Summary
Este documento describe métodos básicos para estandarizar factores importantes como la densidad, la disponibilidad de alimento, la fuente de hidratación y los controles ambientales para la cría a largo plazo de cultivos de laboratorio del grillo comestible, Gryllus bimaculatus.
Abstract
Gryllus bimaculatus (De Geer) es un grillo de cuerpo grande distribuido por África y el sur de Eurasia, donde a menudo se cosecha en la naturaleza como alimento humano. Fuera de su área de distribución nativa, el cultivo de G. bimaculatus es factible debido a su plasticidad dietética, ciclo reproductivo rápido, falta de requisitos de diapausa, tolerancia a la cría de alta densidad y robustez contra patógenos. Por lo tanto, G. bimaculatus puede ser un modelo versátil para estudios de fisiología, comportamiento, embriología o genética de insectos.
Los parámetros culturales, como la densidad de población, los refugios dentro de la jaula, el fotoperíodo, la temperatura, la humedad relativa y la dieta, afectan el crecimiento, el comportamiento y la expresión génica del grillo y deben estandarizarse. En la creciente literatura sobre insectos agrícolas para el consumo humano, estos grillos se emplean con frecuencia para evaluar mezclas de alimentos candidatas derivadas de residuos de cultivos, subproductos de procesamiento de alimentos y otros flujos de desechos de bajo costo.
Para apoyar los experimentos en curso que evalúan el rendimiento del crecimiento de G. bimaculatus y la calidad nutricional en respuesta a sustratos variables de alimentación, se desarrolló un conjunto completo de protocolos estándar para la cría, el mantenimiento, el manejo, la medición y la eutanasia en el laboratorio, que se presenta aquí. Un alimento para grillos estándar de la industria ha demostrado ser nutricionalmente adecuado y funcionalmente apropiado para el mantenimiento a largo plazo de las poblaciones reproductoras de grillos, así como para su uso como alimento de control experimental. La cría de estos grillos a una densidad de 0.005 grillos / cm3 en jaulas de polietileno de 29.3 L con pantalla a una temperatura promedio de 27 ° C en un fotoperíodo de 12 claros (L) / 12 oscuros (D), con fibra de coco humedecida que sirve como fuente de hidratación y medio de oviposición ha sostenido con éxito grillos sanos durante un período de 2 años. Siguiendo estos métodos, los grillos en un experimento controlado produjeron una masa promedio de 0.724 g 0.190 g en la cosecha, con un 89% de supervivencia y un 68.2% de maduración sexual entre la siembra (22 días) y la cosecha (65 días).
Introduction
Como lo tipifica el insecto icónico, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, el uso de insectos como organismos modelo de laboratorio proporciona claras ventajas para los estudios en genética, toxicología y fisiología1. El pequeño tamaño de los insectos reduce el espacio necesario para los cultivos y la cantidad de alimento y materiales consumibles necesarios. Muchos insectos se reproducen rápidamente, lo que los hace especialmente adecuados para la creación de líneas genéticas especializadas y estudios que requieren la evaluación de múltiples generaciones sucesivas.
Muchos estudios se centran en insectos holometábolos como Drosophila, que exhiben metamorfosis y pupación completas. Sin embargo, hay otros modelos disponibles, incluyendo Gryllus bimaculatus (De Geer), el grillo de campo de dos manchas. G. bimaculatus es un insecto paurometaboloso que sufre entre 7 y 11 instars ninfales antes de alcanzar la madurez sexual2. Este grillo muestra una amplia gama de comportamientos relacionados con la selección sexual, incluida la estridulación, las exhibiciones territoriales y la protección de la pareja3. Los grillos inmaduros son diferentes a las larvas de las especies de insectos holometábolos en que, al igual que muchos juveniles paurometabolosos, son capaces de regenerar las extremidades perdidas y dañadas durante la ecdisis4. Además, el genoma completamente secuenciado de G. bimaculatus se publicó en 20215. Estas características hacen que estos grillos sean atractivos como objetivo para la investigación básica.
Los grillos de campo de dos manchas se crían ampliamente para la alimentación humana y la alimentación animal. La escala de estas operaciones es a menudo mucho mayor que para la investigación de laboratorio 6,7. A pesar de la diferencia de escala, los desafíos que enfrentan los investigadores se superponen en gran medida con los que enfrentan los agricultores comerciales de cricket. Estas consideraciones convergen en el contexto de la investigación basada en el laboratorio con el objetivo de mejorar la producción de insectos comestibles. A medida que la industria de insectos comestibles continúa evolucionando y creciendo, la optimización de los insumos de alimento y una miríada de otros aspectos de la producción es un objetivo principal8. Los estudios de laboratorio que demuestran mejoras medidas en la eficiencia de la cría, la supervivencia o el tiempo de generación en estos grillos tienen el potencial de ayudar a aumentar la rentabilidad de las operaciones de cultivo de grillos a largo plazo.
