Summary
Questo documento delinea i metodi di base per standardizzare fattori importanti come la densità, la disponibilità di mangime, la fonte di idratazione e i controlli ambientali per l'allevamento a lungo termine di colture di laboratorio del grillo commestibile, Gryllus bimaculatus.
Abstract
Gryllus bimaculatus (De Geer) è un grillo di grandi dimensioni distribuito in tutta l'Africa e l'Eurasia meridionale dove viene spesso raccolto in natura come cibo umano. Al di fuori del suo areale nativo, la coltivazione di G. bimaculatus è fattibile grazie alla sua plasticità alimentare, al rapido ciclo riproduttivo, alla mancanza di fabbisogno di diapausa, alla tolleranza per l'allevamento ad alta densità e alla robustezza contro gli agenti patogeni. Pertanto, G. bimaculatus può essere un modello versatile per studi di fisiologia, comportamento, embriologia o genetica degli insetti.
I parametri culturali, come la densità di allevamento, i reffugia all'interno della gabbia, il fotoperiodo, la temperatura, l'umidità relativa e la dieta, influenzano tutti la crescita, il comportamento e l'espressione genica del cricket e dovrebbero essere standardizzati. Nella fiorente letteratura sull'allevamento di insetti per il consumo umano, questi grilli sono spesso impiegati per valutare i candidati additivi per mangimi derivati da residui di colture, sottoprodotti della lavorazione degli alimenti e altri flussi di rifiuti a basso costo.
Per supportare gli esperimenti in corso che valutano le prestazioni di crescita di G. bimaculatus e la qualità nutrizionale in risposta a substrati di alimentazione variabili, è stato sviluppato un set completo di protocolli standard per l'allevamento, la manutenzione, la manipolazione, la misurazione e l'eutanasia in laboratorio ed è presentato qui. Un mangime per cricket standard del settore si è dimostrato nutrizionalmente adeguato e funzionalmente appropriato per il mantenimento a lungo termine degli stock di riproduzione del cricket, nonché per l'uso come mangime di controllo sperimentale. L'allevamento di questi grilli ad una densità di 0,005 grilli / cm3 in gabbie di polietilene da 29,3 L con schermo a una temperatura media di 27 ° C su un fotoperiodo 12 chiaro (L) / 12 scuro (D), con fibra di cocco inumidita che serve sia come fonte di idratazione che come mezzo di ovodeposizione ha sostenuto con successo grilli sani per un arco di 2 anni. Seguendo questi metodi, i grilli in un esperimento controllato hanno prodotto una massa media di 0,724 g 0,190 g al raccolto, con l'89% di sopravvivenza e il 68,2% di maturazione sessuale tra lo stoccaggio (22 giorni) e il raccolto (65 giorni).
Introduction
Come tipizzato dall'insetto iconico, il moscerino della frutta Drosophila melanogaster, l'uso degli insetti come organismi modello di laboratorio offre vantaggi distinti per gli studi in genetica, tossicologia e fisiologia1. Le piccole dimensioni degli insetti riducono lo spazio necessario per le colture e la quantità di mangimi e materiali di consumo necessari. Molti insetti si riproducono rapidamente rendendoli particolarmente adatti alla creazione di linee genetiche specializzate e studi che richiedono la valutazione di più generazioni successive.
Molti studi si concentrano su insetti olometaboli come Drosophila, che presentano metamorfosi e pupa complete. Tuttavia, sono disponibili altri modelli, tra cui Gryllus bimaculatus (De Geer), il cricket da campo a due punte. G. bimaculatus è un insetto paurometabolo che subisce tra 7 e 11 stelle ninfali prima di raggiungere la maturità sessuale2. Questo cricket mostra una vasta gamma di comportamenti legati alla selezione sessuale, tra cui la stridulazione, le esposizioni territoriali e la guardia del compagno3. I grilli immaturi sono diversi dalle larve delle specie di insetti olometaboli in quanto, simili a molti giovani paurometaboli, sono in grado di rigenerare gli arti persi e danneggiati durante l'ecdisi4. Inoltre, il genoma completamente sequenziato di G. bimaculatus è stato pubblicato nel 20215. Queste caratteristiche rendono questi grilli attraenti come obiettivo per la ricerca di base.
I grilli da campo a due macchie sono ampiamente allevati per cibo umano e mangimi per animali. La scala di queste operazioni è spesso molto più ampia che per la ricerca di laboratorio 6,7. Nonostante la differenza di scala, le sfide affrontate dai ricercatori si sovrappongono notevolmente a quelle incontrate dagli agricoltori di cricket commerciali. Queste considerazioni convergono nel contesto della ricerca di laboratorio che mira a migliorare la produzione di insetti commestibili. Mentre l'industria degli insetti commestibili continua ad evolversi e crescere, l'ottimizzazione degli input di mangime e di una miriade di altri aspetti della produzione è un obiettivo primario8. Studi di laboratorio che dimostrano miglioramenti misurati nell'efficienza di allevamento, nella sopravvivenza o nel tempo di generazione in questi grilli hanno il potenziale per contribuire ad aumentare la redditività delle operazioni di allevamento di cricket a lungo termine.
