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Methodenartikel

Herstellung von pseudotypisierten H5-Aviären Influenzaviren mit Calciumphosphat-Transfektionsmethode und Messung der Antikörperneutralisationsaktivität

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DOI:

10.3791/62626

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22. November 2021

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1Nanjing Advanced Academy of Life and Health, 2Institute of Animal Bio-technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, 3National Clinical Research Center for Infectious Diseases, Shenzhen Third People’s Hospital, Southern University of Science and Technology, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verpackung von Pseudoviren und die Messung der Antikörper-neutralisierenden Aktivität.

Zusammenfassung

Seit 1996 verursachen hochpathogene H5-Viren der A/Gans/Guangdong/1/96-Linie Grippeausbrüche bei Geflügel und Wildvögeln. Gelegentlich fallen ihr auch Menschen zum Opfer, was zu einer hohen Sterblichkeit führt. Nichtsdestotrotz wird die HPAI-Virusforschung oft behindert, wenn man bedenkt, dass sie in Laboratorien der biologischen Sicherheitsstufe 3 durchgeführt werden muss. Um dieses Problem zu lösen, werden Pseudoviren als Alternative zu Wildtyp-Viren in einigen Experimenten von H5-HPAI-Studien eingesetzt. Pseudoviren erweisen sich als ideale Werkzeuge, um neutralisierende Antikörper gegen H5-HPAI-Viren zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren und kritischen Schritte von H5-HPAI-Pseudovirus-Präparaten und Pseudovirus-Neutralisationsassays. Außerdem werden die Fehlerbehebung, die Einschränkung und die Modifikationen dieser Assays erörtert.

Einleitung

Seit 1996 verursachen hochpathogene H5-Viren der A/Goose/Guangdong/1/96-Linie der aviären Influenza (HPAI) kontinuierliche Grippeausbrüche bei Geflügel und Wildvögeln, die für enorme sozioökonomische Verluste in der globalen Geflügelindustrie verantwortlich sind. Manchmal infizieren sich auch Menschen damit, was mit einer hohen Sterblichkeitsrate konfrontiert ist 1,2. Die HPAI-Virusforschung wird jedoch häufig behindert, da sie nicht außerhalb von Laboratorien der Biosicherheitsstufe 3 durchgeführt werden kann. Um dieses Problem zu lösen, werden Pseudoviren als Alternative zu Wildtyp-Viren in einigen Experimenten von H5-HPAI-Studien eingesetzt. Pseudoviren sind sicher genug, um in Laboratorien der Biosicherheitsstufe 2 praktiziert zu werden.

H5 HPAI-Pseudoviren gehören zu den chimären Viren, die aus Surrogatviruskernen, Lipidhüllen mit den Oberflächenglykoproteinen von Influenzaviren und Reportergenen bestehen. Pseudoviruskerne stammen in der Regel vom lentiviralen humanen Immundefizienzvirus (HIV), Retroviren wie dem murinen Leukämievirus (MLV) und dem vesikulären Stomatitisvirus (VSV)3. Insbesondere das HIV-1-Verpackungssystem wird häufig zur Herstellung von Influenza-Pseudoviren verwendet, wobei die primären Gene gag und pol sind. Das HIV-Gag-Gen exprimiert Kernproteine. Das pol-Gen exprimiert die Integrase und die reverse Transkriptase, die beide für die Expression des Reportergens in transduzierten Zellen notwendig sind. In Anlehnung an das Genom des Surrogatvirus wird das Reportergen in RNA-Form in den Pseudoviruskern aufgenommen. Das Reportergen exprimiert das Protein in den Wirtszellen. Die Genexpressionsniveaus von Reportergenen können verwendet werden, um die Effizienz von Pseudovirusinfektionen zu messen 3,4. Der primäre Reporter ist die Glühwürmchen-Luciferase zur Messung der relativen Lumineszenzeinheiten (RLU) oder der relativen Luciferase-Aktivität (RLA) in transduzierten Zellen. Andere Reporter wie lacZ, Gaussia und Renilla luciferase werden ebenfalls verwendet, nur in geringerem Maße5.