Los protocolos estandarizados de cría permiten una comparación más estrecha entre los estudios que investigan la optimización de la cría. Hasta la fecha, se han publicado pocos protocolos en profundidad para la cría de G. bimaculatus en el laboratorio. Un protocolo ideal reflejaría las condiciones encontradas en las operaciones de cultivo de grillos del mundo real, manteniendo las condiciones estrictamente controladas necesarias para medir con precisión los cambios en el rendimiento del crecimiento derivados de los tratamientos experimentales y destacando las estrategias de mitigación de riesgos. Los métodos descritos en este documento se desarrollaron en base a protocolos, técnicas y aparatos publicados utilizados para criar una variedad de especies de grillos en una amplia gama de escalas de producción comercial y de laboratorio 2,9,10,11,12. Estos métodos también son informados por varias fuentes no revisadas por pares, incluidos boletines técnicos no publicados y comunicación personal con agricultores comerciales de cricket en América del Norte. Este protocolo fue desarrollado con la intención de facilitar el establecimiento de cultivos de laboratorio de G. bimaculatus específicamente para su uso en ensayos relacionados con la agricultura de insectos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación del sustrato de oviposición
NOTA: La fibra de coco es un sustrato de oviposición ideal para G. bimaculatus. Para obtener métodos detallados sobre cómo separar la fibra de coco del ladrillo de fibra de coco comprimido y una nota sobre la seguridad respiratoria, consulte materiales suplementarios paso 1.1.
- Lávese las manos con agua y jabón.
- Tara un recipiente limpio en una balanza y pesar una masa de fibra de coco seca aproximadamente del tamaño de un puño humano.
- Coloque la fibra de coco en un recipiente limpio y sellable, que pueda acomodar la expansión hasta 6 veces el volumen original.
- Con las manos limpias, rompa suavemente los grupos de fibra de coco de la pieza extraída del bloque más grande.
- Usando un cilindro graduado de 50 ml, mida el volumen correcto de agua desionizada (DI) para lograr una relación de 5: 1 en masa de cinco partes de agua por una parte de fibra seca.
- Agregue el agua DI medida lentamente, hidratando uniformemente todas las partículas de fibra de coco. Macerar manualmente los grumos para garantizar una hidratación uniforme.
- Vuelva a tarar el recipiente en el que se pesó previamente la fibra de coco.
- Pesar 75 g de fibra de coco mojada.
- Transfiera 75 g de la fibra de coco mojada a una placa de Petri de 100 mm x 15 mm con una cuchara de plástico limpia para asegurarse de que la fibra de coco se extienda uniformemente por el fondo de la placa y que no haya grumos.
- Etiquete el lado de la placa de Petri con cinta de laboratorio con una etiqueta que indique la colonia natal y la fecha del evento de recolección de huevos.
- Mida 45 ml adicionales de agua DI en un cilindro graduado.
- Agregue agua uniformemente sobre la superficie de la fibra de coco envasada en la placa de Petri para garantizar una hidratación uniforme. Asegúrese de que la fibra de coco esté saturada hasta el punto de que el agua se acumule aproximadamente 1/4 de la manera en que sube por los lados del recipiente.
- Una vez que la placa de Petri haya sido empacada, selle la fibra de coco mojada restante en un recipiente hermético para su almacenamiento a -20 ° C.
NOTA: Siguiendo los métodos prescritos por este artículo, los individuos de G. bimaculatus alcanzarán la madurez sexual después de un promedio de 58 días después de la oviposición. - Recolección de huevos
- Coloque el sustrato de oviposición hidratada en jaulas que contengan las existencias parentales deseadas de grillos lo más lejos posible del alimento debido a la posibilidad de que los grillos transfieran mecánicamente gránulos de alimento al sustrato de oviposición.
- Documente la fecha y la hora.
NOTA: La densidad de trabajo estandarizada para las colonias de grillos reproductivos criados siguiendo estos métodos es n = 150 individuos adultos. A esa densidad, una ventana de oviposición de 24 h producirá entre 800 y 1.500 huevos dependiendo de la edad de la colonia, el esfuerzo previo de oviposición y la proporción de sexos de la jaula de los padres. - Coloque un pequeño recipiente de basura esterilizable en autoclave en la superficie de trabajo para tener en cuenta el riesgo de contención que representa la manipulación y limpieza de sustratos de oviposición ricos en huevos.
- Coloque una jaula de plástico limpia y vacía de 29.3 L en el banco junto al recipiente de basura para que sirva como jaula receptora para el sustrato de oviposición rico en huevos.
- Coloque la jaula de 29.3 L que contiene las existencias de grillo padre y el sustrato de oviposición en el lado opuesto del recipiente de basura de la jaula vacía.
- Después de 24 h, retire el sustrato de oviposición de la jaula de grillo madre y ubíquelo sobre el recipiente de desechos en autoclave.
- Inspeccione la parte superior del sustrato de oviposición en busca de partículas de frass o alimento que los grillos puedan haber pateado sobre la superficie de la fibra de coco.
NOTA: Cualquier sustancia, que no sea masa de huevo o fibra de coco, puede causar que se forme moho en el sustrato durante la incubación. - Retire los contaminantes de la fibra de coco en el recipiente de desechos con una cuchara de cuchara limpia o de plástico.
- Coloque la cuchara de plástico en el recipiente de residuos.
- Coloque el sustrato de oviposición limpia en la jaula limpia de 29.3L.
- Coloque la jaula en una incubadora a 27 °C al 60% de humedad relativa en un fotoperíodo de 12 h D/12 h L.
- Devuelva la jaula que contiene el ganado reproductor a la ubicación original y limpie todos los elementos de la superficie de trabajo.
- Coloque el recipiente de desechos en un congelador de la instalación dedicado al almacenamiento de artículos potencialmente contaminados con huevos de grillo.
- Desinfecte la superficie de trabajo con una solución de lejía al 10% y déjela reposar durante 60 s.
- Seque la superficie de trabajo con una toalla de papel limpia. Abra el congelador y deseche la toalla de papel en el recipiente de residuos.
