوط السوداء) في ORF عن طريق تصميم التمهيدي إذا لزم الأمر. تتم الإشارة إلى أحداث إعادة التركيب المتجانسة التي توجه التكامل الصحيح في موضع PDR5 بواسطة الخطوط المتقطعة المتقاطعة. (د) المقايسات الخلية الكاملة التي يمكن استخدامها لتوصيف وظيفية من الفطريات مضخات efflux متعددة الأدوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحويل ADΔΔ مع CDR1-mGFPHis تحويل كاسيت والقضاء على صغيرتي ADΔΔ-CDR1-mGFPHis المحولات. تم اختيار محولات Uracil prototroph عن طريق احتضان خلايا ADΔΔ المحولة على لوحات CSM-URA عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام. (أ) السيطرة السلبية (لا الحمض النووي). (ب) التحكم الإيجابي (10 نانوغرام من pYES2). (C) CDR1-محولات mGFPHis (1 ميكروغرام من الحمض النووي). (D) اختبار ADΔΔ-CDR1-mGFPHis المحولات لظاهرة صغيرة على لوحات أغار وحدات حماية الشعب. يتم تطويق المحولات الصغيرة التي لا يمكن أن تنمو على لوحات أغار وحدات حماية الشعب بسبب الميتوكوندريا المعيبة باللون الأصفر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وفلورسينس GFP هو مقياس موثوق لمستويات التعبير Cdr1 كما كان هناك علاقة خطية بين كمية Cdr1-mGFPHis (الخطوة 3.3.9) وإشارات مضان في هلام(الشكل 3A). وفي هذا المشروع، تم تطوير سير عمل محسن قابل للاستنساخ من أجل التوليد السريع لمستحضرات أغشية البلازما الصغيرة عالية الجودة لتوصيف الخصائص الكيميائية الحيوية لبروتينات غشاء البلازما. كان من الممكن لتوليد ما يقرب من 0.5 ملغ بروتين غشاء البلازما (الشكل 3C؛ الرسم البياني الأيسر) تظهر أعلى نشاط ATPase Cdr1 ( ̃ 400 نانومول / دقيقة / ملغ ; الشكل 3C؛ الرسم البياني الأيمن) عند كسر 40 وحدة من الخلايا(إعادة الإنفاق في 0.5 مل من HB) مع نفس الحجم (أي 0.5 مل) من حبات السيليكا و 6 دورات من الدوامة لمدة دقيقة واحدة في أقصى كثافة اهتزاز تليها فترات تبريد 3 دقائق على الجليد. أدت زيادة أخرى في عدد دورات الكسر (الخطوة 3.3.3) إلى تقليل جودة إعداد غشاء البلازما المعزول (انخفض نشاط CDR1 ATPase من 170 نانومول / دقيقة / ملغ إلى ~ 60 نانومول / دقيقة / ملغ ؛ البيانات غير المعروضة). على الرغم من وجود اختلافات طفيفة فقط في أنماط البروتين SDS-PAGE لعينات غشاء البلازما المعزولة عن الخلايا المكسورة مع أعداد أكبر من دورات الكسر (البيانات غير الموضحة) ، فمن المرجح أن أنشطة CDr1 ATPase المخفضة بمقدار 3 أضعاف تقريبا بعد 10 دورات كسر أو أكثر كانت ناجمة عن إما: 1) التشبع الجزئي ل Cdr1 بسبب التعرض لارتفاع درجة الحرارة ؛ '2' تعديلات ما بعد الترجمة مثل الفوسفور أو إزالة الفوسفور؛ أو ب(3) زيادة التلوث المتبادل للغشاء البلازما المعزولة الحويصلات مع كسور غشاء من العضيات الأخرى. كسر 40 ODU من الخلايا في 0.5 مل من HB أسفرت عن أعلى مستويات الجودة من أغشية البلازما (أي، أكثر Cdr1 لكل 10 ميكروغرام من بروتين غشاء البلازما؛ الشكل 3ب) مع أعلى Cdr1 ATPase النشاط (الشكل 3C؛ الرسم البياني الأيمن). أعلى (> 40 ODU/0.5 مل من HB) أو أقل (20 ODU/0.5 مل من HB) خفضت كثافة الخلايا ATPase لأغشية البلازما المعزولة(الشكل 3C؛ الرسم البياني الأيمن) ، على الرغم من أن غلتها زادت بما يتناسب مع زيادة كثافة الخلايا(الشكل 3C؛ الرسم البياني الأيسر). وهكذا، كان 40 ODU/0.5 مل من HB الكثافة المثالية للخلايا لعزل أعلى جودة من أغشية البلازما. لذلك ، أدى استخدام البروتوكول الأمثل لعزل صغير النطاق لمستحضرات غشاء البلازما إلى 2-3 مرات أعلى من أنشطة CDR1 ATPase المحددة (~ 300 نانومول / دقيقة / ملغ ؛ الشكل 3C؛ الرسم البياني الأيمن) مقارنة بأنشطة ATPase الخاصة ب Cdr1 التي تم الحصول عليها في البداية (~ 100 نانومول / دقيقة / ملغ ؛ البيانات غير المعروضة). وكانت هذه الأنشطة ATPase أيضا أعلى بكثير35 من أي أنشطة ATPase Cdr1 المبلغ عنها سابقا (100-200 نانومول / دقيقة / ملغ) التي تم الحصول عليها مع أكثر كثافة العمالة وتستغرق وقتا طويلا على نطاق واسع بروتوكول إعداد غشاء البلازما14،41،60.