Pseudoviren sind ideale Werkzeuge, um neutralisierende Antikörper gegen H5-HAPI-Viren zu untersuchen. Um die Potenz der neutralisierenden Antikörper zu messen, werden Pseudovirus-Neutralisations-Assays (PN)6 verwendet. Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) sind Glykoproteine auf der Oberfläche des Influenza-A-Virus 7,8. Die HA besteht aus einer globulären Kopfdomäne für die Rezeptorbindung und einer Stammdomäne für die Membranfusion. Das NA-Protein hat die Sialidase-Aktivität, um die Virusfreisetzung zu erleichtern 7,8. Ein PN-Assay kann neutralisierende Antikörper messen, die gegen HA-Proteine gerichtet sind. Neutralisierende Antikörper, die auf den Kopf- und Stammbereich der HA gerichtet sind, können auch durch virale Attachment- und Eintrittsassays nachgewiesen werden. Im Vergleich zu Wildtyp-Viren haben Pseudovirus-Neutralisationsexperimente empfindlichere Nachweiswerte, können in einem Biosicherheitslabor der Stufe 2 sicher durchgeführt werden und sind in der Praxis im Allgemeinen einfacher zu bedienen.

In diesem Protokoll werden die Verfahren und kritischen Schritte von H5-HPAI-Pseudoviruspräparaten und PN-Assays detailliert beschrieben. Außerdem werden die Fehlerbehebung, die Einschränkung und die Modifikationen dieser Assays erörtert. In dieser Arbeit wurde der Stamm A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) von H5N1 HPAI-Viren als Beispiel verwendet. Um die in Assays verwendeten Immunseren zu erhalten, wählte dieses Protokoll das aus dem TH-Stamm stammende HA-Protein als Immunogen für die Immunisierung von Mäusen aus.

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Protokoll

Alle Pseudovirus-bezogenen experimentellen Operationen wurden unter ABSL2-Bedingungen im Institut Pasteur der Shanghai Chinese Academy of Sciences (IPS, CAS) durchgeführt. Die Tierversuche wurden auf der Grundlage der vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Tierprotokolle von IPS, CAS durchgeführt.

1. Pseudovirusverpackung mit Calciumphosphat-Transfektion

  1. Einzelzellsuspensionen von HEK293FT Zellen (9 x 10,5 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium herstellen (Tabelle 1). Geben Sie 10 ml der einzelligen Suspensionen in einen T75-Kolben und inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid (CO2) für 20 h vor der Transfektion.
    HINWEIS: HEK293FT niedriger Durchgang (<20 Durchgänge) wird empfohlen. Stellen Sie sicher, dass die Zellmonoschicht zu 80-90% konfluent ist.
  2. Ersetzen Sie das Medium 2 h vor der Transfektion durch 10 ml frisches Komplettmedium mit Chloroquin (100 μM).
  3. Mischen Sie die Reagenzien und die Plasmid-DNA wie in Tabelle 2 und Abbildung 1 gezeigt: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl2und 2x HEPES-Puffer. Pipettieren Sie 5 Mal vorsichtig auf und ab, inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur (RT) für 20 Minuten.
  4. Übertragen Sie die Mischung in das Medium über den Zellen und schaukeln Sie den Kolben vorsichtig. Inkubieren Sie die Zellen im Zellinkubator für 15 h.
  5. Ersetzen Sie das Medium durch 15 ml frisches, vollständiges DMEM-Medium. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -Anteil für 65 h.
    HINWEIS: Die Farbe des Mediums ist hellorange oder leicht gelblich, und mindestens 80 % der Zelle sollten unter dem inversen Lichtmikroskop den zytopathischen Effekt (CPE) zeigen.
  6. Ernten Sie den Überstand und zentrifugieren Sie ihn bei 2095 x g für 20 Minuten bei 4 °C. Den Überstand auffangen, aliquotieren und bei -80 °C lagern.