- Nebulización y monitoreo diario de sustratos de huevos
NOTA: Para conocer los métodos utilizados para calibrar el volumen de niebla suministrado por una botella de spray, consulte materiales suplementarios paso 1.2.- Coloque una botella de pulverización sobre el sustrato de oviposición de modo que el agua expresada se distribuya uniformemente sobre la superficie del sustrato.
- Realice el número de accionamientos de la bomba calculado en el paso 1.2 de Materiales suplementarios para cada sustrato de oviposición diariamente durante 11 días consecutivos.
- Revise cada sustrato de oviposición diariamente, monitoreando el crecimiento de moho filamentoso en la superficie de la fibra de coco.
- Si se observa crecimiento de hongos, use una cuchara o cucharada limpia para eliminar las manchas de moho superficial.
- Deseche la herramienta y la fibra de coco extraída en el contenedor de residuos en autoclave almacenado en el congelador de la instalación.
NOTA: No está claro si el moho afecta negativamente el desarrollo del cricket. - En el día 11 después de la oviposición, comience a observar de cerca el sustrato para los grillos juveniles.
NOTA: A 27 °C, los huevos de G. bimaculatus requieren de 11 a 13 días para eclosionar.
- Instalación de jaulas natales
- Seleccione dos planos de cartón de huevos comerciales de 30,8 cm x 30,8 cm (12 pulgadas x 12 pulgadas) no utilizados. Con un cuchillo utilitario o tijeras fuertes, córtelas en seis tiras separadas de 10,1 cm (4") de ancho de igual tamaño. Cepille los bordes cortados con las manos para eliminar las partículas colgantes de cartón.
- Coloque las seis piezas individuales de cartón de 10,1 cm x 30,8 cm (4 pulgadas x 12 pulgadas) verticalmente en la parte inferior de la jaula con el eje más largo del cartón que abarca el eje horizontal más estrecho de una jaula de 29,3 litros. Coloque una séptima pieza de cartón plana en la parte superior de las seis piezas verticales.
- Seleccione tres piezas de toalla de papel marrón rugoso de aproximadamente 25 cm x 25 cm. Dobla cada uno por la mitad. Coloque dos de tal manera que cubran la parte superior del lado proximal de la estructura del cartón. Coloque uno sobre la pila de cartón en el lado distal.
- En el día 11 después de la oviposición, mueva el sustrato de la oviposición en la esquina derecha proximal de la jaula.
- Cuidado de las estrellas tempranas
NOTA: En el día 14 después de la oviposición, la mayoría de los huevos viables habrán eclosionado y las ninfas de grillo en etapa temprana requerirán alimento y agua. Los grillos jóvenes son incapaces de romper la tensión superficial de las gotas de agua y pueden ahogarse si el agua se acumula en su entorno. Sin embargo, también son sensibles a la desecación. Proporcionar una humedad relativa constante de alrededor del 60% durante esta etapa de desarrollo es importante para garantizar la supervivencia.- Cuando se observe una escotilla, rocíe las toallas de papel colocadas sobre la parte superior de los cartones en el paso 1.4.3 hasta que se humedezcan pero no arrojen agua activamente.
- Limpie bien ambos lados de una tapa de placa de Petri de 100 mm con etanol al 70% y deje que se seque. Úselo como el receptáculo en el que se entregará la alimentación de grillo.
NOTA: Los grillos de primera en estrella requieren partículas de alimentación más pequeñas que los grillos en las etapas posteriores de desarrollo. Este alimento más fino debe administrarse a los grillos durante los primeros 20 días después de la emergencia. - Cuchara 50 g de la alimentación en una licuadora de una sola porción de 60 vatios y muele a 10.000 rpm durante 1 min.
- Mida 1 g del alimento y agítelo sobre la tapa de la placa de Petri en la jaula. Usando el extremo limpio de una cuchara o cucharada, extienda el alimento lo más uniformemente posible sobre el fondo del plato.
- Reemplace el alimento cada 2 días. Use el extremo de la cuchara para cepillar los grillos del plato de alimentación antes de retirarlo. Deseche el alimento viejo en el contenedor de residuos en autoclave.
- Monitoree el crecimiento de moho en la alimentación. Si el alimento comienza a aparecer blanco o verdoso, deseche la placa de Petri y alimente inmediatamente.
- A los 14 días después de la oviposición, use un pincel de 2,54 cm (1 pulgada) para eliminar los grillos que se aferran al sustrato de la fibra de coco natal cepillando todos los grillos de la superficie de la fibra de coco y los lados de la placa de Petri en la jaula.
- Coloque el sustrato de oviposición eliminado en el recipiente de residuos en autoclave y guárdelo en el congelador hasta el autoclave.
- Reemplace el sustrato natal con un plato de fibra de coco fresco para la hidratación preparado siguiendo los pasos 1.1.5-1.1.9.
- Use una botella de lavado de agua DI para agregar agua hasta que la superficie de la fibra de coco brille pero no se esté acumulando.
NOTA: La densidad de cricket tiene un fuerte impacto en el rendimiento del crecimiento en G. bimaculatus13. Mantener el ganado reproductor en una densidad excesiva corre el riesgo de introducir efectos epigenéticos inducidos por apiñamiento no deseados en experimentos en los que se utiliza su progenie9. Los grillos deben ser "adelgazados" a partir de las altas densidades que emergen de los sustratos de oviposición y distribuidos en densidades que se adhieran al estándar de 0.005 grillos / cm3 de espacio.
2. Cuidado de instars de tres a adultos
- Instalación de jaulas
NOTA: Para obtener detalles sobre la técnica para construir la tapa apantallada, consulte materiales suplementarios paso 1.3.1.- Repita el paso 1.4.1.