I protocolli di allevamento standardizzati consentono un confronto più ravvicinato tra gli studi che studiano l'ottimizzazione dell'allevamento. Ad oggi sono stati pubblicati pochi protocolli approfonditi per l'allevamento di G. bimaculatus in laboratorio. Un protocollo ideale rifletterebbe le condizioni incontrate nelle operazioni di allevamento di cricket del mondo reale, pur mantenendo le condizioni strettamente controllate necessarie per misurare con precisione i cambiamenti nelle prestazioni di crescita derivanti da trattamenti sperimentali ed evidenziando le strategie di mitigazione del rischio. I metodi descritti in questo documento sono stati sviluppati sulla base di protocolli, tecniche e apparati pubblicati utilizzati per allevare una varietà di specie di cricket in una vasta gamma di scale di produzione di laboratorio e commerciale 2,9,10,11,12. Questi metodi sono anche informati da diverse fonti non peer reviewed, tra cui bollettini tecnici non pubblicati e comunicazioni personali con gli agricoltori di cricket commerciali in Nord America. Questo protocollo è stato sviluppato con l'intenzione di facilitare la creazione di colture di laboratorio di G. bimaculatus specificamente per l'uso in prove relative all'agricoltura degli insetti.
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Protocol
1. Preparazione del substrato di ovodeposizione
NOTA: La fibra di cocco è un substrato di ovodeposizione ideale per G. bimaculatus. Per i metodi dettagliati su come separare la fibra di cocco dal mattone di cocco compresso e una nota sulla sicurezza respiratoria, vedere la fase 1.1 relativa ai materiali supplementari .
- Lavarsi le mani con acqua e sapone.
- Tarare un contenitore pulito su una bilancia e pesare una massa di fibra di cocco secca delle dimensioni di un pugno umano.
- Posizionare la fibra di cocco in un contenitore sigillabile e pulito, che può ospitare un'espansione fino a 6 volte il volume originale.
- Con le mani pulite, rompere delicatamente ciuffi di fibra di cocco dal pezzo rimosso dal blocco più grande.
- Utilizzando un cilindro graduato da 50 ml, misurare il volume corretto di acqua deionizzata (DI) per ottenere un rapporto 5: 1 in massa di cinque parti di acqua per una parte di fibra di cocco secca.
- Aggiungere lentamente l'acqua DI misurata, idratando uniformemente tutte le particelle di fibra di cocco. Macerare manualmente i ciuffi per garantire un'idratazione uniforme.
- Ri-tarare il contenitore in cui la fibra di cocco è stata precedentemente pesata.
- Pesare 75 g di fibra di cocco bagnata.
- Trasferire 75 g di fibra di cocco bagnata in una capsula di Petri da 100 mm x 15 mm utilizzando un cucchiaio di plastica pulito per garantire che la fibra di cocco sia distribuita uniformemente sul fondo del piatto e che non ci siano ciuffi.
- Etichettare il lato della capsula di Petri con nastro adesivo da laboratorio con un'etichetta che indica la colonia natale e la data dell'evento di raccolta delle uova.
- Misurare altri 45 ml di acqua DI in un cilindro graduato.
- Aggiungere acqua uniformemente sulla superficie della fibra di cocco confezionata nella capsula di Petri per garantire un'idratazione uniforme. Assicurarsi che la fibra di cocco sia satura al punto che l'acqua si accumuli circa 1/4 della strada lungo i lati del contenitore.
- Una volta imballata la capsula di Petri, sigillare la fibra di cocco bagnata rimanente in un recipiente ermetico per lo stoccaggio a -20 °C.
NOTA: Seguendo i metodi prescritti da questo articolo, gli individui di G. bimaculatus raggiungeranno la maturità sessuale dopo una media di 58 giorni dopo l'ovodeposizione. - Raccolta delle uova
- Posizionare il substrato di ovodeposizione idrato in gabbie contenenti le scorte parentali desiderate di grilli il più lontano possibile dal mangime a causa del potenziale per i grilli di trasferire meccanicamente granuli di mangime sul substrato di ovodeposizione.
- Documentare la data e l'ora.
NOTA: La densità di lavoro standardizzata per le colonie riproduttive di cricket allevate seguendo questi metodi è di n = 150 individui adulti. A quella densità, una finestra di ovodeposizione di 24 ore produrrà tra 800 e 1.500 uova a seconda dell'età della colonia, del precedente sforzo di ovodeposizione e del rapporto tra i sessi della gabbia dei genitori. - Posizionare un piccolo contenitore per rifiuti autoclavabile sulla superficie di lavoro per tenere conto del rischio di contenimento rappresentato dalla manipolazione e dalla pulizia dei substrati di ovodeposizione ricchi di uova.
- Posizionare una gabbia di plastica pulita e vuota da 29,3 L sul banco accanto al contenitore della spazzatura per fungere da gabbia ricevente per il substrato di ovodeposizione ricco di uova.
- Posizionare la gabbia da 29,3 L contenente le scorte di cricket genitore e il substrato di ovodeposizione sul lato opposto del contenitore della spazzatura dalla gabbia vuota.
- Dopo 24 ore, rimuovere il substrato di ovodeposizione dalla gabbia del grillo genitore e posizionarlo su un recipiente di scarico autoclavabile.
- Ispezionare la parte superiore del substrato di ovodeposizione per eventuali particelle di frass o mangime che i grilli potrebbero aver calciato sulla superficie della fibra di cocco.
NOTA: Qualsiasi sostanza, che non è massa di uova o fibra di cocco, può causare la formazione di muffe sul substrato durante l'incubazione. - Rimuovere i contaminanti di fibra di cocco nel contenitore dei rifiuti con una scoopula pulita o un cucchiaio di plastica.