2. Nachweis der HA-, NA- und HIV-1-p24-Proteinexpression des Influenza-Pseudovirus

  1. Nachweis der HA-Proteinexpression mittels Hämagglutinin (HA)-Assay.
    1. Geben Sie 50 μl PBS in die Spalten 2-12, Zeilen A, B und C einer 96-Well-Platte mit rundem Boden.
      HINWEIS: Die Zeilen A, B und C gehören zu 3 unabhängigen Replikationstests, und Spalte 12 wird als Negativkontrolle verwendet.
    2. Geben Sie 100 μl Pseudovirus in die Vertiefungen von Spalte 1. Übertragen Sie 50 μl von Säule 1 in Säule 2, mischen Sie gut, indem Sie 5 Mal auf und ab pipettieren, führen Sie die zweifachen Verdünnungen bis zur letzten Säule 11 durch und verwerfen Sie die zusätzlichen 50 μl aus Säule 11.
    3. Geben Sie 50 μl 0,5%ige Erythrozyten in jede Vertiefung und pipettieren Sie sie zweimal vorsichtig auf und ab. Inkubieren Sie die Platte für 30-60 min bei RT oder bis die Erythrozyten der Negativkontrolle die regelmäßigen Flecken am Boden der Vertiefung bilden.
    4. Beobachten und notieren Sie die HA-Titer des Pseudovirus.
      HINWEIS: Die HA-Einheit der Pseudoviren ist der höchste Verdünnungsfaktor des Virus, der eine 100%ige Hämagglutination der roten Blutkörperchen verursachen kann.
  2. Nachweis der HA- und NA-Proteinexpression mit dem Western-Blot-Assay.
    HINWEIS: Alle Western-Blot-Schritte werden gemäß dem Handbuch der molekularen Klonierung (4. Auflage) durchgeführt.
  3. Nachweis der HIV-1 p24 Proteinexpression mit dem HIV-1 p24 ELISA Kit (Table of Materials).
    1. Geben Sie 50 μl des Lysepuffers in 450 μl Pseudovirusprobe. Mischen Sie es gründlich.
    2. Geben Sie 300 μl des Waschpuffers in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte. Schlagen Sie die Platte auf den Kopf, um den Waschpuffer vollständig zu entfernen. Wiederholen Sie den Waschgang 5 Mal.
    3. Geben Sie 200 μl des Standards und der Proben separat in jede Welle. Bei 37 °C über Nacht oder 2 h inkubieren.
    4. Saugen Sie den Inhalt der Platte ab und waschen Sie die Platte wie in Schritt 2.3.2 beschrieben.
      Anmerkungen: Lassen Sie eine Vertiefung der Assay-Platte leer, um sie als leeres Substrat zu verwenden.
    5. Geben Sie 200 μl der p24-Detektorantikörper in jede Welle. Bei 37 °C 1 h inkubieren. Aspirieren und waschen Sie die Platte wie in Schritt 2.3.2 beschrieben.
    6. In jede Vertiefung werden 100 μl der Streptavidin-Peroxidase-Arbeitslösung gegeben und bei 37 °C für 30 min inkubiert. Aspirieren und waschen Sie die Platte wie in Schritt 2.3.2 beschrieben.
    7. Geben Sie 100 μl der Arbeitslösung des Unterzustands in jede Vertiefung, einschließlich der Substrat-Blindvertiefung, und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 30 min.
      Anmerkungen: In den Vertiefungen entwickelt sich eine blaue Farbe.
    8. Geben Sie 100 μl des Stopppuffers in jede Vertiefung.
      Anmerkungen: Die blaue Farbe ändert sich sofort in Gelb.
    9. Lesen Sie die optische Dichte bei 450 nm innerhalb von 15 Minuten ab. Erfassen Sie die p24-Titer des Pseudovirus