- Instale cinco piezas de cartón de huevo cortadas en el extremo distal de la jaula para que las concavidades en forma de huevo estén orientadas hacia afuera. Asegúrese de que los extremos cortos estén a los lados de la jaula, el lado largo se asiente plano contra la parte inferior y haya aproximadamente 3 cm de espacio entre cada pieza de cartón.
- Coloque la última pieza de cartón cortada encima de las piezas de cartón verticales, como el techo de una casa, como se muestra en la Figura suplementaria S1.
- Siga los pasos 1.1.8-1.1.13 para preparar los sustratos de hidratación.
- Coloque el sustrato de hidratación en la esquina proximal derecha de la jaula de cricket como se muestra en la Figura suplementaria S2.
- Use una botella de lavado para agregar 6-10 ml de agua DI hasta que la superficie de la fibra de coco parezca húmeda y reflectante, pero la fibra de coco no esté completamente sumergida.
NOTA: La superficie debe aparecer ligeramente con hoyuelos, con tensión superficial que hace que el agua siga los contornos de la fibra de coco. - Invierta la tapa de una placa de Petri de 100 mm y colóquela en el lado izquierdo proximal de la jaula. Agregue 2-3 g de alimento estándar para grillos como se muestra en la Figura Suplementaria S2.
- Modificación de la densidad de colonias
NOTA: Realice este paso a los 20 días después de la eclosión o cuando los grillos alcancen una masa promedio de 0.01 g.- En la superficie de trabajo, coloque un recipiente grande que pueda acomodar el plano de planta de tres jaulas de 29.3 L de pie una al lado de la otra.
NOTA: Esta es una contención secundaria y controlará a los grillos que escapan durante su transferencia de una colonia a otra. - Retire la colonia original del bastidor de cría y colóquela en la superficie de trabajo.
- Al lado derecho de la colonia original, coloque una jaula vacía del mismo tamaño.
- En el lado derecho de la jaula vacía, coloque una jaula que se haya configurado de acuerdo con los pasos 2.1.1-2.1.7.
- Verifique que los grillos no se adhieran a la parte inferior de la tapa apantallada de la jaula que contiene los grillos. Si se observa, toque la parte superior de la jaula para desalojarlos.
- Abra la tapa apantallada de la jaula que contiene los grillos.
- En un movimiento suave y suave, transfiera el cartón del "techo" y todos los grillos que se adhieren a sus contornos a la jaula central.
- Una vez que el cartón esté dentro de la jaula central, agita suavemente el cartón contra los lados para desalojar todos los grillos.
- Inspeccione visualmente que todos los grillos hayan sido sacudidos antes de devolver la pieza de cartón al lado proximal de la jaula de origen para permitir que los grillos restantes se adhieran al cartón.
- Repita los pasos 2.2.8-2.2.9 con todas las piezas de cartón en la jaula, trabajando secuencialmente desde la parte delantera hasta la parte posterior de la jaula original hasta que todos los grillos hayan sido transferidos a la jaula central.
- Incline suavemente la jaula central que contiene los grillos para que todos los grillos contenidos se dirijan hacia la esquina inferior.
- Levante la jaula que contiene los grillos sobre la jaula receptora.
- Incline lentamente la jaula donante para que los grillos comiencen a ganar compra en los lados y puedan moverse de manera controlada fuera de la masa en la esquina inferior como se muestra en la Figura Suplementaria S3.
- Si los grillos avanzan demasiado rápido, ajuste el ángulo en el que se sostiene la jaula central, haciendo que los grillos retrocedan.
- Mientras la jaula está inclinada, use un pincel de 2,54 cm (1 pulgada) para dirigir los grillos a la jaula receptora, contando cada uno hasta que el recuento total sea igual a 150 individuos. Use el pincel para disuadir a aquellos que avanzan demasiado rápido para un conteo preciso.
- Etiquete la jaula de grillos recién surtida con la fecha, el stock parental y el número de grillos contenidos.
- Sacrificar humanamente el exceso de grillos que aún se encuentran en el fondo del medio y en los recipientes originales colocando todo el recipiente en un congelador a -20 ° C durante un mínimo de 30 minutos.
- Inspeccione la jaula de origen para asegurarse de que todos los grillos hayan sido transferidos.
- Coloque las jaulas de cricket en bastidores de cultivo de plantas 25 cm por debajo de las campanas de luz que contienen luces fluorescentes de espectro completo configuradas en un temporizador al aire libre de grado residencial programado para mantener un fotoperíodo L / D de 12 h. Véase la figura suplementaria S4.
- Transfiera todos los frass, platos de sustrato y alimento de hidratación gastados, toalla de papel, exuviae y grillos muertos que queden en la jaula de origen al recipiente de desechos en autoclave.
- A menos que los residuos vayan a ser esterilizados en autoclave inmediatamente, guárdelos en un congelador de la instalación a -20 °C.
- Inspeccione el piso, la ropa de los trabajadores, la jaula de contención secundaria y la superficie de trabajo en busca de grillos escapados.
- Desinfecte la superficie de trabajo y la jaula de contención secundaria con una solución de lejía al 10%, desechando las toallas de papel en el recipiente de residuos esterilizable en autoclave.
- En la superficie de trabajo, coloque un recipiente grande que pueda acomodar el plano de planta de tres jaulas de 29.3 L de pie una al lado de la otra.
- Alimentación y riego
- Abra el recipiente hermético de almacenamiento de alimento y llene una taza de muestra vacía de 100 ml con alimento para grillos. Alcance cada colonia y deposite una cuarta parte del alimento que se encuentra en la taza en la tapa de la placa de Petri que contiene el alimento.