الطريقة الأكثر شيوعا لاستخراج بروتينات الأغشية من الأغشية البيولوجية هي التشحيم بالمنظفات. التحدي، ومع ذلك، هو العثور على المنظفات المناسبة التي لها أقل تأثير ضار على استقرار البروتين و / أو خصائص قابلة للطي. وضع العلامات على البروتين مع mGFPHis يسهل الفحص لاختيار أفضل المنظفات (المنظفات) لاستخراج البروتين. في المجموع، تم اختبار 31 المنظفات، المدرجة في جدول المواد،مع خصائص مختلفة لقدرتها على تليين Cdr1 من أغشية البلازما الخام من S. cerevisiae ADΔΔ-CDR1-mGFPHis الخلايا. تظهر نتائج مجموعة تمثيلية من 16 منظف اختبار (A-Q) في الشكل 3D. Lanes T, P, و S تحتوي على 10 ميكرولتر aliquots من مجموع (T) بروتين غشاء البلازما مباشرة بعد الذوبان المنظفات (الخطوة 6.2) والمنظفات بيليه غير قابلة للذوبان (P; solubilized س / ن في 0.5 مل من GTED-20, 2٪ SDS; الخطوة 6.5) والمنظفات القابلة للذوبان supernatant (S; الخطوة 6.4) كسور بعد الانفصال عن طريق الطرد المركزي الفائق في 141,000 x g. يجب أن يلحم المنظف المطلوب أكبر قدر ممكن من Cdr1-mGFPHis دون تغيير هيكله و / أو وظيفته. تم تشحيم بروتينات غشاء البلازما الخام (5 ملغم / مل) لمدة 2 ساعة مع 1٪ (ث / v) المنظفات (T) وaliquots من الكسور القابلة للذوبان (S) وغير القابلة للذوبان (P) تم تحليلها من قبل SDS-PAGE (الشكل 3D) وفي وقت لاحق أيضا عن طريق الكروماتوغرافيا استبعاد حجم الكشف عن الفلورسينس (FSEC)58 (الشكل 4). قررنا أن الحد الأدنى من المنظفات إلى نسبة البروتين من 2:1 (ث / ث) كان مطلوبا لslubilization كفاءة Cdr1. في الواقع ، لتحديد تركيز المنظفات الأمثل (DDM) المطلوب لتليين Cdr1-mGFPHis ، تم التحقيق في تركيز micelle الحرج للمنظفات (x CMC) ونسبة بروتين المنظفات / الغشاء (w/w). لوحظت اختلافات كبيرة في كفاءة التشحيم من Cdr1-mGFPHis عند استخدام تركيزات ثابتة من 10x أو 80x CMC من DDM. وتراوحت كفاءات التشحيم بين 40٪ و80٪ أو 60٪ و90٪ اعتمادا على كميات أغشية البلازما الخام المستخدمة في تجارب التشحيم المختلفة. ومع ذلك ، فإن اختيار المنظفات لنسب البروتين من ≥2 (ث / ث) أعطى نتائج جيدة بشكل مستنسخ مع >85٪ من Cdr1-mGFPHis يجري solubilized ، بغض النظر عن كمية بروتين غشاء البلازما المستخدمة. لذلك ، إذا كان استخدام النهج الأكثر شيوعا المتمثل في اختيار المنظفات بنسبة 1٪ أو 2٪ (w/v) لتلحم بروتينات الأغشية مثل Cdr1-mGFPHis ، فإن الحفاظ على نسبة المنظفات إلى البروتين فوق 2 (ث / ث) أمر مهم [أي ، الحفاظ على تركيز بروتين غشاء البلازما أقل من 5 ملغم / مل عند استخدام 1٪ (أي 10 ملغم / مل) المنظفات].