- Posizionare il cucchiaio di plastica nel contenitore dei rifiuti.
- Posizionare il substrato di ovodeposizione pulito nella gabbia pulita da 29,3 litri.
- Posizionare la gabbia in un'incubatrice impostata a 27 °C al 60% di umidità relativa su un fotoperiodo di 12 ore D/12 h L.
- Riportare la gabbia contenente il bestiame da riproduzione nella posizione originale e cancellare tutti gli oggetti dalla superficie di lavoro.
- Collocare il ricettacolo dei rifiuti in un congelatore interno dedicato allo stoccaggio di oggetti potenzialmente contaminati da uova di cricket.
- Igienizzare il piano di lavoro con una soluzione di candeggina al 10% e lasciarlo riposare per 60 s.
- Asciugare la superficie di lavoro con un tovagliolo di carta pulito. Aprire il congelatore e smaltire il tovagliolo di carta nel contenitore dei rifiuti.
- Nebulizzazione e monitoraggio giornaliero dei substrati delle uova
NOTA: per i metodi utilizzati per calibrare il volume di nebbia erogato da un flacone spray, vedere La fase 1.2 relativa ai materiali supplementari .- Posizionare un flacone spray sul substrato di ovodeposizione in modo che l'acqua espressa sia distribuita uniformemente sulla superficie del substrato.
- Eseguire il numero di azionamenti della pompa calcolato nella fase 1.2 Materiali supplementari per ciascun substrato di ovodeposizione ogni giorno per 11 giorni consecutivi.
- Controllare quotidianamente ogni substrato di ovodeposizione, monitorando la crescita di muffe filamentose sulla superficie della fibra di cocco.
- Se si osserva una crescita fungina, utilizzare un cucchiaio pulito o una scoopula per rimuovere le macchie di muffa superficiale.
- Smaltire l'utensile e la fibra di cocco rimossa nel contenitore dei rifiuti autoclavabile conservato nel congelatore dell'impianto.
NOTA: non è chiaro se lo stampo abbia un impatto negativo sullo sviluppo del cricket. - Al giorno 11 dopo l'ovodeposizione, inizia a guardare da vicino il substrato per i grilli giovani.
NOTA: A 27 °C, le uova di G. bimaculatus richiedono 11-13 giorni per schiudersi.
- Allestimento di gabbie natali
- Seleziona due piatti in cartone per uova commerciali inutilizzati da 30,8 cm x 30,8 cm (12 pollici x 12 pollici). Con un coltello da utilità o cesoie forti, tagliarle in sei strisce separate larghe 10,1 cm (4 ") di uguali dimensioni. Spazzolare i bordi tagliati con le mani per rimuovere le particelle penzolanti di cartone.
- Posizionare i sei singoli pezzi di cartone da 10,1 cm x 30,8 cm (4 pollici x 12 pollici) verticalmente nella parte inferiore della gabbia con l'asse più lungo del cartone che attraversa l'asse orizzontale più stretto di una gabbia da 29,3 litri. Posizionare un settimo pezzo di cartone piatto sulla parte superiore dei sei pezzi verticali.
- Selezionare tre pezzi di carta assorbente marrone ruvido di circa 25 cm x 25 cm. Piega ciascuno a metà. Posizionane due in modo tale che coprano la parte superiore del lato prossimale della struttura del cartone. Posizionane uno sopra la pila di cartone sul lato distale.
- Al giorno 11 dopo l'ovodeposizione, spostare il substrato di ovodeposizione nell'angolo prossimale destro della gabbia.
- Prendersi cura delle prime stelle
NOTA: Il giorno 14 dopo l'ovodeposizione, la maggior parte delle uova vitali si sarà schiusa e le ninfe di cricket in fase iniziale richiederanno mangime e acqua. I giovani grilli non sono in grado di rompere la tensione superficiale delle goccioline d'acqua e possono annegare se l'acqua viene accumulata nel loro ambiente. Tuttavia, sono anche sensibili all'essiccazione. Fornire un'umidità relativa costante di circa il 60% durante questa fase di sviluppo è importante per garantire la sopravvivenza.- Quando si osserva un portello, nebulizzare gli asciugamani di carta posti sopra la parte superiore dei cartoni al punto 1.4.3 fino a quando non sono bagnati ma non perdono attivamente acqua.
- Pulire accuratamente entrambi i lati di un coperchio della capsula di Petri da 100 mm con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare. Usalo come ricettacolo in cui verrà consegnato il mangime per il cricket.
NOTA: i grilli first-instar richiedono particelle di alimentazione più piccole rispetto ai grilli nelle fasi successive di sviluppo. Questo mangime più fine deve essere somministrato ai grilli per i primi 20 giorni dopo l'emergenza. - Raccogliere 50 g di mangime in un frullatore monodose da 60 watt e macinare a 10.000 giri / min per 1 minuto.
- Misurare 1 g di mangime e agitarlo sul coperchio della capsula di Petri nella gabbia. Usando l'estremità pulita di un cucchiaio o di una scoopula, distribuire il mangime nel modo più uniforme possibile sul fondo del piatto.
- Sostituire il feed ogni 2 giorni. Usa l'estremità del cucchiaio per spazzolare i grilli dal piatto di alimentazione prima di rimuoverlo. Scartare il vecchio mangime nel contenitore dei rifiuti autoclavabile.