3. Pseudovirus-Titration

  1. Stellen Sie Einzelzellsuspensionen von MDCK-Zellen (5 x 104 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium her, fügen Sie 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 und 40000 Zellen zu verschiedenen Vertiefungen einer 96-Well-Flachbodenplatte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -Anteil für 20 h.
  2. Nehmen Sie das Pseudovirus aus dem -80 °C warmen Kühlschrank, tauen Sie es auf dem Eis auf und wirbeln Sie das Pseudovirus vor.
  3. Fügen Sie 6 HAU-Pseudoviren (6x HA-Einheiten) zu jeder Vertiefung der 96-Well-Rundbodenplatte hinzu und füllen Sie jede Vertiefung mit vollständigem DMEM bis zu 120 μl auf.
  4. Pipettieren Sie die Mischung 5 Mal auf und ab, um sie gründlich zu mischen. Inkubieren Sie die Mischplatte in einem 37 °C, 5 % CO2 - Inkubator für 1 Stunde.
  5. Übertragen Sie 100 μl der Mischung auf die Zellen in der 96-Well-Platte. Legen Sie die Zellkulturplatte nach der Virusinfektion für 48 h, 60 h und 72 h wieder in den Inkubator.
  6. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und führen Sie den Luciferase-Test durch (Materialtabelle).
  7. Entfernen Sie das Medium vorsichtig aus den Vertiefungen der Platte. Spülen Sie die Zellen mit 200 μl PBS und entfernen Sie das PBS so weit wie möglich.
    Anmerkungen: Drehen Sie die Platte um und entsorgen Sie den Überstand, indem Sie ihn rückwärts auf saugfähiges Papier schlagen. Wenn die Testzelllinie nicht fest am Boden haften konnte, entfernen Sie die Aspiration des Mediums vorsichtig.
  8. Geben Sie 50 μl des Lysepuffers in jede Vertiefung und schaukeln Sie die Kulturplatte mehrmals. Lagern Sie die Platte über Nacht bei -80 °C.
    Anmerkungen: Mischen Sie 1 Volumen 5x Lysepuffer mit 4 Volumen Wasser, um den 1x Lysepuffer herzustellen. Äquilibrieren Sie den 1x Lysepuffer vor der Verwendung mit RT. Schaukeln Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig mit dem Lysepuffer bedeckt sind. Der einzelne Gefrier-Auftau-Prozess kann dazu beitragen, dass die Zelle vollständig lysiert wird.
  9. Platte herausnehmen, 2 h bei RT äquilibrieren.
    HINWEIS: Die Zelle sollte vollständig lysiert sein.
  10. Schaukeln Sie die Platte mehrmals vorsichtig und übertragen Sie alle Zelllysate auf undurchsichtige 96-Well-Platten.
  11. Geben Sie 50 μl des Substrats in jede Vertiefung, schaukeln Sie die Platte mehrmals vorsichtig und mischen Sie Substrat und Lysepuffer gründlich.
  12. Messen Sie das erzeugte Licht innerhalb von 5 Minuten mit einem Luminometer. Notieren Sie die Luciferase-Titer des Pseudovirus.
    Anmerkungen: Wenn ein geeignetes Substrat hinzugefügt wird, wird Licht als Nebenprodukt über eine chemische Reaktion emittiert, bei der Luciferin durch das Luciferase-Enzym in Oxyluciferin umgewandelt wird. Die erzeugte Lichtmenge ist proportional zur Menge des Luciferase-Enzyms.

4. Vorbereitung der Immunseren

HINWEIS: Das Immunserum wird für zellbezogene Experimente verwendet, und der experimentelle Betrieb sollte unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden.

  1. Bereiten Sie 12 acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse vor. Teilen Sie die Mäuse gleichmäßig in zwei Gruppen ein.
    HINWEIS: Eine Gruppe war die DDV-Gruppe und die andere war die Negativkontrollgruppe.
  2. Immunisierung der DDV-Gruppe: Zweimal intramuskulär mit 100 μg eines Codon-optimierten DNA-Plasmids, das für das HA-Protein A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) HA kodiert, in Woche 0 und Woche 3 und einmal intraperitoneal mit 512 HAU TH-Virus-ähnlichen Partikeln (VLP) in Woche 6 geboostert.
  3. Immunisierung der Kontrollgruppe: In Woche 0 und Woche 3 zweimal intramuskulär mit 100 μg leerer Vektorplasmid-DNA primen und in Woche 6 einmal intraperitoneal mit HIV-1 gag VLP boostern.
  4. Sammeln Sie das Mäuseblut 2 Wochen nach der letzten Impfung.
    HINWEIS: Hier wurden die Mäuse zum Zeitpunkt der Blutentnahme mit Pentobarbital-Natrium (65 mg/kg) betäubt. Nach der Blutentnahme aus der Vena submandibularis wurden die Mäuse sofort mit CO2 eingeschläfert.
  5. Bewahren Sie das Blut 2 h bei RT auf, dann über Nacht bei 4 °C. Bei 900 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand auffangen. Deaktivieren Sie die Seren, indem Sie sie 30 min lang bei 56 °C aussetzen.
  6. Lagern Sie die Immunseren zur Verwendung in einem Kühlschrank bei -80 °C.
    HINWEIS: In der ergänzenden Abbildung 1 finden Sie das Flussdiagramm, das die wichtigsten Verfahren der Mäuseimmunisierung beschreibt.