Figure 3
الشكل 3: القياس الكمي لمستويات التعبير Cdr1-mGFPHis، وتحسين بروتوكول عزل غشاء البلازما على نطاق صغير وشاشة المنظفات لCDr1-mGFPHis. (A) القياس الكمي ل Cdr1-mGFPHis مع مضان في هلام؛ تظهر صور Coomassie الملطخة والمفلورة في هلام SDS-PAGE لنفس جل البولي أكريلاميد 0.7٪ على اليسار. تم تحميل الممرات من 1 إلى 6 ب 0.75 و 1.5 و 3 و 6 و 12 و 24 ميكروغرام من بروتين غشاء البلازما ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. Cdr1-mGFPمشار إليه بسهم أحمر. M = الدقة بالإضافة إلى علامة البروتين. كانت كثافة الفلورسينس mGFP (الموضحة على اليمين) خطية على مدى تركيز كامل تم اختباره وكان هناك الحد الأدنى من مضان الخلفية. (ب) تأثير كثافة الخلية في الكسر على نوعية أغشية البلازما المعزولة. Coomassie الملون هلام البولي أكريلاميد (7٪) من عينات بروتين غشاء البلازما (10 ميكروغرام) وإشارات الفلورية الخضراء من Cdr1-mGFPHis من نفس الجل قبل تلطيخ كوماسي. M = الدقة بالإضافة إلى علامة البروتين. الممرات 1 و 3 و 5 و 7 هي بروتينات غشاء البلازما من ADΔΔ والممرات 2 و 4 و 6 و 8 هي بروتينات غشاء البلازما من ADΔΔ-CDR1-mGFPHis معزولة عن 20 و 40 و 60 و 80 ODU من الخلايا على التوالي. Cdr1-mGFPمشار إليه بسهم أحمر. يتم سرد النسب المئوية النسبية للإشارات الفلورية الخضراء تحتها. (ج) تأثير كثافة الخلية في الكسر على غلة أغشية البلازما المعزولة ونشاط ATPase من Cdr1-mGFPHis. على اليسار، تأثير كثافة الخلية (ODU/0.5 مل HB) على كمية بروتين غشاء البلازما المعزول عن خلايا ADΔΔ و ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (Cdr1). على اليمين، تأثير كثافة الخلية على نشاط CDR1 ATPase لأغشية البلازما المعزولة عن خلايا ADΔΔ-CDR1-mGFPHis. (D) مثالية SDS-PAGE من 10 ميكرولتر aliquots من خليط solubilization (T; 0.5 مل), بيليه بعد solubilization (P; 0.5 مل)، والكسور الزحمة (الفائقة) (S؛ 0.5 مل) من المنظفات بروتينات غشاء البلازما الخام اللحم من ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (أعلى) وفي هلام مضان Cdr1-mGFPHis قبل تلطيخ Coomassie من نفس الجل (أسفل). M = سلم البروتين الملون مسبقا بقدرة ميغاواط (245 و180 و135 و100 و75 و63 و48 كيلودا؛ ويشار إلى نطاقات 180 kDa و75 kDa بسهام حمراء وخضراء على التوالي). الممرات من A إلى L و N إلى Q هي T و S وكسور P ل DM (A) β-DDM (B) α-DDM (C) و TDM (D) وLMNG (E) وOGNG (F) وOG (G) وLDAO (H) وهوga (I)، ميجا (J)، تريتون-X100 (K)، CHAPS (L)، NM (N)، Tween80 (O)، فوس الكولين-13 (P) وSDS (Q)، على التوالي. يتم تعريف الاختصارات في جدول المواد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