- Monitorare la crescita della muffa sul mangime. Se il mangime inizia ad apparire bianco o verdastro, scartare la capsula di Petri e nutrirsi immediatamente.
- A 14 giorni dopo l'ovodeposizione, utilizzare un pennello da 2,54 cm (1 pollice) per rimuovere i grilli aggrappati al substrato di fibra di cocco natale spazzolando tutti i grilli dalla superficie e dai lati della fibra di Petri nella gabbia.
- Posizionare il substrato di ovodeposizione rimosso nel contenitore autoclavabile dei rifiuti e conservarlo nel congelatore fino all'autoclave.
- Sostituire il substrato natale con un piatto di fibra di cocco fresco per l'idratazione preparato seguendo i passaggi 1.1.5-1.1.9.
- Utilizzare una bottiglia di lavaggio dell'acqua DI per aggiungere acqua fino a quando la superficie della fibra di cocco luccica ma non si accumula.
NOTA: la densità del cricket influisce fortemente sulle prestazioni di crescita in G. bimaculatus13. Mantenere lo stock riproduttivo a densità eccessiva rischia di introdurre effetti epigenetici indesiderati indotti dall'affollamento in esperimenti in cui viene utilizzata la loro progenie9. I grilli devono essere "assottigliati" dalle alte densità che emergono dai substrati di ovodeposizione e distribuiti in densità che aderiscono allo standard di 0,005 grilli / cm3 di spazio.
2. Prendersi cura di instars da tre a adulti
- Allestimento di gabbie
NOTA: per i dettagli sulla tecnica di costruzione del coperchio schermato, vedere il passaggio 1.3.1 relativa ai materiali supplementari .- Ripetere il passaggio 1.4.1.
- Installare cinque pezzi di cartone per uova tagliati nell'estremità distale della gabbia in modo che le concavità a forma di uovo siano rivolte verso l'esterno. Assicurarsi che le estremità corte siano circa i lati della gabbia, il lato lungo sia piatto contro il fondo e che ci siano circa 3 cm di spazio tra ogni pezzo di cartone.
- Posizionare l'ultimo pezzo di cartone tagliato sopra i pezzi di cartone verticali come il tetto di una casa, come mostrato nella Figura supplementare S1.
- Seguire i passaggi 1.1.8-1.1.13 per preparare i substrati di idratazione.
- Posizionare il substrato di idratazione nell'angolo destro prossimale della gabbia da cricket come mostrato nella Figura supplementare S2.
- Utilizzare un flacone di lavaggio per aggiungere 6-10 ml di acqua DI fino a quando la superficie della fibra di cocco appare bagnata e riflettente, ma la fibra di cocco non è completamente sommersa.
NOTA: La superficie deve apparire leggermente increspata, con una tensione superficiale che fa sì che l'acqua segua i contorni della fibra di cocco. - Capovolgere il coperchio di una capsula di Petri da 100 mm e posizionarlo sul lato sinistro prossimale della gabbia. Aggiungere 2-3 g di mangime standard per cricket come mostrato nella Figura supplementare S2.
- Modifica della densità della colonia
NOTA: eseguire questo passaggio a 20 giorni dopo la schiusa o quando i grilli raggiungono una massa media di 0,01 g.- Sul piano di lavoro, posizionare un grande contenitore in grado di ospitare la planimetria di tre gabbie da 29,3 L affiancate.
NOTA: Questo è il contenimento secondario e controllerà i grilli che sfuggono durante il loro trasferimento da una colonia all'altra. - Rimuovere la colonia originale dal rack di allevamento e posizionarla sul piano di lavoro.
- Sul lato destro della colonia originale, posiziona una gabbia vuota della stessa dimensione.
- Sul lato destro della gabbia vuota, posizionare una gabbia che è stata allestita secondo i passaggi 2.1.1-2.1.7.
- Verificare che i grilli non siano aggrappati alla parte inferiore del coperchio schermato della gabbia contenente i grilli. Se osservato, toccare la parte superiore della gabbia per spostarli.
- Apri il coperchio schermato della gabbia contenente i grilli.
- Con un movimento delicato e regolare, trasferisci il cartone "tetto" e tutti i grilli che aderiscono ai suoi contorni nella gabbia centrale.
- Una volta che il cartone è all'interno della gabbia centrale, agitare delicatamente il cartone contro i lati per rimuovere tutti i grilli.
- Ispezionare visivamente che tutti i grilli siano stati agitati liberamente prima di restituire il pezzo di cartone al lato prossimale della gabbia di origine per consentire ai grilli rimanenti di aderire al cartone.
- Ripetere i passaggi 2.2.8-2.2.9 con tutti i pezzi di cartone nella gabbia, lavorando in sequenza dalla parte anteriore a quella posteriore della gabbia originale fino a quando tutti i grilli sono stati trasferiti nella gabbia centrale.
- Inclinare delicatamente la gabbia centrale contenente i grilli in modo che tutti i grilli contenuti siano diretti verso l'angolo inferiore.
- Sollevare la gabbia contenente i grilli sopra la gabbia ricevente.
- Inclinare lentamente la gabbia del donatore in modo che i grilli inizino a guadagnare acquisto sui lati e possano muoversi in modo controllato fuori dalla massa nell'angolo inferiore come mostrato nella Figura supplementare S3.
- Se i grilli avanzano troppo velocemente, regola l'angolo in cui è tenuta la gabbia centrale, causando la caduta dei grilli.
