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Mantendo culturas laboratoriais de Gryllus bimaculatus, um modelo ortopéde versátil para agricultura de insetos e fisiologia de invertebrados

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63277
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 2Global Health Institute, University of Wisconsin-Madison

Summary

Este artigo descreve métodos básicos para padronizar fatores importantes como densidade, disponibilidade de ração, fonte de hidratação e controles ambientais para a criação a longo prazo de culturas laboratoriais do grilo comestível, Gryllus bimaculatus.

Abstract

Gryllus bimaculatus (De Geer) é um grilo de grande porte distribuído por toda a África e eurásia do sul, onde é frequentemente colhido como alimento humano. Fora de sua faixa nativa, cultivar G. bimaculatus é viável devido à sua plasticidade dietética, ciclo reprodutivo rápido, falta de necessidade de diapausa, tolerância para criação de alta densidade e robustez contra patógenos. Assim, G. bimaculatus pode ser um modelo versátil para estudos de fisiologia de insetos, comportamento, embriologia ou genética.

Parâmetros culturais, como densidade de estocagem, refugia dentro da gaiola, fotoperíodo, temperatura, umidade relativa e dieta, todos impactam o crescimento, o comportamento e a expressão genética do críquete e devem ser padronizados. Na crescente literatura sobre insetos agrícolas para consumo humano, esses grilos são frequentemente empregados para avaliar as misturas de ração de candidatos derivadas de resíduos de culturas, subprodutos de processamento de alimentos e outros fluxos de resíduos de baixo custo.

Para apoiar experimentos em andamento avaliando o desempenho de crescimento do G. bimaculatus e a qualidade nutricional em resposta aos substratos de ração variável, foi desenvolvido um conjunto abrangente de protocolos padrão para reprodução, manutenção, manuseio, medição e eutanásia em laboratório. Uma ração de críquete padrão da indústria provou ser nutricionalmente adequada e funcionalmente apropriada para a manutenção a longo prazo de estoques de reprodução de críquete, bem como para uso como uma ração de controle experimental. Criando esses grilos a uma densidade de 0,005 grilos/cm3 em gaiolas de polietileno de 29,3 L com cobertura de tela a uma temperatura média de 27 °C em um fotoperiodo de 12 luz (L)/12 escuro (D), com coir de coco umedecido servindo tanto como fonte de hidratação quanto meio de oviposição tem sustentado com sucesso grilos saudáveis ao longo de um período de 2 anos. Seguindo esses métodos, os grilos em um experimento controlado produziram uma massa média de 0,724 g 0,190 g na colheita, com 89% de sobrevivência e 68,2% de maturação sexual entre meia (22 dias) e colheita (65 dias).

Introduction

Como tipificado pelo inseto icônico, a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster, o uso de insetos como organismos modelo de laboratório fornece vantagens distintas para estudos em genética, toxicologia e fisiologia1. O pequeno tamanho dos insetos reduz o espaço necessário para as culturas e a quantidade de ração e materiais consumíveis necessários. Muitos insetos se reproduzem rapidamente tornando-os exclusivamente adequados à criação de linhas genéticas especializadas e estudos que requerem a avaliação de múltiplas gerações sucessivas.

Muitos estudos se concentram em insetos holometabolosos como a Drosophila, que exibem metamorfose completa e pupação. No entanto, outros modelos estão disponíveis, incluindo Gryllus bimaculatus (De Geer), o críquete de campo de dois avistados. G. bimaculatus é um inseto paurometabolous que sofre entre 7 e 11 instars ninfas antes de atingir a maturidade sexual2. Este grilo exibe uma ampla gama de comportamentos relacionados à seleção sexual, incluindo estridulação, exibições territoriais e guarda-mate3. Grilos imaturos são diferentes das larvas de espécies de insetos holometabolos, pois eles, semelhantes a muitos jovens paurometabolos, são capazes de regenerar membros perdidos e danificados durante a ecdysis4. Além disso, o genoma totalmente sequenciado de G. bimaculatus foi publicado em 20215. Essas características tornam esses grilos atraentes como alvo para pesquisas básicas.

Grilos de campo com dois avistados são amplamente criados para comida humana e ração animal. A escala dessas operações é muitas vezes muito maior do que para pesquisas laboratoriais 6,7. Apesar da diferença de escala, os desafios enfrentados pelos pesquisadores se sobrepõem muito aos encontrados pelos agricultores comerciais de críquete. Essas considerações convergem no contexto de pesquisas baseadas em laboratório com o objetivo de melhorar a produção de insetos comestíveis. À medida que a indústria de insetos comestíveis continua a evoluir e crescer, otimizar os insumos alimentares e uma miríade de outros aspectos da produção é um objetivo primário8. Estudos de laboratório que demonstram melhorias medidas na eficiência de criação, sobrevivência ou tempo de geração nesses grilos têm o potencial de ajudar a aumentar a rentabilidade das operações de agricultura de críquete a longo prazo.