- Para regar los grillos, prepare una placa de Petri de fibra de coco siguiendo los pasos 1.1.9-1.1.13.
- Aumentar la tasa de alimentación proporcional a la tasa de consumo para garantizar la disponibilidad de alimento ad libitum .
NOTA: La demanda de alimentación de grillos cambia a lo largo del desarrollo.
- Transferencia de grillos a jaulas limpias
- Transfiera los grillos a jaulas limpias cada 2 semanas. Replicar la disposición de las jaulas de los pasos 2.2.1-2.2.4
NOTA: Se habrán acumulado cantidades significativas de frass en las concavidades de los cartones de huevos. - Transfiera los grillos a jaulas limpias, siguiendo los pasos 2.2.5-2.2.23.
- Maniobra suavemente los cartones para que la mayoría de los frass caigan en la jaula de origen mientras permites que los grillos se aferren al cartón durante la repetición de los pasos 2.2.7-2.2.10.
- Use un cepillo o una cuchara de plástico para alentar a los grillos atrapados en el frass a pasar de la jaula central a una jaula limpia.
- Inspeccione la jaula de origen para asegurarse de que todos los grillos hayan sido transferidos.
- Transfiera todos los frass, platos de sustrato y alimento de hidratación gastados, toalla de papel, exuviae y grillos muertos que queden en la jaula de origen al recipiente de desechos en autoclave.
- A menos que los residuos vayan a ser esterilizados en autoclave inmediatamente, guárdelos en un congelador de la instalación a -20 °C.
- Inspeccione el piso, la ropa de los trabajadores, la jaula de contención secundaria y la superficie de trabajo en busca de grillos escapados.
- Desinfecte la superficie de trabajo y la jaula de contención secundaria con una solución de lejía al 10%, desechando las toallas de papel en el recipiente de residuos en autoclave.
- Transfiera los grillos a jaulas limpias cada 2 semanas. Replicar la disposición de las jaulas de los pasos 2.2.1-2.2.4
- Instalación de jaulas experimentales
NOTA: Las jaulas experimentales son recipientes de plástico que albergan menos grillos. Su configuración es idéntica a las jaulas de 29.3 L que contienen reproductores, pero dependen de recipientes de 7.1 L abastecidos con platos más pequeños de agua, alimento y contienen un área de superficie reducida de cartón de huevos.- Coloque seis piezas de cartón de 10,1 cm x 15,4 cm (4 pulgadas x 6 pulgadas) en el extremo distal de cada jaula experimental con las hachas largas de los cartones que abarcan el ancho de la dimensión estrecha de la jaula y los ejes cortos de los cartones orientados hacia la tapa y el piso.
- Empaque 10 g de la mezcla de trabajo de fibra de coco hidratada en una placa de Petri.
- Use una botella de lavado que contenga agua DI para agregar aproximadamente 15 ml de agua DI, o hasta que se forme un menisco en la superficie de la fibra de coco.
- Invierta la tapa de una placa de Petri de 60 mm x 15 mm para sujetar el alimento.
NOTA: La velocidad de alimentación puede variar a lo largo de la duración del ensayo. Para el procedimiento experimental de aleatorización y siembra de grillos en jaulas, consulte materiales suplementarios paso 1.4.
- Terminación de insectos
- Cuando los grillos ya no sean necesarios para la cría o el uso experimental, siga el paso 2.2.17.
- Cuando los grillos estén muertos, retire la jaula del congelador. Retire la tapa y transfiera todos los materiales contenidos a un recipiente de residuos esterilizable en autoclave. Transfiera los residuos de nuevo al congelador hasta el autoclave.
- Sumerja la jaula vacía en una solución de lejía al 10% y déjela reposar durante un mínimo de 5 minutos.
- Enjuague triplemente la jaula vacía con agua fría del grifo para eliminar los residuos de lejía, con especial atención a los canales en el fondo del recipiente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los datos que demuestran la cría exitosa de grillos desde la eclosión hasta los 65 días de edad se recopilaron durante un ensayo de alimentación en septiembre de 2021. Los grillos se cultivaron a partir de huevos siguiendo los pasos 1.1.1-2.6.1 de estos protocolos, y seis jaulas replicadas se abastecieron con 24 grillos aleatorios de 22 días de edad (tercer instar) siguiendo el paso 2.7 anterior. Los grillos se criaban en condiciones ambientales de la habitación; sin embargo, debido a un mal funcionamiento de la unidad de tratamiento de aire de la instalación, la temperatura ambiente promedio fue de 25 ± 1 ° C a 20% de humedad relativa en lugar de los 27 ° C sugeridos. La masa de grillo se midió dos veces por semana entre 22 y 65 días después de la eclosión. Los resultados de este experimento se describen a continuación y se presentan como medias más o menos desviación estándar.
Los datos mostrados en la Figura 1 y la Figura 2 representan las seis jaulas replicadas a las que se les administró la alimentación estándar descrita en este protocolo. Los grillos se sembraron de una población con una masa media de 21 ± 9 mg. Al final del experimento, la masa media de todos los grillos juveniles y adultos combinados fue de 0,724 g ± 0,190 g (Figura 1). Como G. bimaculatus es sexualmente dimórfico, también reportamos masa adulta por sexo. La proporción de sexos en la cosecha fue del 51% de mujeres. De los 30 varones adultos presentes a los 65 días de edad cuando terminó el experimento, la masa media fue de 0,721 g ± 0,123 g. De las 58 hembras adultas presentes a los 65 días de edad, la masa media fue de 0,841 g ± 0,112 g (Figura 2). La supervivencia entre la siembra y la cosecha fue del 89% y se midió semanalmente por los recuentos totales de todos los grillos individuales en todas las jaulas. En el día 65, el 68,2% de todos los grillos habían alcanzado el instar adulto (Figura 2).