استنادا إلى نتائج فحص المنظفات(الشكل 3D)،DDM (B و C) وفوس-الكولين-13 (P) ويبدو أن أفضل المنظفات لsolubilization من Cdr1-mGFPHis. ومع ذلك، يبدو أن استخدام فوس-الكولين-13 يسبب التحلل الجزئي ل Cdr1-mGFPHis (P في الشكل 3D). LMNG (E) ، PCC -α-M (غير مبين) وربما أيضا DM (A) كانت أفضل المنظفات التالية. وأظهرت شاشة المنظفات أيضا أن الجلوكوزيدات OGNG (F) وOG (G) ، CHAPS (L) ، NM (N) ، و Anzergents (غير مبين) كانت خيارات سيئة لذوبان Cdr1-mGFPHis كما تم العثور على كميات كبيرة من البروتين في كسور بيليه غير قابلة للذوبان(الشكل 3D). SDS denatures Cdr1-XLmGFPHis، وهذا هو السبب في عدم وجود إشارات مضان خضراء مرئية في حارات Q(الشكل 3D).

تم تقييم مدى ملاءمة المنظفات لتلحم جزيئات Cdr1-mGFPHis الأصلية المطوية بشكل صحيح من قبل FSEC لبروتين غشاء البلازما الممتلئة بالمنظفات (الخطوة 6.4 supernatant). أمثلة من الكروماتوجرامات التي تم الحصول عليها ل100 ميكرولتر بروتين غشاء البلازما الخام من ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (2 ملغم / مل) solubilized مع 1٪ المنظفات تظهر في الشكل 4. تمثل الذروة عند حجم elution 9 مل في الغالب Cdr1-mGFPHis المجمعة التي تتبلور في حجم الفراغ ، في حين يتم تمثيل جزيئات Cdr1-mGFPHis المطوية بشكل صحيح بشكل صحيح من خلال الذروة على شكل جاوسي عند حجم elution 15.5 مل. الكتف العريض بين 12 و 14 مل حجم elution ربما يحتوي على أقل تحديدا جيدا Cdr1-mGFPالجسيمات micelle و / أو تشير إلى طي جزئي أو مجاميع البروتين. وأظهرت الكروماتوجرامات من مالتوسيدات وLMNG استخراج البروتينات معظم Cdr1-mGFPHis eluting كذروة غاوسية على شكل جيد في 15.5 مل مع الكتف الصغيرة eluting قليلا في وقت سابق في 14 مل (الشكل 4A). لم يكن لهذه العينات Cdr1-mGFPHis التملص في حجم الفراغ. العينة الفارغة هي المخزن المؤقت بالإضافة إلى عنصر تحكم DDM الذي لم يعط أي إشارة mGFP. تبرز الكروماتوجرامات في الشكل 4B أهمية نوع مجموعة السكر الرأسية لجودة جزيئات Cdr1-mGFPHis الممتلئة بالمنظفات. الجلوكوز المحتوي على المنظفات (OG, NG, OGNG) كان أداؤه أسوأ من السكروز الذي يحتوي على المنظفات (DDS)، والذي بدوره كان أداؤه أسوأ من المنظفات المحتوية على المالتوز (NM، DMNG، DDM). Cdr1-mGFPHis مشحم بالجلوكوز الذي يحتوي على المنظفات المفرغة كذروة مجمعة (OG) أو ذروة مجمعة واسعة (NG، OGNG)، والتي كان من المتوقع أن تكون من النسبة الكبيرة من Cdr1-mGFPHis التي تترسب في