5. Pseudovirus-Neutralisations-Assay (PN)

  1. Stellen Sie Einzelzellsuspensionen von MDCK-Zellen (5 x 104 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium her und geben Sie 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Flachbodenplatte. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -Anteil für 20 h.
  2. Nehmen Sie das Pseudovirus und die Seren aus dem -80 °C warmen Kühlschrank, tauen Sie es auf dem Eis auf und wirbeln Sie es gründlich vor.
  3. Verdünnen Sie die Seren 20-mal im gesamten Medium und geben Sie 100 μl des vollständigen DMEM-Mediums in die Vertiefungen einer 96-Well-Rundbodenplatte aus den Säulen 2-10.
  4. Geben Sie 200 μl der verdünnten Seren in die Vertiefungen von Spalte 2, übertragen Sie 100 μl von Spalte 2 in Spalte 3, verdünnen Sie die Seren nacheinander von Spalte 2 bis Spalte 10 auf 1:10240 und verwerfen Sie die 100 μl aus Spalte 10.
  5. Als Negativkontrolle werden 100 μl DMEM-Komplettmedium in die Vertiefungen der Säule 11 gegeben.
  6. Geben Sie 100 μl Pseudoviren in jede Vertiefung, pipettieren Sie das Gemisch 5 Mal gründlich auf und ab und inkubieren Sie die Gemischplatte bei 37 °C, 5 % CO2 für 1 h.
  7. Übertragen Sie 100 μl des Gemisches von der 96-Well-Rundbodenplatte in die entsprechende Vertiefung der 96-Well-Zellkulturplatte. Legen Sie die Platte für 60 h wieder in den Inkubator (37 °C, 5 %CO 2).
  8. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator. Führen Sie den Luciferase-Assay wie in den Schritten 3.7-3.12 beschrieben durch.

6. Assay zur Anhängung von Pseudoviren

  1. Stellen Sie Einzelzellsuspensionen von MDCK-Zellen (4 x 104 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium her und fügen Sie 100 μl Zellsuspensionen zu jeder Vertiefung in einer 96-Well-Flachbodenplatte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5% CO2 für 20 h.
  2. Inkubieren Sie das Pseudovirus mit Seren in DMEM mit 1% BSA bei 4 °C über Nacht.
    Anmerkungen: Das Volumen der Mischung beträgt 100 μl.
  3. Blockieren Sie die MDCK-Zellen mit 100 μl DMEM mit 1 % BSA pro Well bei 4 °C für 1 h.
  4. Das Pseudovirus-Serum-Gemisch (100 μL) wird auf die MDCK-Monoschicht geimpft und bei 4 °C für 2 h inkubiert.
  5. Waschen Sie die Zellplatte 4 Mal mit PBS, das 1 % BSA enthält, um ungebundene Viren zu entfernen.
  6. Lyse der Zellen mit 100 μL Luciferase-Lysepuffer bei RT für 30 min.
  7. Quantifizieren Sie die Menge des gebundenen Virus auf den Zellen mit einem HIV-1 p24 ELISA-Kit wie oben beschrieben (Abschnitt 2.3).

7. Beurteilung des Viruseintritts

  1. Stellen Sie Einzelzellsuspensionen von MDCK-Zellen (5 x 104 pro ml) in vollständigem DMEM-Medium her und geben Sie 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Flachbodenplatte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 für 20 h vor dem Assay.
  2. Inokulieren Sie das Pseudovirus (100 μL) auf einer MDCK-Monoschicht in einer 96-Well-Platte bei 4 °C für 6 h.
  3. Waschen Sie die Zellplatte 4 Mal mit PBS, das 1% BSA enthält, um ungebundene Pseudoviren zu entfernen.
  4. 100 μl der seriell verdünnten Immunseren oder Seren von Scheinimpfmäusen in DMEM mit 1 % BSA in die Monoschicht geben und die Zelle bei 4 °C für 2 h inkubieren.
  5. Entfernen Sie den Zellüberstand und waschen Sie die Zellkulturplatte 4 Mal mit PBS, das 1% BSA enthält.
  6. Frisches DMEM in die Zellen geben und 60 h in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 -% inkubieren.
  7. Messen Sie die relative Luciferase-Aktivität (RLA) der Zellen, wie in den Schritten 3.7-3.12 beschrieben.
    HINWEIS: Der virale Eintrag, wie von RLA angegeben, wurde als Prozentsatz des Messwerts ausgedrückt, der in Abwesenheit von Seren erhalten wurde, was auf 100% festgelegt wurde.