Figura 1: Masa media de grillos individuales 22-65 días después de la eclosión. Las barras representan cuartiles de masa media de grillo por jaula, n = 6 jaulas. Todos los grillos se contaron y pesaron 2 veces por semana, excepto en 1 semana del experimento, en la que se pesaron solo una vez. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Masa media de grillo adulto por sexo al final del experimento. Grillos machos n = 30, grillos hembra n = 58. Las barras representan cuantiles de masa media; 'x' representa la masa de grillo por sexo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Materiales suplementarios: (1) Fibra de coco y seguridad respiratoria, (2) Eliminación del material de fibra de coco, (3) Calibración de la entrega de niebla, (4) Construcción de la tapa tamizada, (5) Siembra experimental de jaulas, (6) Aleatorización de grillos a jaulas, (7) Métodos utilizados para el análisis de alimentos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S1: Vista lateral de la jaula de cricket que contiene la disposición correcta de los refugios de cartón de cartón, el alimento y la fibra de coco. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Vista superior de las placas de Petri que contienen fibra de coco y alimento para grillos colocados en la parte inferior de la jaula. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S3: Grillos que se transfieren desde el fondo de una jaula a una nueva jaula inclinándose lentamente como se describe en los pasos 2.2.11-2.2.13. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S4: Jaulas que contienen grillos colocados en bastidores de cría iluminados. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria S1: (1) Análisis nutricionales de piensos comerciales, (2) Lista de ingredientes de piensos del fabricante. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La simplicidad de este enfoque para la cría de cricket puede beneficiar a una variedad de áreas de investigación y representa una plantilla genérica para la cría exitosa de cricket, fácilmente adaptable a una variedad de necesidades experimentales. En comparación con varios otros estudios de G. bimaculatus, el tamaño adulto del cuerpo individual es más pequeño y la maduración es más lenta14, lo que atribuimos a la temperatura de cría subóptima que nos imponen las circunstancias. Los métodos descritos anteriormente se han utilizado y refinado en el transcurso de 2 años. Se han mantenido cultivos robustos sin evidencia de problemas a veces observados en el cultivo comercial de grillos, incluida la mortalidad generalizada por patógenos con signos clínicos clásicos (por ejemplo, licuación interna debido a densovirus en Acheta domesticus) o canibalismo excesivo15. Es probable que la falta de introducciones de grillos después del establecimiento de la colonia redujera en gran medida la probabilidad de carga de enfermedad.
Prevenir las aglomeraciones es importante para garantizar la salud del cricket. Wild G. bimaculatus son solitarios, y los machos defienden sus territorios a través de exhibiciones agresivas yluchas 16. El cuidado exitoso en cautiverio requiere mantener la densidad de colonias dentro de un rango apropiado para reducir el comportamiento antagónico y las respuestas generales al estrés13. Esto se logra proporcionando a los grillos abundante refugio dentro de la jaula y adelgazando las poblaciones reproductoras de grillos a 150 individuos por jaula de 29.3 L a los 20 días después de la eclosión cuando alcanzan un tamaño promedio de 0.01 g, durante el tercer o cuarto juvenil instar. Esta densidad de cría es idéntica a la utilizada en los ensayos de optimización de piensos de G. bimaculatus de Sorjonen et al.14. Una consideración de particular relevancia durante la transferencia de grillos de un contenedor a otro es el alto grado de riesgo de escape. La contención secundaria, los movimientos controlados, la preparación para detener a los fugitivos y la vigilancia son herramientas cruciales para evitar el escape del grillo durante este proceso. Tales medidas reflejan la designación de Gryllus spp por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. grillos como posibles plagas de cultivos, que requieren permisos federales y estatales para la cría en los Estados Unidos17.
Los controles ambientales y la calidad del alimento durante las etapas de huevos y ninfas tempranas son importantes para la salud de todos los cultivos de grillos en cautiverio, incluido G. bimaculatus. Para poner huevos viables, la hembra G. bimaculatus requiere un sustrato húmedo en el que ovipositar18. La fibra de coco es ampliamente utilizada en la industria de producción comercial de grillos como medio para la oviposición. Estos métodos se basan en la fibra de coco humedecida con agua DI como sustrato tanto para la oviposición como para la hidratación de los grillos a lo largo de su ciclo de vida. Del mismo modo, el uso de toallas de papel húmedas en jaulas juveniles para absorber el exceso de gotas de agua y proporcionar gradientes de humedad dentro del ambiente natal ha demostrado ser altamente efectivo para reducir el número de grillos de <1 semana de edad que sucumben a la deshidratación o al ahogamiento, como lo indica la presencia o ausencia de grillos juveniles fallecidos en los fondos de las jaulas. Se sabe que la nutrición juvenil desempeña un papel descomunal en la predicción del rendimiento de crecimiento exitoso en los grillos. Asegurarse de que el alimento fresco de nutrición completa sea de un tamaño de partícula adecuado para grillos de <0.01 g conducirá a una mayor supervivencia, ya que los grillos más jóvenes serán más susceptibles a los impactos de la variabilidad en la calidad del alimento19.