Protocolos padronizados de criação permitem uma comparação mais estreita entre estudos que investigam a otimização da criação. Até o momento, foram publicados poucos protocolos aprofundados para a criação de G. bimaculatus em laboratório. Um protocolo ideal refletiria as condições encontradas nas operações de críquete do mundo real, mantendo as condições estritamente controladas necessárias para medir com precisão as mudanças no desempenho de crescimento decorrentes de tratamentos experimentais e destacando estratégias de mitigação de riscos. Os métodos descritos neste artigo foram desenvolvidos com base em protocolos, técnicas e aparelhos publicados usados para criar uma variedade de espécies de críquete em uma ampla gama de escalas de produção laboratorial e comercial 2,9,10,11,12. Esses métodos também são informados por várias fontes não revisadas por pares, incluindo boletins técnicos inéditos e comunicação pessoal com agricultores comerciais de críquete na América do Norte. Este protocolo foi desenvolvido com a intenção de facilitar o estabelecimento de culturas laboratoriais de G. bimaculatus especificamente para uso em ensaios relacionados à agricultura de insetos.

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Protocol

1. Preparando o substrato de oviposição

NOTA: Coir de coco é um substrato ideal para G. bimaculatus. Para obter métodos detalhados sobre como separar coir do tijolo de coir comprimido e uma nota sobre segurança respiratória, consulte materiais suplementares passo 1.1.

