여기에서는 유사 바이러스 패키징 및 항체 중화 활성 측정을 위한 프로토콜을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
Calcium Phosphate transfection 방법을 이용한 pseudo-typed H5 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 및 항체 중화 활성 측정
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
1996년 이래로 A/goose/Guangdong/1/96 계통의 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI) H5 바이러스는 가금류와 야생 조류에서 독감 발병을 일으키고 있습니다. 때때로 인간도 희생되어 사망률이 높습니다. 그럼에도 불구하고 HPAI 바이러스 연구는 생물 안전성 레벨 3 실험실에서 처리되어야 한다는 점을 고려할 때 종종 방해를 받습니다. 이 문제를 해결하기 위해 H5 HPAI 연구의 일부 실험에서 유사 바이러스가 야생형 바이러스의 대안으로 채택되었습니다. 슈도바이러스는 H5 HPAI 바이러스에 대한 중화 항체를 연구하는 데 이상적인 도구임이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 H5 HPAI 유사바이러스 제제 및 유사바이러스 중화 분석의 절차와 중요한 단계를 설명합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결, 제한 및 수정에 대해 설명합니다.
서론
1996년 이래로 A/goose/Guangdong/1/96 계통 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI) H5 바이러스는 가금류와 야생 조류에서 지속적인 독감 발병을 일으켜 전 세계 가금류 산업에서 막대한 사회경제적 손실을 초래했습니다. 때로는 인간도 감염되어 높은 치사율 1,2에 직면합니다. 그러나 HPAI 바이러스 연구는 생물 안전성 레벨 3 실험실 밖에서 처리 할 수 없기 때문에 종종 방해를 받습니다. 이 문제를 해결하기 위해 H5 HPAI 연구의 일부 실험에서 유사 바이러스가 야생형 바이러스의 대안으로 채택되었습니다. 슈도바이러스는 생물안전성 레벨 2 실험실에서 실습할 수 있을 만큼 안전합니다.
H5 HPAI 슈도바이러스는 대리 바이러스 코어, 인플루엔자 바이러스의 표면 당단백질이 있는 지질 외피 및 리포터 유전자로 구성된 키메라 바이러스에 속합니다. 슈도바이러스 코어는 일반적으로 렌티바이러스 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 및 수포성 구내염 바이러스(VSV)와 같은 레트로바이러스에서 파생됩니다.3. 특히, HIV-1 패키징 시스템은 인플루엔자 슈도바이러스를 생산하....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 슈도바이러스 관련 실험 작업은 상하이 중국과학원 파스퇴르 연구소(IPS, CAS)에서 ABSL2 조건 하에서 수행되었습니다. 동물 실험은 IPS, CAS의 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 동물 프로토콜을 기반으로 수행되었습니다.
1. Calcium-phosphate transfection을 사용한 유사바이러스 패키징
- 완전한 DMEM 배지에서 HEK293FT 세포(mL당 9 x 105)의 단일 세포 현탁액을 만듭니다(표 1). 단세포 현탁액 10 mL를 T75 플라스크에 넣고, 형질감염 전에 20 시간 동안 37°C, 5% 이산화탄소 (CO2) 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션한다.
알림: HEK293FT 낮은 통로(<20통로)를 권장합니다. 셀 단층이 80-90% 합류하는지 확인하십시오. - 형질감염 2시간 전에 배지를 클로로퀸(100μM)을 함유하는 완전한 신선한 배지 10mL로 교체합니다.