- Mentre la gabbia è inclinata, utilizzare un pennello da 2,54 cm (1 pollice) per dirigere i grilli nella gabbia ricevente, contando ciascuno fino a quando il conteggio totale è uguale a 150 individui. Usa il pennello per scoraggiare coloro che avanzano troppo rapidamente per un conteggio accurato.
- Etichetta la gabbia da cricket appena rifornita con data, stock parentale e il numero di grilli contenuti.
- Eutanasia umana dei grilli in eccesso ancora sul fondo dei contenitori centrali e originali mettendo l'intero contenitore in un congelatore a -20 °C per un minimo di 30 minuti.
- Ispezionare la gabbia di origine per assicurarsi che tutti i grilli siano stati trasferiti.
- Posiziona le gabbie da cricket su rack per la coltivazione delle piante 25 cm sotto le cappe luminose contenenti luci fluorescenti a spettro completo impostate su un timer esterno di livello residenziale programmato per mantenere un fotoperiodo L / D di 12 ore. Vedere la Figura supplementare S4.
- Trasferire tutti i frass, i piatti di substrato e mangime per l'idratazione esauriti, il tovagliolo di carta, le esuvie e i grilli morti rimasti nella gabbia di origine nel contenitore autoclavabile dei rifiuti.
- A meno che i rifiuti non debbano essere immediatamente autoclavati, conservarli in un congelatore interno all'impianto a -20 °C.
- Ispeziona il pavimento, l'abbigliamento dei lavoratori, la gabbia di contenimento secondaria e la superficie di lavoro per i grilli sfuggiti.
- Sanificare il piano di lavoro e la gabbia di contenimento secondaria con una soluzione di candeggina al 10%, scartando gli asciugamani di carta nel contenitore autoclavabile dei rifiuti.
- Sul piano di lavoro, posizionare un grande contenitore in grado di ospitare la planimetria di tre gabbie da 29,3 L affiancate.
- Alimentazione e irrigazione
- Aprire il contenitore di stoccaggio del mangime ermetico e riempire una tazza di campione vuota da 100 ml con mangime per cricket. Raggiungi ogni colonia e deposita un quarto del mangime tenuto nella tazza nel coperchio della capsula di Petri che contiene il mangime.
- Per i grilli d'acqua, preparare una capsula di cocco di Petri seguendo i passaggi 1.1.9-1.1.13.
- Aumentare la velocità di alimentazione commisurata alla velocità di consumo per garantire la disponibilità di mangime ad libitum .
NOTA: la domanda di feed di cricket cambia durante lo sviluppo.
- Trasferimento di grilli in gabbie pulite
- Trasferire i grilli in gabbie pulite ogni 2 settimane. Replicare la disposizione delle gabbie dai passaggi 2.2.1-2.2.4
NOTA: Quantità significative di frass si saranno accumulate nelle concavità dei cartoni delle uova. - Trasferire i grilli in gabbie pulite, seguendo i passaggi 2.2.5-2.2.23.
- Manovrare delicatamente i cartoni in modo che la maggior parte dei frass cada nella gabbia di origine, consentendo ai grilli di aggrapparsi al cartone durante la ripetizione dei passaggi 2.2.7-2.2.10.
- Usa un pennello o un cucchiaio di plastica per incoraggiare tutti i grilli intrappolati nel frass a spostarsi dalla gabbia centrale a una gabbia pulita.
- Ispezionare la gabbia di origine per assicurarsi che tutti i grilli siano stati trasferiti.
- Trasferire tutti i frass, i piatti di substrato e mangime per l'idratazione esauriti, il tovagliolo di carta, le esuvie e i grilli morti rimasti nella gabbia di origine nel contenitore autoclavabile dei rifiuti.
- A meno che i rifiuti non debbano essere immediatamente autoclavati, conservarli in un congelatore interno all'impianto a -20 °C.
- Ispeziona il pavimento, l'abbigliamento dei lavoratori, la gabbia di contenimento secondaria e la superficie di lavoro per i grilli sfuggiti.
- Sanificare il piano di lavoro e la gabbia di contenimento secondaria con soluzione di candeggina al 10%, scartando gli asciugamani di carta nel contenitore autoclavabile dei rifiuti.
- Trasferire i grilli in gabbie pulite ogni 2 settimane. Replicare la disposizione delle gabbie dai passaggi 2.2.1-2.2.4
- Allestimento di gabbie sperimentali
NOTA: le gabbie sperimentali sono contenitori di plastica che ospitano meno grilli. La loro configurazione è identica alle gabbie da 29,3 L che contengono stock riproduttivi ma si basano su contenitori da 7,1 L riforniti di piatti più piccoli di acqua, mangime e contengono una superficie ridotta del cartone delle uova.- Posizionare sei pezzi di cartone da 10,1 cm x 15,4 cm (4 pollici x 6 pollici) nell'estremità distale di ciascuna gabbia sperimentale con gli assi lunghi dei cartoni che coprono la larghezza della dimensione stretta della gabbia e gli assi corti dei cartoni orientati verso il coperchio e il pavimento.
- Imballare 10 g della miscela di cocco idratata in una capsula di Petri.
- Utilizzare una bottiglia di lavaggio contenente acqua DI per aggiungere circa 15 ml di acqua DI o fino a quando non si forma un menisco sulla superficie della fibra di cocco.
- Capovolgere il coperchio di una capsula di Petri da 60 mm x 15 mm per contenere l'alimentazione.