El alimento de grillo disponible comercialmente utilizado en este estudio fue seleccionado debido a su uso generalizado en la industria agrícola de grillos de América del Norte. En primer lugar, a partir de las comunicaciones personales con tres agricultores comerciales de cricket, dos en el Medio Oeste Superior de los Estados Unidos y uno en el sur de los Estados Unidos, está claro que este alimento (Mazuri) se aplica ampliamente en la industria de insectos comestibles hasta la fecha. Los agricultores de cricket lo encuentran susceptible de un rendimiento de crecimiento deseable, fecundidad, desarrollo y métricas de aumento de peso. En segundo lugar, para los técnicos encargados de administrar alimento a un gran número de grillos en entornos de laboratorio, es conveniente utilizar un alimento premezclado en polvo durante toda la vida útil de los insectos. En tercer lugar, se sabe que la demanda de proteínas es un factor importante en el desarrollo del grillo y, aunque muchas otras necesidades nutricionales específicas para G. bimaculatus no se comprenden completamente, esta mezcla preformulada contiene un porcentaje de proteína cruda, que se encuentra dentro del rango óptimo reportado de 22% -30% 14,20.
El espacio en las incubadoras es a menudo limitado. Las granjas de críquet generalmente comienzan sus grillos tempranos en incubadoras y transfieren ganado más maduro a entornos al aire libre, donde los sistemas de manejo de aire en toda la instalación regulan la temperatura y la humedad. Por estas razones, estos métodos están diseñados para emular tales arreglos en una escala más pequeña. Después de 20 días dentro de la incubadora, la densidad se reduce y los grillos se transfieren a tratamientos experimentales o a condiciones ambientales para su uso como reproductores. Cuando los sistemas de tratamiento de aire funcionan correctamente, la temperatura de la instalación de cría debe ser de 27 ± 1 ° C con una humedad relativa entre el 20% y el 25%. A los grillos se les permite el acceso ad libitum al agua y al alimento. El alimento al que se hace referencia a lo largo de estos métodos es Mazuri Cricket Feed utilizado ampliamente por los agricultores de cricket en América del Norte. Para un análisis nutricional completo, consulte la Tabla suplementariaS1.
Según los métodos de Donoughe y Extavour (2016), el algodón puede usarse en lugar de la fibra de coco como medio de oviposición o como material de envoltura sobre la fibra de coco para evitar que las partículas de frass o pienso contaminen la superficie del medio de oviposición18. Recomiendan que se coloque una capa delgada de algodón sobre el sustrato durante el período de oviposición y posteriormente se elimine una vez que se complete la oviposición, junto con el frass y los detritos acumulados. Aunque no se dispone de datos que midan el impacto de la contaminación del sustrato en la viabilidad de los huevos o el desarrollo del grillo, los protocolos descritos aquí producen resultados satisfactorios tanto en la producción de grillos juveniles como en el crecimiento. Esto puede atribuirse a las supuestas cualidades antimicrobianas de la fibra de coco y es motivo para futuras investigaciones en el ámbito de la producción de insectos comestibles21.
Debido a un mal funcionamiento de la unidad que regula la temperatura de la instalación de cría de grillos en la que se desarrollaron estos métodos, el ensayo para el que estamos reportando datos se realizó a 25 ° C a 20% de humedad relativa, que es 2 ° más fría de lo que dictan estos protocolos. Además, estos objetivos de investigación estrechamente basados en la alimentación dan como resultado una disponibilidad limitada de datos sobre ciertas métricas de interés, como la fecundidad, las respuestas endocrinas, la carga de patógenos y la expresión génica. Una vez que los grillos reproductores producían consistentemente abundantes huevos de grillo viables y se observó que la mortalidad juvenil era insignificante, los esfuerzos se centraron principalmente en la experimentación directamente relevante para las preguntas de investigación. Por lo tanto, este informe ofrece solo relatos anecdóticos de los impactos a largo plazo en el rendimiento del crecimiento de estos métodos en >10 generaciones. Finalmente, el uso de materiales derivados de plantas como la fibra de coco y el cartón en jaulas experimentales probablemente conduce a la ingestión incidental por parte de los grillos. Esto es aceptable dentro del diseño de estos estudios, pero puede comprometer la validez de los diseños de estudios cuando los hallazgos se basan en mediciones precisas de la biomasa total ingerida.