كسور بيليه لOGNG (F) وOG (G) الملاحظة في الشكل 3D. على الرغم من أن اللوني DMNG (أخضر; الشكل 4ب) كان مشابها نوعيا للكروماتوجرام DDM (أزرق؛ الشكل 4B)، أعلى قمم DDM تشير إلى أن جزءا كبيرا من DMNG solubilized Cdr1-mGFPHis قد يكون في الواقع مشوه. الشكل 4C يظهر الكروماتوجرامات FSEC لزويديريونيك فوس-الكولين (فوس-الكولين-8، فوس الكولين-10، فوس-الكولين-13) واثنين من المنظفات غير الأيونية (digitonin، تريتون-X100)، والشكل 4D يبين كيف تحميل ضعف ما (200 ميكرولتر) المنظفات بروتين مشحم لم يكن له تأثير ملحوظ على نوعية الكروماتوغرام لفوس الكولين-8، -10، و-13 وDDM. فقط digitonin (برتقالي; الشكل 4C) أعطى اللوني مماثلة لDDM (الأزرق; الشكل 4C) وعلى الرغم من أن فوس-الكولين-13 أعطى ذروة حادة على شكل متناظرة، إلا أنه تم تهوئه مرة أخرى بحجم elution أقل بكثير (14 مل) من حجم DDM (15.5 مل). وعموما، كان هناك اتجاه واضح نحو تحسين التشحيم بواسطة المنظفات ذات السلاسل الجانبية الأطول من 12 أو 13 من مخلفات الكربون؛ على سبيل المثال، DDM > DM > NM (12 أو 10 أو 9 كربونات)، فوس-الكولين-13 > 10 > 8 (13، 10، أو 8 كربونات)، وLMNG > DMNG > OGNG (12 أو 10 أو 8 كربونات)، على التوالي. وهكذا، المنظفات مع ذيول مسعورة من أقل من 12 الكربون كانت المنظفات أقل ملاءمة بكثير لslubilization من Cdr1-mGFPHis من المنظفات مع ذيول أطول الكاره للماء من 12 أو 13 الكربون، والمنظفات غير الأيونية (DDM، LMNG) يبدو عموما أكثر ملاءمة لs solubilization من Cdr1-mGFPHis من المنظفات zwitterionic (الشكل 3D، الشكل 4).

Figure 4
الشكل 4: فحص المنظفات لCDR1-mGFPHis التشحيم باستخدام FSEC. كروماتوجرامات من 100 ميكرولتر من غشاء البلازما الخام ADΔΔ-CDR1-mGFPHis الممتلأ (2 ملغم/مل) مع 1٪ من المنظفات المشار إليها والمنفصلة باستخدام عمود استبعاد حجم Superose 6-increase 10/300 GL. وتصور الصور اللونية وحدات الفلورسينس MGFP النسبية (FU) لحجم عمود واحد (CV؛ 25 مل) من المخزن المؤقت لل elution المجمع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من التقدم الأخير في التحليل الهيكلي للبروتينات الغشاء، لا يوجد هيكل 3D لCD1، أو أي ناقل PDR أخرى، متاح حاليا. لذا ، فإن اكتساب المعرفة بهيكل Cdr1 وميزاته الكيميائية الحيوية أمر مهم ، لأن هذا لن يوفر فقط نظرة ثاقبة على التصميم العقلاني للأدوية الجديدة للتغلب على مقاومة الأدوية بوساطة efflux ، ولكن أيضا في آلية وظيفة عائلة فرعية مهمة من بروتينات ABC.