NOTA: La velocità di alimentazione può variare per tutta la durata della prova. Per la randomizzazione sperimentale del cricket in gabbia e la procedura di stoccaggio, vedere La fase 1.4 dei materiali supplementari .
- Terminare gli insetti
- Quando i grilli non sono più necessari per l'allevamento o l'uso sperimentale, seguire il passaggio 2.2.17.
- Quando i grilli sono morti, rimuovi la gabbia dal congelatore. Rimuovere il coperchio e trasferire tutti i materiali contenuti in un contenitore per rifiuti autoclavabile. Trasferire i rifiuti nel congelatore fino all'autoclave.
- Immergere la gabbia vuota in una soluzione di candeggina al 10% e lasciarla riposare per un minimo di 5 minuti.
- Risciacquare tre volte la gabbia vuota con acqua fredda del rubinetto per rimuovere i residui di candeggina, con particolare attenzione ai canali sul fondo del contenitore.
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Representative Results
I dati che dimostrano il successo dell'allevamento di cricket dalla schiusa ai 65 giorni di età sono stati raccolti durante una prova di alimentazione di settembre 2021. I grilli sono stati coltivati da uova seguendo i passaggi 1.1.1-2.6.1 di questi protocolli e sei gabbie replicate sono state rifornite con 24 grilli casuali di 22 giorni (terza stella) dopo il passaggio 2.7 sopra. I grilli venivano poi allevati in condizioni ambientali; tuttavia, a causa di un malfunzionamento dell'unità di trattamento dell'aria dell'impianto, la temperatura ambiente media era di 25 ± 1 °C al 20% di umidità relativa anziché i 27 °C suggeriti. La massa del cricket è stata misurata due volte alla settimana tra 22 e 65 giorni dopo la schiusa. I risultati di questo esperimento sono descritti di seguito e sono presentati come mezzi più o meno deviazione standard.
I dati mostrati nella Figura 1 e nella Figura 2 rappresentano le sei gabbie replicate a cui è stato somministrato il mangime standard descritto in questo protocollo. I grilli erano riforniti da una popolazione con massa media di 21 ± 9 mg. Alla fine dell'esperimento, la massa media di tutti i grilli giovani e adulti combinati era di 0,724 g ± 0,190 g (Figura 1). Poiché G. bimaculatus è sessualmente dimorfico, riportiamo anche la massa adulta per sesso. Il rapporto tra i sessi al raccolto era del 51% femminile. Dei 30 maschi adulti presenti a 65 giorni di età al termine dell'esperimento, la massa media era di 0,721 g ± 0,123 g. Delle 58 femmine adulte presenti a 65 giorni di età, la massa media era di 0,841 g ± 0,112 g (Figura 2). La sopravvivenza tra lo stoccaggio e il raccolto è stata dell'89% ed è stata misurata settimanalmente dal conteggio totale di tutti i singoli grilli in tutte le gabbie. Al giorno 65, il 68,2% di tutti i grilli aveva raggiunto l'instar adulto (Figura 2).
Figura 1: Massa media dei singoli grilli 22-65 giorni dopo la schiusa. Le barre rappresentano quartili di massa media del cricket per gabbia, n = 6 gabbie. Tutti i grilli sono stati contati e pesati 2 volte a settimana, tranne in 1 settimana dell'esperimento, in cui sono stati pesati solo una volta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Massa media di cricket adulto per sesso alla fine dell'esperimento. Grilli maschi n = 30, grilli femminili n = 58. Le barre rappresentano quantili di massa media; 'x' rappresenta la massa media del cricket per sesso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Materiali supplementari: (1) Fibra di cocco e sicurezza respiratoria, (2) Rimozione del materiale di cocco di cocco, (3) Calibrazione della consegna della nebbia, (4) Costruzione del coperchio schermato, (5) Stoccaggio sperimentale della gabbia, (6) Randomizzazione dei grilli alle gabbie, (7) Metodi utilizzati per l'analisi dei mangimi. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S1: Vista laterale della gabbia da cricket contenente la corretta disposizione di cartone cartone refugia, mangime e fibra di cocco. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Vista dall'alto delle piastre di Petri contenenti fibra di cocco e mangime per grillo posizionate nella parte inferiore della gabbia. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: I grilli vengono trasferiti dal fondo di una gabbia in una nuova gabbia inclinandosi lentamente come descritto nei passaggi 2.2.11-2.2.13. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S4: Gabbie contenenti grilli posizionati su rastrelliere di allevamento illuminate. Fare clic qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare S1: (1) Analisi nutrizionali dei mangimi commerciali, (2) Elenco del produttore degli ingredienti dei mangimi. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
La semplicità di questo approccio all'allevamento di cricket può avvantaggiare una serie di aree di ricerca e rappresenta un modello generico per un allevamento di cricket di successo, facilmente adattabile a una varietà di esigenze sperimentali. Rispetto a molti altri studi di G. bimaculatus, la dimensione dell'adulto del corpo individuale è più piccola e la maturazione è più lenta14, che attribuiamo alla temperatura di allevamento sub-ottimale impostaci dalle circostanze. I metodi sopra descritti sono stati utilizzati e perfezionati nel corso di 2 anni. Colture robuste sono state mantenute senza evidenza di problemi talvolta osservati nell'allevamento commerciale di cricket, compresa la mortalità diffusa da agenti patogeni con segni clinici classici (ad esempio, liquefazione interna dovuta a densovirus in Acheta domesticus) o eccessivo cannibalismo15. È probabile che la mancanza di introduzioni di cricket dopo l'istituzione della colonia abbia notevolmente ridotto la probabilità di carico di malattie.