El protocolo descrito aquí está destinado a ser básico y completo, con pasos claros y fáciles de seguir para la cría factible de grillos en un entorno de laboratorio alimentado con un alimento estándar disponible comercialmente. La utilización de un procedimiento estandarizado de este tipo con una limpieza óptima, densidad de siembra y controles ambientales permite el mantenimiento de colonias de grillos uniformes y saludables a largo plazo; además, contribuirá a la creciente investigación sobre G. bimaculatus como un insecto comestible cultivable con implicaciones para la salud humana. También puede ser útil para estudios sobre fisiología de insectos, optimización del crecimiento y genética.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
El financiamiento para este proyecto fue posible gracias a subvenciones internas de la Universidad de Wisconsin-Madison. Las más sinceras gracias a Kevin Bachhuber de Bachhuber Consulting Inc. por acceder a su guía inédita para la cría comercial de cricket y a Michael Bartlett Smith por su ayuda en la refinación y solución de problemas de estos métodos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 31-qt (29.3 L) Snap-lid tote bin with lid | HOMZ | 3430CLBL | Used to house breeding stock |
| 3-tier/12-tray Grow Light Stand | Fischer Scientific | NC1938548 | |
| 50-gal (189.27L) tote bin with lid | Sterilite | #14796603 | Used as secondary containment when handling crickets |
| 50 mL polypropylene graduated cylinder | Fischer Scientific | S95171 | |
| 7.5-qt (7.1 L) snap-lid tote bin with lid | HOMZ | 3410CLBL | Used to house exprimental stock |
| Accuris 500 g x 0.01 g Balance | Manufactured by Accuris, a subsidieary of Benchmark Scientific | W3300-500 | Purchased from Dot Scientific through University of Wisconsin system purchasing service "ShopUW+" |
| Ace Premier 1 Inch Flat Chip Brush | Ace Hardware | #1803261 | |
| Bel-Art SP Scienceware deionized water wash bottle | Fischer Scientific | 03-421-160 | |
| Bright aluminum window screen | Phifer | UNSPSC# 11162108 | Mesh size 18 x 16" |
| Clear Disposable Plastic Portion Cups 5.5 oz w/ lids | Wal-Mart | N/A | |
| Deionized water | |||
| Diablo 4-4/8" x 13 TPI Ultra Fine Finish Bi-Metal Jigsaw Blade | Home Depot | #313114935 | |
| Egg Filler Flats-Paper, 12 x 12" | Uline | S-5189 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 100 x 15mm | Fischer Scientific | FB0875714 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 60 x 15mm | Fischer Scientific | FB0875713A | |
| Georgia-Pacific Envision Brown Paper Towels | Home Depot | #205675843 | |
| Infinity Tough Guy high performance hot-melt glue sticks | Infinity Bond | Infinity IM-Tough-Guy-12 | |
| Mazuri Cricket Diet | Land O' Lakes International | SKU# 3002219-105 | |
| Stanley TimeIt Twin 2-outlet Grounded Mechanical 24 Hour Timer | Wal-Mart | N/A | |
| Vermont Organics Reclamation Soil 11 lb Coir Block | Home Depot | #300679904 |
References
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Merkel, G. The effects of temperature and food quality on the larval development of Gryllus bimaculatus (Orthoptera, Gryllidae). Oecologia. 30 (2), 129-140 (1977).
- Bateman, P. W. Mate preference for novel partners in the cricket Gryllus bimaculatus. Ecological Entomology. 23 (4), 473-475 (1998).
- Mito, T., Noji, S. The two-spotted cricket Gryllus bimaculatus: An emerging model for developmental and regeneration studies. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Ylla, G., et al. Cricket genomes: the genomes of future food. BioRxiv. , (2020).
- Hanboonsong, Y., Jamjanya, T., Durst, P. B. Six-legged livestock: edible insect farming, collecting, and marketing in Thailand. , Available from: http://www.fao.org/docrep/017/i3246e00.htm (2013).
- Halloran, A., Roos, N., Hanboonsong, Y. Cricket farming as a livelihood strategy in Thailand. Geographical Journal. 183 (1), 112-124 (2017).
- Wade, M., Hoelle, J. A review of edible insect industrialization: scales of production and implications for sustainability. Environmental Research Letters. 15, 123013 (2020).
- EL-Damanhouri, H. I. H. Studies on the influence of different diets and rearing conditions on the development and growth of the two-spotted cricket Gryllus bimaculatus de Greer. , Available from: https://epub.uni-bayreuth.de/310/1/Diss.pdf (2011).
- Ngonga, C. A., Gor, C. O., Okuto, E. A., Ayieko, M. A. Growth performance of Acheta domesticus and Gryllus bimaculatus production reared under improvised cage system for increased returns and food security. Journal of Insects as Food and Feed. 7, 301-310 (2021).
- Behrens, W., Hoffmann, K. -H., Kempa, S., Gäßler, S., Merkel-Wallner, G. Effects of diurnal thermoperiods and quickly oscillating temperatures on the development and reproduction of crickets, Gryllus bimaculatus. Oecologia. 59 (2-3), 279-287 (1983).
- Collavo, A., et al. Housecricket smallscale farming. Ecological implications of minilivestock. Potential of insects, rodents, frogs and snails. Paoletti, M. G. , Science Publishers. Enfield, N.H., USA. Chapter 27 (2005).
- Simmons, L. W. Competition between larvae of the field cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera: Gryllidae) and its effects on some life-history components of fitness. Journal of Animal Ecology. 56, 1015-1027 (1987).
- Sorjonen, J. M., et al. The plant-based by-product diets for the mass-rearing of Acheta domesticus and Gryllus bimaculatus. PLOS ONE. 14 (6), 0218830 (2019).
- Maciel-Vergara, G., Jensen, A. B., Lecocq, A., Eilenberg, J. Diseases in edible insect rearing systems. Journal of Insects as Food and Feed. 7 (5), 1-18 (2021).
- Alexander, R. D. Aggressiveness, territoriality, and sexual behavior in field crickets (Orthoptera: Gryllidae). Behaviour. , 130-223 (1961).
- Pet food, fish bait, and animal feed. USDA APHIS. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/planhealth/import-information/permits/plant-pests/sa_animalfeed/ct_petfood_fishbait_animalfeed (2022).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. 411 (1), 140-156 (2016).
- Dobermann, D., Michaelson, L., Field, L. M. The effect of an initial high-quality feeding regime on the survival of Gryllus bimaculatus (black cricket) on bio-waste. Journal of Insects as Food and Feed. 5 (2), 1-8 (2018).
- Lundy, M. E., Parrella, M. P. Crickets are not a free lunch: Protein capture from scalable organic side-streams via high-density populations of Acheta domesticus. PLOS ONE. 10, 0118785 (2015).
- Mazaya, G., Karseno, K., Yanto, T. Antimicrobial and phytochemical activity of coconut shell extracts. Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology. 8 (5), 1090-1097 (2020).