  1. Lave as mãos com água e sabão.
  2. Tare um recipiente limpo em um equilíbrio e pese uma massa de coir de coco seco aproximadamente do tamanho de um punho humano.
  3. Coloque coir em um recipiente vedado e limpo, que pode acomodar a expansão em até 6x do volume original.
  4. Com as mãos limpas, separe suavemente pedaços de coir da peça removida do bloco maior.
  5. Utilizando um cilindro graduado de 50 mL, meça o volume correto de água deionizada (DI) para alcançar uma proporção de 5:1 por massa de cinco partes de água para uma parte de coir seco.
  6. Adicione a água DI medida lentamente, hidratando uniformemente todas as partículas de coir. Moitas maceradas manualmente para garantir a hidratação uniforme.
  7. Re-tare o recipiente em que o coir foi anteriormente pesado.
  8. Pese 75 g de coir molhado.
  9. Transfira 75 g do coir molhado em uma placa de Petri de 100 mm x 15 mm usando uma colher de plástico limpa para garantir que o coir esteja uniformemente espalhado ao redor do fundo da placa e que não haja aglomerados.
  10. Rotule o lado da placa de Petri com fita de laboratório com um rótulo denotando colônia natal e data do evento de coleta de ovos.
  11. Meça um adicional de 45 mL de água DI em um cilindro graduado.
  12. Adicione água uniformemente sobre a superfície do coir embalado na placa de Petri para garantir a hidratação uniforme. Certifique-se de que o coir está saturado ao ponto de que a água se agrupa aproximadamente 1/4 no caminho até as laterais do recipiente.
  13. Uma vez que a placa de Petri tenha sido embalada, sele o coir molhado restante em um vaso hermético para armazenamento a -20 °C.
    NOTA: Seguindo os métodos prescritos por este artigo, os indivíduos G. bimaculatus atingirão a maturidade sexual após uma média de 58 dias após a oviposição.
  14. Coleta de ovos
    1. Coloque o substrato de oviposição hidratado em gaiolas contendo os estoques parentais desejados de grilos o mais longe possível da alimentação devido ao potencial para grilos transferirem mecanicamente grânulos de ração para o substrato de oviposição.
    2. Documente a data e a hora.
      NOTA: A densidade de trabalho padronizada para colônias de críquete reprodutivo criadas seguindo esses métodos é n = 150 indivíduos adultos. Nessa densidade, uma janela de oviposição de 24 horas renderá entre 800 e 1.500 ovos, dependendo da idade da colônia, esforço de oviposição prévia e relação sexual da gaiola dos pais.
    3. Coloque um pequeno recipiente de lixo autoclavável na superfície de trabalho para explicar o risco de contenção representado pelo manuseio e limpeza de substratos de oviposição ricos em ovos.
    4. Coloque uma gaiola de plástico 29,3 L limpa e vazia no banco ao lado do recipiente de lixo para servir como a gaiola receptora para o substrato de oviposição rico em ovos.
    5. Coloque a gaiola 29.3 L contendo os estoques de críquete dos pais e substrato de oviposition no lado oposto do recipiente de lixo da gaiola vazia.
    6. Depois de 24 horas, remova o substrato de oviposition da gaiola de críquete pai e localize-o sobre o vaso de resíduos autoclavável.
    7. Inspecione o topo do substrato de oviposição para qualquer partícula de frass ou ração que os grilos possam ter chutado para a superfície do coir.
      NOTA: Qualquer substância, que não seja massa de ovo ou coir, pode fazer com que o molde se forme no substrato durante a incubação.
    8. Remova os contaminantes coir no vaso de resíduos com uma colher de colher limpa ou colher de plástico.
    9. Coloque a colher de plástico no recipiente de resíduos.
    10. Coloque o substrato de oviposição limpo na gaiola limpa de 29,3L.
    11. Coloque a gaiola em uma incubadora fixada a 27 °C a 60% de umidade relativa em um fotoperíodo de 12 h D/12 h L.
    12. Devolva a gaiola contendo o estoque de reprodução para o local original e limpe todos os itens da superfície de trabalho.
    13. Coloque o recipiente de resíduos em um freezer in-facility dedicado ao armazenamento de itens potencialmente contaminados com ovos de críquete.
    14. Higienize a superfície de trabalho com solução de alvejante de 10% e deixe-a sentada por 60 s.
    15. Limpe a superfície de trabalho seca com uma toalha de papel limpa. Abra o congelador e descarte a toalha de papel no recipiente de resíduos.
  15. Misting e monitoramento de ovos substratos diariamente
    NOTA: Para os métodos utilizados para calibrar o volume de névoa fornecido por uma garrafa de spray, consulte materiais suplementares passo 1.2.
    1. Posicione uma garrafa de spray sobre o substrato de oviposição para que a água expressa seja distribuída uniformemente sobre a superfície do substrato.