Prevenire l'affollamento è importante per garantire la salute del cricket. I selvaggi G. bimaculatus sono solitari e i maschi difendono i loro territori attraverso esibizioni aggressive e combattimenti16. Una cura in cattività di successo richiede di mantenere la densità della colonia entro un intervallo appropriato per ridurre il comportamento antagonistico e le risposte allo stress complessive13. Ciò si ottiene fornendo ai grilli un abbondante rifugio all'interno della gabbia e assottigliando gli stock riproduttivi di grilli a 150 individui per gabbia da 29,3 L a 20 giorni dopo la schiusa quando raggiungono una dimensione media di 0,01 g, durante il terzo o il quarto instar giovanile. Questa densità di allevamento è identica a quella utilizzata negli studi di ottimizzazione del mangime G. bimaculatus di Sorjonen et al.14. Una considerazione di particolare rilevanza durante il trasferimento dei grilli da un contenitore all'altro è l'alto grado di rischio di fuga. Il contenimento secondario, i movimenti controllati, la preparazione per arrestare i fuggitivi e la vigilanza sono strumenti cruciali per prevenire la fuga del cricket durante questo processo. Tali misure riflettono la designazione del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti di Gryllus spp. grilli come potenziali parassiti delle colture, che richiedono permessi federali e statali per l'allevamento negli Stati Uniti17.
I controlli ambientali e la qualità dell'alimentazione durante le fasi iniziali delle uova e dei ninfali sono importanti per la salute di tutte le colture di cricket in cattività, incluso G. bimaculatus. Per deporre uova vitali, la femmina G. bimaculatus richiede un substrato umido in cui ovopositare18. La fibra di cocco è ampiamente utilizzata nell'industria della produzione commerciale di cricket come mezzo per l'ovodeposizione. Questi metodi si basano sulla fibra di cocco inumidita con acqua DI come substrato sia per l'ovodeposizione che per l'idratazione dei grilli durante il loro ciclo di vita. Allo stesso modo, l'uso di asciugamani di carta umidi nelle gabbie giovanili per assorbire le goccioline d'acqua in eccesso e fornire gradienti di umidità all'interno dell'ambiente natale si è dimostrato molto efficace nel ridurre il numero di grilli di <1 settimana che soccombono alla disidratazione o all'annegamento, come indicato dalla presenza o dall'assenza di grilli giovani deceduti nei fondi delle gabbie. La nutrizione giovanile è nota per svolgere un ruolo fuori misura nel prevedere prestazioni di crescita di successo nei grilli. Garantire che il mangime fresco a nutrizione completa sia di una dimensione delle particelle adatta per < 0,01 g di grilli porterà a una maggiore sopravvivenza, poiché i grilli più giovani saranno più suscettibili agli impatti della variabilità nella qualità dei mangimi19.
Il mangime per cricket disponibile in commercio utilizzato in questo studio è stato selezionato a causa del suo uso diffuso nell'industria nordamericana dell'allevamento di cricket. In primo luogo, dalle comunicazioni personali con tre coltivatori di cricket commerciali, due nell'Upper Midwest degli Stati Uniti e uno negli Stati Uniti meridionali è chiaro che questo mangime (Mazuri) è ampiamente applicato nell'industria degli insetti commestibili fino ad oggi. Gli agricoltori di cricket lo trovano suscettibile di prestazioni di crescita desiderabili, fecondità, sviluppo e metriche di aumento di peso. In secondo luogo, per i tecnici incaricati di somministrare mangimi a un gran numero di grilli in ambienti di laboratorio, è conveniente utilizzare un mangime premiscelato in polvere per tutta la durata della vita degli insetti. In terzo luogo, la domanda di proteine è nota per essere un fattore importante nello sviluppo del cricket e sebbene molte altre esigenze nutrizionali specifiche per G. bimaculatus non siano completamente comprese, questa miscela preformulata contiene una percentuale di proteine grezze, che rientra nell'intervallo ottimale riportato del 22% -30%14,20.
Lo spazio negli incubatori è spesso limitato. Le fattorie di cricket in genere iniziano i loro grilli early instar in incubatori e trasferiscono stock più maturi in ambienti all'aperto, dove i sistemi di trattamento dell'aria a livello di struttura regolano la temperatura e l'umidità. Per questi motivi, questi metodi sono progettati per emulare tali accordi su scala minore. Dopo 20 giorni all'interno dell'incubatore, la densità viene ridotta e i grilli vengono trasferiti a trattamenti sperimentali o in condizioni ambientali per l'uso come bestiame da riproduzione. Quando i sistemi di trattamento dell'aria funzionano correttamente, la temperatura dell'impianto di allevamento deve essere stabile a 27 ± 1 °C con umidità relativa compresa tra il 20% e il 25%. Ai grilli è consentito l'accesso ad libitum all'acqua e ai mangimi. Il mangime a cui si fa riferimento in questi metodi è Mazuri Cricket Feed ampiamente utilizzato dagli agricoltori di cricket in Nord America. Per un'analisi nutrizionale completa, vedere tabella supplementareS1.