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Ergebnisse

HA, NA und HIV-1 p24 Proteinexpression des Influenza-Pseudovirus
Um die Effizienz der Virusverpackung zu ermitteln, wurden zunächst Influenza-Pseudovirusbestände mittels HA-Assay nachgewiesen (Abbildung 2A). Die HA-Einheiten pro Milliliter Influenza-Pseudoviren betragen 643 (Tabelle 3). Western-Blot-Assays und Sandwich-ELISA-Assays wurden verwendet, um die HA-, NA- und HIV-1 p24-Proteinexpression zu testen. Anschließend wurden die Verhältnisse der HA-Einh...

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Diskussion

HEK293FT Zellen werden in der Regel als Verpackungszellen zur Herstellung von Pseudoviren verwendet. Ein regelmäßiger Mykoplasmennachweis ist während der Zellkultur unerlässlich. Eine Mykoplasmenkontamination kann die Ausbeute an Pseudoviren drastisch verringern und manchmal nahe Null liegen. Im Vergleich zu anderen Kontaminationen führen Mykoplasmen-Kontaminationen nicht zu pH-Wert-Veränderungen oder Trübungen des Zellkulturmediums. Selbst eine hohe Konzentration von Mykoplasmen ist mit bloßem Auge oder unter dem Mikros...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die Forschungsstipendien des Innovation Capacity Building Project der Provinz Jiangsu (BM2020019), des Shenzhen Scientific and Technological Project (Nr. JSGG20200225150702770), Strategic Priority Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDB29030103), Guangdong Scientific and Technological Project (Nr. 2020B1111340076) und das Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (Nr. SZBL202002271003).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 % Chiken Erythrozyten-BiokanalBC-RBC-C001Reagenz
96-Well-Zellkulturplatten (flacher Boden)Thermo fisher scientific167008Verbrauchsmaterial
96-Well-Zellkulturplatten (runder Boden)Thermo fisher scientific163320Verbrauchsmaterial
Allegra X-15RBeckman-Schar-Ausrüstung/Zentrifuge
BD InsulinspritzenBD324910Verbrauchsmaterial
Calciumchlorid wasserfreiAMRESCO1B1110-500GReagenz
ChloroquindiphosphatSelleckS4157Reagenz
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12100-046Reagenz
Fötales RinderserumGibco16000-044Reagenz
HEK293FTGibcoR700-07Zelllinie
HEPES FREIE SÄUREAMRESCO0511-250GReagenz
HIV-1 p24 Antigen ELISAZeptoMetrix801111Reagenzkit
Luciferase Assay System Gefrierschrank PackPromegaE4530Reagenzien-Kit
MDCK.1ATCCCRL-2935
Mikrozentrifugenröhrchen für die Zelllinie 1,5 mLThermo fisher scientific509-GRD-QVerbrauchsmaterial
Nunc Konische Zentrifugenröhrchen 15 mLThermo fisher scientific339650Verbrauchsmaterial
Nunc Konische Zentrifugenröhrchen 50 mLThermo fisher scientific339652Verbrauchsmaterial
Nunc EasYFlask 75 cm2Thermo fisher wissenschaftliches156499Verbrauchsmaterial
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
(10 μ L)Thermo fisher scientificTF102-10-QVerbrauchsmaterial
Pipettenspitzen (100 μ L)Thermo fisher scientificTF113-100-QVerbrauchsmaterial
Pipettenspitzen (1000 μ L)Thermo fisher scientificTF112-1000-QVerbrauchsmaterial
Serologische Pipetten (5 mL)Thermo fisher scientific170355NVerbrauchsmaterial
Serologische Pipetten (10 mL)Thermo fisher scientific170356NVerbrauchsmaterial
Trypsin/EDTAGibco25200-072Reagenz
Varioskan FlashThermo fisher wissenschaftlich--Ausrüstung/Mikroplatten-Reader
Wassermantel-InkubatorThermo fisher scientific3111Ausrüstung/Zell-Inkubator
Pentobarbital-NatriumsalzSigma57-33-0Reagenz
Reagenz-Pipettenspitzen

Referenzen

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  12. Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
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  14. Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
  15. Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69(2020).
  16. Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
  17. Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).

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