    2. Realize o número de atuações de bomba calculadas na etapa 1.2 de Materiais Suplementares para cada substrato de oviposição diariamente por 11 dias consecutivos.
    3. Verifique cada substrato de oviposição diariamente, monitorando o crescimento de moldes de fisordenos na superfície do coir.
    4. Se observar o crescimento fúngico, use uma colher limpa ou colherula para remover manchas de mofo superficial.
    5. Descarte a ferramenta e o coir removido no recipiente de resíduos autoclaváveis armazenado no congelador da instalação.
      NOTA: Não está claro se o molde afeta negativamente o desenvolvimento do críquete.
    6. No dia 11 pós oviposition, comece a olhar atentamente para o substrato para grilos juvenis.
      NOTA: A 27 °C, os ovos de G. bimaculatus requerem de 11 a 13 dias para eclodir.
  16. Montando gaiolas de natal
    1. Selecione dois apartamentos de caixa de ovos comerciais não usados de 30,8 cm x 30,8 cm (12 polegadas x 12 polegadas). Com uma faca de utilidade ou tesouras fortes, corte-as em seis tiras separadas de 10,1 cm de largura de tamanho igual. Escove as bordas cortadas com as mãos para remover partículas pendentes de papelão.
    2. Coloque os seis pedaços individuais de 10,1 cm x 30,8 cm (4 polegadas x 12 polegadas) verticalmente na parte inferior da gaiola com o eixo mais longo da caixa abrangendo o eixo horizontal mais estreito de uma gaiola de 29,3L. Coloque um sétimo pedaço de caixa plana no topo das seis peças eretas.
    3. Selecione três pedaços de papel toalha marrom áspero de aproximadamente 25 cm x 25cm. Dobre cada um ao meio. Coloque dois de tal forma que eles cobrem a parte superior do lado proximal da estrutura da caixa. Coloque um sobre a pilha de caixas no lado distal.
    4. No 11º dia, mova o substrato de oviposition para o canto proximal da direita da gaiola.
  17. Cuidando de instars precoces
    NOTA: No dia 14 pós oviposition, a maioria dos ovos viáveis terá eclodido e as ninfas de críquete em estágio inicial exigirão ração e água. Grilos jovens são incapazes de quebrar a tensão superficial das gotículas de água e podem se afogar se a água estiver agrupada em seu ambiente. No entanto, eles também são sensíveis à proficação. Proporcionar uma umidade relativa consistente de cerca de 60% durante esta fase de desenvolvimento é importante para garantir a sobrevivência.
    1. Quando uma escotilha é observada, misture as toalhas de papel colocadas sobre o topo das caixas na etapa 1.4.3 até que sejam molhadas, mas não derramando água ativamente.
    2. Limpe bem os dois lados de uma tampa de placa de Petri de 100 mm com 70% de etanol e deixe secar. Use-o como recipiente no qual a alimentação de críquete será entregue.
      NOTA: Grilos iniciais requerem partículas de alimentação menores do que grilos em estágios subsequentes de desenvolvimento. Esta alimentação mais fina deve ser administrada aos grilos durante os primeiros 20 dias após o surgimento.
    3. Colher 50 g da ração em um liquidificador de 60 watts de uma única porção e moinho a 10.000 rpm por 1 min.
    4. Meça 1 g da alimentação e agite-a na tampa da placa de Petri na gaiola. Usando a extremidade limpa de uma colher ou colherula, espalhe a alimentação o mais uniformemente possível sobre a parte inferior do prato.
    5. Substitua a alimentação a cada 2 dias. Use a ponta da colher para escovar grilos do prato de alimentação antes de removê-lo. Descarte a ração antiga no recipiente de resíduos autoclaváveis.
    6. Monitor para o crescimento do molde na alimentação. Se a ração começar a parecer branca ou esverdeado, descarte a placa de Petri e alimente-se imediatamente.
    7. Em 14 dias após oviposition, use um pincel de 2,54 cm para remover grilos agarrados ao substrato de coir natal, escovando todos os grilos da superfície do coir e laterais da placa de Petri na gaiola.
    8. Coloque o substrato de oviposição removido no recipiente de resíduos autoclaváveis e armazene-o no congelador até que se autoclave.
    9. Substitua o substrato natal por um prato de coir fresco para hidratação preparado seguindo as etapas 1.1.5-1.1.9.
    10. Use uma garrafa de lavagem de água DI para adicionar água até que a superfície do coir brilgue, mas não esteja agrupando.
      NOTA: A densidade de críquete impacta fortemente o desempenho de crescimento em G. bimaculatus13. Manter o estoque de reprodução em densidade excessiva corre o risco de introduzir efeitos epigenéticos indesejados induzidos por aglomeração em experimentos nos quais sua descendência é usada9. Os grilos devem ser "diluídos" das altas densidades que emergem dos substratos de oviposition e distribuídos em densidades que aderem ao padrão de 0,005 grilos/cm3 de espaço.