Secondo i metodi di Donoughe e Extavour (2016), il cotone idrofilo può essere utilizzato al posto della fibra di cocco come mezzo di ovodeposizione o come materiale di rivestimento in cima alla fibra di cocco per evitare che particelle di frass o mangime contaminino la superficie del mezzo di ovodeposizione18. Raccomandano di posizionare un sottile strato di cotone idrofilo sul substrato durante il periodo di ovodeposizione e successivamente rimosso una volta completata l'ovodeposizione, insieme al frass e ai detriti accumulati. Sebbene non siano disponibili dati che misurino l'impatto della contaminazione del substrato sulla vitalità delle uova o sullo sviluppo del cricket, i protocolli qui delineati producono risultati soddisfacenti sia nella produzione di grilli giovanili che nella crescita. Ciò può essere attribuibile alle presunte qualità antimicrobiche della fibra di cocco ed è motivo di ricerca futura nell'arena della produzione di insetti commestibili21.
A causa di un malfunzionamento dell'unità che regola la temperatura dell'impianto di allevamento di cricket in cui sono stati sviluppati questi metodi, la prova per la quale stiamo riportando i dati è stata condotta a 25 ° C al 20% di umidità relativa, che è 2 ° più fredda di quanto dettano questi protocolli. Inoltre, questi obiettivi di ricerca strettamente basati sui mangimi si traducono in una limitata disponibilità di dati su alcune metriche di interesse come la fecondità, le risposte endocrine, il carico di agenti patogeni e l'espressione genica. Una volta che i grilli da riproduzione producevano costantemente abbondanti uova di cricket vitali e la mortalità giovanile era trascurabile, gli sforzi si concentravano principalmente sulla sperimentazione direttamente rilevante per le domande di ricerca. Pertanto, questo rapporto offre solo resoconti aneddotici degli impatti a lungo termine sulle prestazioni di crescita di questi metodi attraverso >10 generazioni. Infine, l'uso di materiali di origine vegetale come la fibra di cocco e il cartone nelle gabbie sperimentali porta probabilmente all'ingestione accidentale da parte dei grilli. Ciò è accettabile all'interno della progettazione di questi studi, ma può compromettere la validità dei progetti di studio in cui i risultati si basano su misurazioni precise della biomassa totale ingerita.
Il protocollo qui descritto è destinato ad essere sia di base che completo, con passaggi chiari e facili da seguire per allevare in modo fattibile grilli in un ambiente di laboratorio alimentato con un mangime standard disponibile in commercio. L'utilizzo di una tale procedura standardizzata con pulizia ottimale, densità di allevamento e controlli ambientali consente il mantenimento di colonie di cricket uniformi e sane a lungo termine; inoltre, contribuirà alla crescente ricerca su G. bimaculatus come insetto commestibile coltivabile con implicazioni per la salute umana. Può anche essere utile per studi sulla fisiologia degli insetti, l'ottimizzazione della crescita e la genetica.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Il finanziamento per questo progetto è stato reso possibile attraverso sovvenzioni interne dell'Università del Wisconsin-Madison. Un sincero ringraziamento a Kevin Bachhuber di Bachhuber Consulting Inc. per l'accesso alla sua guida inedita per l'allevamento commerciale di cricket e a Michael Bartlett Smith per la sua assistenza nel perfezionamento e nella risoluzione dei problemi di questi metodi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 31-qt (29.3 L) Snap-lid tote bin with lid | HOMZ | 3430CLBL | Used to house breeding stock |
| 3-tier/12-tray Grow Light Stand | Fischer Scientific | NC1938548 | |
| 50-gal (189.27L) tote bin with lid | Sterilite | #14796603 | Used as secondary containment when handling crickets |
| 50 mL polypropylene graduated cylinder | Fischer Scientific | S95171 | |
| 7.5-qt (7.1 L) snap-lid tote bin with lid | HOMZ | 3410CLBL | Used to house exprimental stock |
| Accuris 500 g x 0.01 g Balance | Manufactured by Accuris, a subsidieary of Benchmark Scientific | W3300-500 | Purchased from Dot Scientific through University of Wisconsin system purchasing service "ShopUW+" |
| Ace Premier 1 Inch Flat Chip Brush | Ace Hardware | #1803261 | |
| Bel-Art SP Scienceware deionized water wash bottle | Fischer Scientific | 03-421-160 | |
| Bright aluminum window screen | Phifer | UNSPSC# 11162108 | Mesh size 18 x 16" |
| Clear Disposable Plastic Portion Cups 5.5 oz w/ lids | Wal-Mart | N/A | |
| Deionized water | |||
| Diablo 4-4/8" x 13 TPI Ultra Fine Finish Bi-Metal Jigsaw Blade | Home Depot | #313114935 | |
| Egg Filler Flats-Paper, 12 x 12" | Uline | S-5189 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 100 x 15mm | Fischer Scientific | FB0875714 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 60 x 15mm | Fischer Scientific | FB0875713A | |
| Georgia-Pacific Envision Brown Paper Towels | Home Depot | #205675843 | |
| Infinity Tough Guy high performance hot-melt glue sticks | Infinity Bond | Infinity IM-Tough-Guy-12 | |
| Mazuri Cricket Diet | Land O' Lakes International | SKU# 3002219-105 | |
| Stanley TimeIt Twin 2-outlet Grounded Mechanical 24 Hour Timer | Wal-Mart | N/A | |
| Vermont Organics Reclamation Soil 11 lb Coir Block | Home Depot | #300679904 |
References
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