أحد المتطلبات الرئيسية لتوصيف الهيكلية للبروتينات الغشاء هو التعبير عن بروتين الغشاء مطوية بشكل صحيح وسليمة بكميات المطلوبة لعلم البلورات بالأشعة السينية أو التبريد م. المعايير الهامة عند اختيار نظام التعبير هي سهولة الاستخدام ومعدلات النمو والتكاليف ، وكذلك القدرة على التعبير عن البروتينات مع تعديلات ما بعد الترجمة التي يمكن أن تكون حاسمة لوظيفة و / أو استقرار البروتين61،62.

على مدى العقدين الماضيين S. cerevisiae غشاء البروتين التعبير التكنولوجيا60 وقد تم الأمثل14 لتسهيل الاستنساخ خطوة واحدة من البروتينات الغشائية ذات الفائدة24 الموسومة إما في N- أو C-terminus مع تقارب مختلف, epitope, أو مراسل العلامات و, إذا رغبت في ذلك, مستويات التعبير المكبوتة بشكل متوقع إلى أي مكان بين 50٪ إلى منخفضة تصل إلى 0.1٪ من الحد الأقصى لمستوى التعبير25. هذه المنصة متعددة الاستخدامات التعبير بروتين غشاء البلازما تمكن الباحثين من توصيف مضخات efflux الفطرية بقدر كبير من التفصيل. تطوير وتحسين المقايسات الخلية الكاملة لوظيفة مضخة مكنت من التوصيف الناجح للخصوصية الركيزة24 وحساسية المثبط لعدد من مضخات efflux الفطرية الرئيسية متعددة الأدوية، واستخدمت في شاشات الأدوية عالية الإنتاجية لتحديد رواية42،43،44،أو تأكيد القائمة14،33،36،واسعة الطيف مثبطات مضخة لوكسيف أو لتطوير رواية مثبطات مضخة efflux محددة لCDR141.

على الرغم من أن منصة التعبير الموجودة قد استخدمت بنجاح للتعبير عن ناقلات ABC الفطرية من مجموعة من الفطريات ، بما في ذلك Basidomycota (C). neoformans Mdr1) ،14 الفطريات الخيطية مثل P. marneffei (Abc1)37 والعديد من أنواع Saccharomycotina (على سبيل المثال ، S. cerevisiae Pdr5 ، C. glabrata Cdr1 و Cdr2 ، C. استخدام Cdr1 ، C. krusei Abc1 ، Abc11 و Abc12 و C. albicans Cdr1 و Cdr2) 14،24،32،36،39،60،63 كان هناك نجاح أقل في التعبير عن مستويات عالية من ناقلات ABC البشرية المطوية بشكل صحيح64. وتشير النتائج الأولية إلى أن هذا يرجع إلى بيئة الدهون المحددة التي تتطلب هذه الناقلات للتعبير السليم وظيفة في الخميرة. وتشير الدلائل إلى أن هذا قد يكون صحيحا أيضا بالنسبة لناقلات محطة ABC، على الرغم من أن هذا لم يتأكد بعد تجريبيا.