2. Cuidar de estrelas três para adultos

  1. Montando gaiolas
    NOTA: Para obter detalhes sobre a técnica para construir a tampa monitorada, consulte materiais suplementares passo 1.3.1.
    1. Repita o passo 1.4.1.
    2. Instale cinco pedaços de caixa de ovos cortados na extremidade distal da gaiola para que as concavidades em forma de ovo estejam voltadas para fora. Certifique-se de que as extremidades curtas são sobre os lados da gaiola, o lado longo fica plano contra a parte inferior, e há aproximadamente 3 cm de espaço entre cada pedaço de caixa.
    3. Coloque a última peça de caixa cortada em cima das peças de caixa vertical, como o telhado de uma casa, como mostrado na Figura Suplementar S1.
    4. Siga os passos 1.1.8-1.1.13 para preparar os substratos de hidratação.
    5. Coloque o substrato de hidratação no canto direito proximal da gaiola de críquete, conforme mostrado na Figura Suplementar S2.
    6. Use uma garrafa de lavagem para adicionar 6-10 mL de água DI até que a superfície coir pareça molhada e reflexiva, mas o coir não está totalmente submerso.
      NOTA: A superfície deve parecer levemente escurecida, com tensão superficial fazendo com que a água siga os contornos do coir.
    7. Inverta a tampa de uma placa de Petri de 100 mm e coloque-a no lado esquerdo proximal da gaiola. Adicione 2-3 g de alimentação padrão de críquete, como mostrado na Figura Suplementar S2.
  2. Modificando a densidade das colônias
    NOTA: Conduza esta etapa em 20 dias após a eclosão ou quando os grilos atingem uma massa média de 0,01 g.
    1. Na superfície de trabalho, coloque um recipiente grande que possa acomodar o plano de piso de três gaiolas de 29,3 L parados lado a lado.
      NOTA: Esta é uma contenção secundária e controlará grilos que escapam durante sua transferência de uma colônia para outra.
    2. Remova a colônia original do rack de criação e coloque-a na superfície de trabalho.
    3. Para o lado direito da colônia original, coloque uma gaiola vazia do mesmo tamanho.
    4. No lado direito da gaiola vazia, coloque uma gaiola que foi montada de acordo com as etapas 2.1.1-2.1.7.
    5. Verifique se os grilos não estão agarrados à parte inferior da tampa telada da gaiola contendo os grilos. Se observado, toque no topo da gaiola para desalojá-los.
    6. Abra a tampa da gaiola contendo os grilos.
    7. Em um movimento suave e suave, transfira a caixa "telhado" e todos os grilos aderindo aos seus contornos para a gaiola do meio.
    8. Uma vez que a caixa esteja dentro da gaiola do meio, agitar suavemente o papelão contra os lados para desalojar todos os grilos.
    9. Inspecione visualmente que todos os grilos foram sacudidos livremente antes de devolver a peça da caixa ao lado proximal da gaiola de origem para permitir que os grilos restantes aderam à caixa.
    10. Repetir passos 2.2.8-2.2.9 com todas as peças de caixa na gaiola, trabalhando sequencialmente da frente para a parte de trás da gaiola original até que todos os grilos tenham sido transferidos para a gaiola do meio.
    11. Incline suavemente a gaiola do meio contendo os grilos para que todos os grilos contidos sejam direcionados para o canto inferior.
    12. Levante a gaiola contendo os grilos sobre a gaiola do receptor.
    13. Incline lentamente a gaiola do doador para que os grilos comecem a ganhar compra nas laterais e possam se mover de forma controlada para fora da massa no canto inferior, como mostrado na Figura Suplementar S3.
    14. Se os grilos avançarem muito rapidamente, ajuste o ângulo em que a gaiola do meio é mantida, fazendo com que os grilos recuem.
    15. Enquanto a gaiola estiver inclinada, use um pincel de 2,54 cm para direcionar os grilos para a gaiola do receptor, contando cada um até que a contagem total seja igual a 150 indivíduos. Use o pincel para deter aqueles que avançam muito rapidamente para uma contagem precisa.
    16. Rotule a gaiola de críquete recém-abastecida com data, estoque parental e o número de grilos contidos.
    17. Eutanásia humanamente grilos em excesso ainda no fundo dos recipientes médios e originais, colocando o recipiente inteiro em um congelador a -20 °C por um mínimo de 30 min.
    18. Inspecione a gaiola de origem para garantir que todos os grilos foram transferidos.
    19. Posicione as gaiolas de críquete em racks de cultivo de plantas 25 cm abaixo de capôes leves contendo luzes fluorescentes de espectro completo definidas em um temporizador ao ar livre de grau residencial programado para manter um fotoperiodo L/D de 12 h. Veja Figura Suplementar S4.
    20. Transfira todos os frass, pratos de hidratação gasta substrato e ração, papel toalha, exuviae e grilos mortos remanescentes na gaiola de origem para o recipiente de resíduos autoclaváveis.
    21. A menos que o lixo seja autoclavado imediatamente, armazene-o em um freezer in-instalação a -20 °C.
    22. Inspecione o chão, vestuário de trabalhador, gaiola de contenção secundária e superfície de trabalho para grilos fugitivos.
    23. Higienize a superfície de trabalho e a gaiola de contenção secundária com solução de alvejante 10%, descartando as toalhas de papel no recipiente de resíduos autoclaváveis.
  3. Alimentação e rega
    1. Abra o recipiente de armazenamento de ração hermético e encha um copo vazio de amostra de 100 mL com ração de críquete. Entre em cada colônia e deposite um quarto da ração guardada no copo na tampa da placa de Petri segurando a ração.
    2. Para grilos de água, prepare uma placa de Petri de coir seguindo as etapas 1.1.9-1.1.13.
    3. Aumente a taxa de alimentação proporcional à taxa de consumo para garantir a disponibilidade de alimentação ad libitum .
      NOTA: A demanda de alimentação de críquete muda durante todo o desenvolvimento.
  4. Transferindo grilos para gaiolas limpas
    1. Transfira os grilos para gaiolas limpas a cada 2 semanas. Replicou o arranjo das gaiolas das etapas 2.2.1-2.2.4
      NOTA: Quantidades significativas de frass terão acumulado nas concavidades das caixas de ovos.
    2. Transfira grilos para gaiolas limpas, seguindo as etapas 2.2.5-2.2.23.
    3. Manobra suavemente as caixas para que a maioria dos frass caia na gaiola de origem, permitindo que os grilos se agarram à caixa durante a repetição das etapas 2.2.7-2.2.10.
    4. Use um pincel ou colher de plástico para encorajar qualquer grilos presos no frass a mover da gaiola do meio para uma gaiola limpa.
    5. Inspecione a gaiola de origem para garantir que todos os grilos foram transferidos.
    6. Transfira todos os frass, pratos de hidratação gasta substrato e ração, papel toalha, exuviae e grilos mortos remanescentes na gaiola de origem para o recipiente de resíduos autoclaváveis.
    7. A menos que o lixo seja autoclavado imediatamente, armazene-o em um freezer in-instalação a -20 °C.
    8. Inspecione o chão, vestuário de trabalhador, gaiola de contenção secundária e superfície de trabalho para grilos fugitivos.
    9. Higienize a superfície de trabalho e a gaiola de contenção secundária com solução de alvejante 10%, descartando toalhas de papel no recipiente de resíduos autoclaváveis.
  5. Instalando gaiolas experimentais
    NOTA: Gaiolas experimentais são recipientes de plástico que abrigam menos grilos. Sua configuração é idêntica às gaiolas de 29,3 L que contêm estoques de reprodução, mas dependem de recipientes de 7,1 L abastecidos com pratos menores de água, ração e contêm uma área reduzida de superfície de caixa de ovos.
    1. Coloque seis peças de caixa de 10,1 cm x 15,4 cm (4 polegadas x 6 polegadas) na extremidade distal de cada gaiola experimental com os eixos longos das caixas que abrangem a largura da dimensão estreita da gaiola e os eixos curtos das caixas orientadas para a tampa e o chão.
    2. Embale 10 g da mistura de trabalho de coir hidratado em uma placa de Petri.
    3. Use uma garrafa de lavagem contendo água DI para adicionar aproximadamente 15 mL de água DI, ou até que um menisco se forme na superfície do coir.
    4. Inverta a tampa de uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm para segurar a alimentação.
      NOTA: A taxa de alimentação pode variar ao longo da duração do ensaio. Para o procedimento experimental de randomização e estocagem de críquete de gaiola, consulte materiais suplementares passo 1.4.
  6. Insetos terminadores
    1. Quando os grilos não forem mais necessários para reprodução ou uso experimental, siga o passo 2.2.17.
    2. Quando os grilos estiverem mortos, remova a gaiola do congelador. Remova a tampa e transfira todos os materiais contidos para um recipiente de resíduos autoclavável. Transfira os resíduos de volta para o congelador até que o autoclaving.
    3. Mergulhe a gaiola vazia em uma solução de alvejante de 10% e deixe-a sentar por um mínimo de 5 minutos.
    4. Enxágue três 30 a gaiola com água fria da torneira para remover o resíduo de alvejante, com especial atenção aos canais na parte inferior do recipiente.

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Representative Results

Dados que demonstram a criação bem-sucedida do críquete desde a eclosão até os 65 dias de idade foram coletados durante um teste de alimentação em setembro de 2021. Os grilos foram cultivados a partir de ovos seguindo as etapas 1.1.1-2.6.1 desses protocolos, e seis gaiolas de réplica foram abastecidas com 24 grilos aleatórios de 22 dias de idade (terceira instar) seguindo o passo 2.7 acima. Grilos foram então criados em condições de sala ambiente; no entanto, devido a uma unidade de manuseio do ar defeituosa, a temperatura ambiente média foi de 25 ± 1 °C a 20% de umidade relativa do que os 27 °C sugeridos. A massa de críquete foi medida duas vezes por semana entre 22 e 65 dias após a eclosão. Os resultados deste experimento são descritos abaixo e são apresentados como meios de desvio padrão mais ou menos.

Os dados apresentados na Figura 1 e na Figura 2 representam as seis gaiolas de replicação administradas no feed padrão descrito neste protocolo. Grilos foram estocados de uma população com massa média de 21 ± 9 mgs. Ao final do experimento, a massa média de todos os grilos juvenis e adultos combinados foi de 0,724 g ± 0,190 g (Figura 1). Como G. bimaculatus é sexualmente dimórfico, também relatamos massa adulta por sexo. A relação sexual na colheita foi de 51% do sexo feminino. Dos 30 homens adultos presentes aos 65 dias de idade quando o experimento terminou, a massa média foi de 0,721 g ± 0,123 g. Das 58 mulheres adultas presentes aos 65 dias de idade, a massa média foi de 0,841 g ± 0,112 g (Figura 2). A sobrevivência entre meia e colheita foi de 89% e foi medida semanalmente por contagem total de todos os grilos individuais em todas as gaiolas. No dia 65, 68,2% de todos os grilos haviam atingido a estrela adulta (Figura 2).

Figure 1
Figura 1: Massa média de grilos individuais 22-65 dias após a eclosão. As barras representam quartis de massa média de críquete por gaiola, n = 6 gaiolas. Todos os grilos foram contados e pesavam 2x por semana, exceto em 1 semana do experimento, no qual foram pesados apenas uma vez. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Massa de críquete adulto por sexo no final do experimento. Grilos machos n = 30, grilos femininos n = 58. As barras representam quantidades de massa média; 'x' representa massa média de críquete por sexo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materiais suplementares: (1) Coir de Coco e Segurança Respiratória, (2) Remoção de material coir de coco, (3) Calibração da entrega de névoa, (4) Construção de tampas blindadas, (5) Estocagem experimental de gaiolas, (6) Grilos randomizador para gaiolas, (7) Métodos utilizados para análise de ração. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S1: Vista lateral da gaiola de críquete contendo arranjo correto de refugia de caixa de papelão, ração e coir de coco. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S2: Vista superior das placas de Petri contendo coir de coco e ração de críquete posicionadas no fundo da gaiola. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S3: Grilos sendo transferidos do fundo de uma gaiola para uma nova gaiola, inclinando-se lentamente como descrito nas etapas 2.2.11-2.2.13. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S4: Gaiolas contendo grilos posicionados em racks de criação iluminados. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Tabela Suplementar S1: (1) Análises nutricionais da alimentação comercial, (2) Lista de ingredientes de ração do fabricante. Clique aqui para baixar esta Tabela.

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Discussion

A simplicidade dessa abordagem para a criação de críquete pode beneficiar uma série de áreas de pesquisa e representa um modelo genérico para a criação de críquete bem-sucedida, facilmente adaptável a uma variedade de necessidades experimentais. Comparado a vários outros estudos de G. bimaculatus, o tamanho adulto do corpo individual é menor e a maturação é mais lenta14, o que atribuímos à temperatura de criação abaixo do ideal imposta a nós por circunstância. Os métodos descritos acima foram utilizados e refinados ao longo de 2 anos. Culturas robustas têm sido mantidas sem evidências de problemas às vezes observados na agricultura comercial de críquete, incluindo mortalidade generalizada de patógenos com sinais clínicos clássicos (por exemplo, liquefeição interna devido a densovírus em Acheta domesticus) ou canibalismo excessivo15. É provável que a falta de introduções de críquete após o estabelecimento da colônia reduziu consideravelmente a probabilidade de sobrecarga da doença.

Prevenir a aglomeração é importante para garantir a saúde do críquete. G . bimaculatus selvagem são solitários, e os machos defendem seus territórios através de exibições agressivas e lutando16. O cuidado em cativeiro bem-sucedido requer manter a densidade da colônia dentro de uma faixa apropriada para reduzir o comportamento antagônico e as respostas gerais ao estresse13. Isso é feito fornecendo grilos com abundante refúgio dentro da gaiola e diminuindo os estoques de reprodução de grilos para 150 indivíduos por gaiola de 29,3 L a 20 dias após a eclosão quando atingem um tamanho médio de 0,01 g, durante a terceira ou quarta instar juvenil. Esta densidade de criação é idêntica à usada nos ensaios de otimização de ração G. bimaculatus de Sorjonen et al.14. Uma consideração de particular relevância durante a transferência de grilos de um contêiner para outro é o alto grau de risco de fuga. Contenção secundária, movimentos controlados, preparação para prender fugitivos e vigilância são ferramentas cruciais para evitar a fuga de críquete durante este processo. Tais medidas refletem a designação do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos de Gryllus spp. grilos como potenciais pragas agrícolas, exigindo licenças federais e estaduais para criação nos Estados Unidos17.

Controles ambientais e qualidade da alimentação durante os estágios de ovo e ninfas precoces são importantes para a saúde de todas as culturas de críquete cativo, incluindo G. bimaculatus. Para colocar ovos viáveis, a fêmea G. bimaculatus requer um substrato úmido no qual oviposit18. Coir de coco é amplamente utilizado na indústria de produção de críquete comercial como um meio de oviposição. Esses métodos dependem do coir de coco umedecido com água DI como substrato tanto para oviposição quanto hidratação de grilos ao longo de seu ciclo de vida. Da mesma forma, o uso de toalhas de papel úmidas em gaiolas juvenis para absorver gotas de água em excesso e fornecer gradientes de umidade dentro do ambiente natal tem se mostrado altamente eficaz na redução do número de grilos de < de uma semana de idade sucumbindo à desidratação ou afogamento, como indicado pela presença ou ausência de grilos juvenis falecidos em fundos de gaiolas. A nutrição juvenil é conhecida por desempenhar um papel desaquente na previsão do desempenho de crescimento bem-sucedido nos grilos. Garantir que a alimentação completa fresca seja de um tamanho de partícula adequado para grilos de <0,01 g levará a uma maior sobrevivência, já que grilos mais jovens serão mais suscetíveis aos impactos da variabilidade na qualidade da alimentação19.

A ração de críquete comercialmente disponível usada neste estudo foi selecionada devido ao seu uso generalizado na indústria agrícola de críquete norte-americana. Primeiro, a partir de comunicações pessoais com três agricultores comerciais de críquete, dois no Centro-Oeste dos EUA e um no sul dos EUA, é claro que esta ração (Mazuri) é amplamente aplicada na indústria de insetos comestíveis até o momento. Os agricultores de críquete acham aceitável o desempenho desejável de crescimento, fecundidade, desenvolvimento e métricas de ganho de peso. Segundo, para técnicos encarregados de administrar ração para um grande número de grilos em ambientes de laboratório, utilizar uma ração pré-misturada em pó ao longo da vida útil dos insetos é conveniente. Em terceiro lugar, a demanda por proteínas é conhecida por ser um fator importante no desenvolvimento do críquete e, embora muitas outras necessidades nutricionais específicas para G. bimaculatus não sejam totalmente compreendidas, esta mistura pré-formulada contém uma porcentagem de proteína bruta, que se enquadra na faixa ideal relatada de 22%-30%14,20.

O espaço em incubadoras é muitas vezes limitado. As fazendas de críquete geralmente começam seus grilos iniciais em incubadoras e transferem estoques mais maduros para ambientes ao ar livre, onde sistemas de manuseio do ar em toda a instalação regulam a temperatura e a umidade. Por essas razões, esses métodos são projetados para emular tais arranjos em menor escala. Após 20 dias dentro da incubadora, a densidade é reduzida, e grilos são transferidos para tratamentos experimentais ou para condições ambientais para uso como criadouro. Quando os sistemas de manuseio do ar funcionam corretamente, a temperatura da instalação de criação deve ser de 27 ± 1 °C com umidade relativa entre 20% e 25%. Grilos têm acesso a ad libitum à água e alimentação. A ração referenciada ao longo desses métodos é mazuri cricket feed amplamente usado por agricultores de críquete na América do Norte. Para análise nutricional completa, consulte Tabela SuplementarS1.

De acordo com os métodos de Donoughe e Extavour (2016), a lã de algodão pode ser usada em vez de coir de coco como meio de oviposição ou como um material de invólucro no topo do coir para evitar que partículas de frass ou ração contaminem a superfície do meio de oviposição18. Recomendam que uma fina camada de algodão seja colocada sobre o substrato durante o período de oviposição e posteriormente removida uma vez que a oviposição esteja completa, juntamente com o frass e detritos acumulados. Embora os dados que medem o impacto da contaminação por substratos na viabilidade dos ovos ou no desenvolvimento do críquete não estejam disponíveis, os protocolos aqui descritos produzem resultados satisfatórios tanto na produção de grilos juvenis quanto no crescimento. Isso pode ser atribuível às qualidades antimicrobianas putativas do coir de coco e é motivo para futuras pesquisas na arena de produção de insetos comestíveis21.

Devido a um mau funcionamento da unidade que regula a temperatura da instalação de criação de grilos em que esses métodos foram desenvolvidos, o teste para o qual estamos relatando dados foi realizado a 25 °C a 20% de umidade relativa, o que é 2° mais frio do que esses protocolos ditam. Além disso, essas pesquisas baseadas em ração estreitamente visam resultar em disponibilidade limitada de dados sobre determinadas métricas de interesse, como fecundidade, respostas endócrinas, carga de patógenos e expressão genética. Uma vez que os grilos reprodutores estavam consistentemente produzindo ovos de críquete viáveis abundantes e a mortalidade juvenil foi observada como insignificante, os esforços foram focados principalmente na experimentação diretamente relevante para questões de pesquisa. Assim, este relatório oferece apenas relatos anedóticos dos impactos de desempenho de crescimento a longo prazo desses métodos em >10 gerações. Finalmente, o uso de materiais derivados de plantas, como coir e papelão em gaiolas experimentais, provavelmente leva à ingestão incidental por grilos. Isso é aceitável dentro da concepção desses estudos, mas pode comprometer a validade dos projetos de estudo onde os achados dependem de medições precisas da biomassa total ingerida.

O protocolo descrito aqui destina-se a ser básico e minucioso, com passos claros e fáceis de seguir para a criação de grilos visíveis em um ambiente de laboratório alimentado com uma alimentação padrão comercialmente disponível. Utilizar tal procedimento padronizado com limpeza ideal, densidade de estocagem e controles ambientais permite a manutenção de colônias de críquete uniformes e saudáveis a longo prazo; além disso, contribuirá para a crescente pesquisa sobre G. bimaculatus como um inseto comestível farmável com implicações para a saúde humana. Também pode ser útil para estudos sobre fisiologia de insetos, otimização de crescimento e genética.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Acknowledgments

O financiamento para este projeto foi possível através de subvenções internas da Universidade de Wisconsin-Madison. Sinceros agradecimentos a Kevin Bachhuber da Bachhuber Consulting Inc. pelo acesso ao seu guia inédito para a criação comercial de críquete e a Michael Bartlett Smith por sua ajuda no refino e solução de problemas desses métodos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
31-qt (29.3 L) Snap-lid tote bin with lid HOMZ 3430CLBL Used to house breeding stock
3-tier/12-tray Grow Light Stand Fischer Scientific NC1938548
50-gal (189.27L) tote bin with lid Sterilite #14796603 Used as secondary containment when handling crickets
50 mL polypropylene graduated cylinder Fischer Scientific S95171
7.5-qt (7.1 L) snap-lid tote bin with lid HOMZ 3410CLBL Used to house exprimental stock
Accuris 500 g x 0.01 g Balance Manufactured by Accuris, a subsidieary of Benchmark Scientific W3300-500 Purchased from Dot Scientific through University of Wisconsin system purchasing service "ShopUW+"
Ace Premier 1 Inch Flat Chip Brush Ace Hardware  #1803261
Bel-Art SP Scienceware deionized water wash bottle Fischer Scientific 03-421-160 
Bright aluminum window screen  Phifer UNSPSC# 11162108 Mesh size 18 x 16"
Clear Disposable Plastic Portion Cups 5.5 oz w/ lids Wal-Mart N/A
Deionized water
Diablo 4-4/8" x 13 TPI Ultra Fine Finish Bi-Metal Jigsaw Blade Home Depot #313114935
Egg Filler Flats-Paper, 12 x 12" Uline S-5189
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 100 x 15mm Fischer Scientific FB0875714
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 60 x 15mm Fischer Scientific FB0875713A
Georgia-Pacific Envision Brown Paper Towels Home Depot #205675843
Infinity Tough Guy high performance hot-melt glue sticks Infinity Bond Infinity IM-Tough-Guy-12
Mazuri Cricket Diet Land O' Lakes International SKU#  3002219-105
Stanley TimeIt Twin 2-outlet Grounded Mechanical 24 Hour Timer Wal-Mart N/A
Vermont Organics Reclamation Soil 11 lb Coir Block Home Depot #300679904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
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Tags

Biologia Edição 184 Entomofagia Inseto Comestível Cricket Gryllus Modelo Paurometabolous Métodos Rearing Standard Feed Density Orthoptera
Mantendo culturas laboratoriais de <em>Gryllus bimaculatus</em>, um modelo ortopéde versátil para agricultura de insetos e fisiologia de invertebrados
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Ventura, M. K., Stull, V. J., Paskewitz, S. M. Maintaining Laboratory Cultures of Gryllus bimaculatus, a Versatile Orthopteran Model for Insect Agriculture and Invertebrate Physiology. J. Vis. Exp. (184), e63277, doi:10.3791/63277 (2022).

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