- 표 2 및 도 1에 나타낸 바와 같이 시약 및 플라스미드 DNA를 혼합한다: ddH2O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pH....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현 인플루엔자 슈도바이러스
바이러스 패키징 효율을 확인하기 위해, 인플루엔자 슈도바이러스 스톡을 먼저 HA 분석에 의해 검출하였다(도 2A). 인플루엔자 슈도바이러스의 밀리리터당 HA 단위는 643입니다(표 3). 웨스턴 블롯 분석 및 샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 HA, NA 및 HIV-1 p24 단백질 발현을 테스트했습니다. 이어서, HA 단위의 비율 및 슈도바이러스에 대한 gag p24의 양을 계산하였다. 웨스턴 블롯 분석의 결과는 HA0, HA1, HA2 및 NA 단백질의 4가지 단백질 유형이 있음을 보여주었습니다(보충 그림 2). 이는 인플루엔자 슈도바이러스의 외피 단백질이 야생형 바이러스의 외피 단백질과 유사함을 나타냅니다. HA와 Gag p24의 비율은 보고된 바와 같이 정상 범위 내에 있었다(
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
HEK293FT 세포는 일반적으로 슈도바이러스를 생산하기 위한 포장 세포로 사용됩니다. 정기적인 마이코플라스마 검출은 세포 배양 중에 필수적입니다. 마이코플라스마 오염은 슈도바이러스 수율을 급격히 감소시킬 수 있으며 때로는 0에 가까울 수 있습니다. 다른 오염과 비교할 때, 마이코플라스마 오염은 세포 배양 배지의 pH 값 변화 또는 탁도를 유발하지 않습니다. 고농도의 마이코 플라스마조차도 육안이나 현미경으로 볼 수 없습니다. 마이코플라스마 검출의 세 가지 인기 있는 방법은 마이코플라스마 배양, 형광 DAPI 또는 Hoechst 33258을 사용한 DNA 염색, 중합효소 연쇄 반응(PCR)입니다. 배양 샘플에서 마이코플라스마 DNA를 증폭하는 PCR은 빠르고 쉽고 신뢰할 수 있는 마이코플라스마 검사에 널리 사용된다10.
칼슘 포스페이트 매개 형질감염은 고효율, 저비용 및 쉬운 조작으로 인해 수년 동안 인플루엔자 슈도바이러스 패키징에 사용되.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 장쑤성 혁신 역량 강화 프로젝트(BM2020019), 선전 과학 기술 프로젝트(No. JSGG20200225150702770), 중국과학원(XDB29030103)의 전략적 우선 연구 프로그램, 광동 과학 기술 프로젝트(No. 2020B1111340076) 및 Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program(No. SZBL202002271003).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1% Chiken 적혈구 | 채널 | BC-RBC-C001 | 시약 |
| 96웰 세포 배양 플레이트(평면 바닥) | Thermo fisher scientific | 167008 | 소모품 |
| 96웰 세포 배양 플레이트(둥근 바닥) | Thermo fisher scientific | 163320 | 소모품 |
| Allegra X-15R | Beckman 쿨터 | -- | 장비/원심분리기 |
| BD 인슐린 주사기 | BD | 324910 | 소모품 |
| 염화칼슘 무수 | AMRESCO | 1B1110-500G | 시약 |
| 클로로퀸 이인산염 | Selleck | S4157 | 시약 |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | 시약 |
| 태아 소 혈청 | Gibco | 16000-044 | 시약 |
| HEK293FT Gibco | R700-07 | 세포주 | |
| HEPES 유리산 | AMRESCO | 0511-250G | 시약 |
| HIV-1 p24 항원 ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | 시약 키트 |
| Luciferase 분석 시스템 냉동고 팩 | Promega | E4530 | 시약 키트 |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | 세포주 |
| 마이크로 원심분리기 튜브 1.5mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | 소모품 |
| Nunc 원추형 원심분리기 튜브 15mL | Thermo fisher scientific | 339650 | 소모품 |
| Nunc 원추형 원심분리기 튜브 50mL | Thermo fisher scientific | 339652 | 소모품 |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | 소모품 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | 시약 |
| 피펫 팁 (10 μ L) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | 소모품 |
| 피펫 팁 (100 μ L) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | 소모품 |
| 피펫 팁 (1000 μ L) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | 소모품 |
| Serological pipets(5mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | 소모품 |
| Serological pipets(10mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | 소모품 |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | 시약 |
| Varioskan Flash | Thermo fisher 과학 | -- | 장비/마이크로플레이트 리더 |
| 워터 재킷 인큐베이터 | Thermo fisher scientific | 3111 | 장비/세포 인큐베이터 |
| 펜토바르비탈 나트륨 염 | 시그마 | 57-33-0 | 시약 |
참고문헌
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