الأسباب الرئيسية للأنشطة المحددة Cdr1 ATPase أعلى بكثير (أي الاستعدادات مع أغشية أقل تلويثا) التي تم الحصول عليها مع بروتوكول عزل غشاء البلازما على نطاق صغير الأمثل هي ذات شقين: 1) الكسر اليدوي ألطف من الخلايا بالمقارنة مع استخدام الخرز الخافض لإعدادات غشاء البلازما على نطاق أوسع؛ '2' الكسر اليدوي الألطف للخلايا مقارنة باستخدام الخافقة حبة لإعدادات غشاء البلازما على نطاق أوسع؛ '2' الكسر اليدوي الألطف للخلايا مقارنة باستخدام خافز لتحضيرات غشاء البلازما على نطاق أوسع؛ '2' التكسير اليدوي الألطف للخلايا مقارنة باستخدام خافزة لتحضيرات أغشية البلازما على نطاق أوسع؛ '2' الأسباب الرئيسية للأنشطة المحددة التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول عزل أغشية البلازما على نطاق صغير على نطاق أوسع: '1' الكسر اليدوي الألطف للخلايا مقارنة باستخدام مضرب الخرز لإعدادات أغشية البلازما على نطاق أوسع؛ '2' الأسباب الرئيسية للأنشطة المحددة Cdr1 AT و2) حصاد الخلايا في منتصف مرحلة السجل، مما يقلل من التلوث الميتوكوندريا المحتملة بسبب قمع الجلوكوز من الإنزيمات الميتوكوندريا. يمكن تمديد فترات التبريد 3 دقائق بين كل من دورات الكسر الست دون أي تأثير ملحوظ على نوعية أغشية البلازما. تكرار تجميد ذوبان دورات، ومع ذلك، يجب تجنبها لأن الأنشطة ATPase Cdr1 من أغشية البلازما المعزولة خفضت بنسبة ~ 10٪ مع كل دورة تجميد ذوبان إضافية. هذا هو السبب في أنه من المستحسن تقسيم عينات غشاء البلازما إلى أصغر aliquots للحد من الحاجة إلى عدة دورات تجميد ذوبان الجليد. تعمل العلامة المزدوجة mGFPHis على تحسين عائد التنقية وتتيح فحص المنظفات الفعال من خطوة واحدة. وباستخدام هذا البناء، يمكن بسهولة اكتشاف التعريب الصحيح، والطي/الاتجار، والقابلية للحرارة؛ ويمكن إزالة العلامة المزدوجة ، إذا لزم الأمر ، عن طريق الانقسام مع بروتياز متاح تجاريا ، على الرغم من أن الرابط 3 من الأحماض الأمينية بين البروتين المثير للاهتمام والعلامة قد يكون من الضروري تمديده لإزالة العلامة بكفاءة.

مزيج من عدة ميزات في هذه البروتوكولات ، وهي استخدام بوليمرات الحمض النووي المصممة خصيصا لتضخيم PCR مستعمرة من كاسيت تحويل 8 كيلوبايت ؛ الأمثل كفاءة عالية طريقة تحويل الخميرة؛ القدرة على خلق المجمدة المخزونات الخميرة المختصة؛ وبروتوكول إعداد غشاء البلازما على نطاق صغير الأمثل تثبت إنشاء منصة التعبير عن البروتين الغشاء الأمثل قابلة للاستنساخ عالية الإنتاجية، والتعبير، وتوصيف مضخات اي بي سي efflux الفطرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

ويقر المؤلفان بامتنان بتمويل صندوق مارسدن النيوزيلندي (المنحة UOO1305)، ومنحة من كلية الطب، جامعة شولالونغكورن، بانكوك، تايلاند (م. نيمي). وهم يودون أن يشكروا جامعة أوتاجو على منح ج. مدني منحة دراسية لنيل درجة الدكتوراه. كما يود المؤلفان التعبير عن امتنانهما للبروفيسور ستيفان راونسر وزميليه الدكتور أمير أبلباوم والدكتور ديفاناياغاباراثي فيناياغام على دعمهم وإشرافهم خلال زيارة قام بها ج. مدني لمدة 6 أشهر في معهد ماكس بلانك للفسيولوجيا الجزيئية (MPIMP)، دورتموند، ألمانيا. كما يشكر المؤلفون دائرة التبادل الأكاديمي الألمانية (DAAD) على تزويد ج. مدني بمنحة بحثية (57381332) لزيارة MPIMP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S -
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86 (2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74 (2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436 (2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146 (2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231 (2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153 (2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23 (2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191 (2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Tags

علم الأحياء، العدد 172،
إعداد غشاء البلازما على نطاق صغير لتحليل <em>المبيضات albicans</em> Cdr1-mGFPHis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., … More

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter