Summary
神経ペプチドの質量分析特性評価は、配列、定量、および局在化情報を提供します。この最適化されたワークフローは、神経ペプチド研究だけでなく、他の内因性ペプチドにも有用です。ここで提供されるプロトコルは、LC-ESI-MS、MALDI-MS スポッティング、および MALDI-MS イメージングを使用した神経ペプチドのサンプル調製、MS 取得、MS 分析、およびデータベース生成について説明しています。
Abstract
神経ペプチドは、発生、生殖、食物摂取、外部ストレッサーへの応答など、ほぼすべての生理学的および行動的プロセスを調節するシグナル伝達分子です。しかし、神経ペプチドの生化学的メカニズムと完全な補完物、およびそれらの機能的役割については、ほとんど理解されていない。これらの内因性ペプチドの特性評価は、このクラスのシグナル伝達分子内の膨大な多様性によって妨げられている。さらに、神経ペプチドは、神経伝達物質の濃度よりも100倍〜1000倍低い濃度で生理活性であり、シナプス放出後に酵素分解を起こしやすい。質量分析(MS)は、 先験的な 包括的な知識がなくても分析物を同定、定量、局在化できる高感度分析ツールです。これは、神経ペプチドをグローバルにプロファイリングし、新規ペプチドの発見を支援するのに適しています。このクラスのペプチドの豊富さと化学的多様性が低いため、いくつかのサンプル調製方法、MS取得パラメータ、およびデータ分析戦略がプロテオミクス技術から適応され、最適な神経ペプチド特性評価が可能になりました。ここでは、液体クロマトグラフィー(LC)-MSおよびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)-MSを使用して、配列特性評価、定量、および局在化のために、複雑な生物学的組織から神経ペプチドを単離するための方法について説明する。青いカニから神経ペプチドデータベースを調製するためのプロトコルには、包括的なゲノム情報を持たない生物であるCallinectes sapidusが含まれている。これらのワークフローは、様々な器具を用いて、異なる種の内因性ペプチドの他のクラスを研究するために適合させることができる。
Introduction
神経系は複雑であり、生物全体に信号を伝達するためにニューロンのネットワークを必要とする。神経系は感覚情報と生物学的反応を調整します。シグナル伝達に関与する複雑で複雑な相互作用は、神経伝達物質、ステロイド、および神経ペプチドなどの多くの異なるシグナル伝達分子を必要とする。神経ペプチドは、ストレスおよび他の刺激に対する生理学的応答を活性化する上で重要な役割を果たす最も多様で強力なシグナル伝達分子であるため、これらの生理学的プロセスにおけるそれらの特異的役割を決定することは興味深い。神経ペプチドの機能は、移動度、受容体相互作用、および親和性を決定するアミノ酸構造に関連しています1。神経ペプチドの構造と機能を調べるために、神経ペプチドが組織の異なる領域で合成、保存、放出され得るため重要である組織化学、および電気生理学などの技術が採用されてきた2,3,4が、これらの方法は、神経ペプチドの膨大な配列多様性を解明するためのスループットおよび特異性によって制限されている。
質量分析(MS)は、神経ペプチドの構造と存在量のハイスループット分析を可能にします。これは、さまざまなMS技術、最も一般的には液体クロマトグラフィー - エレクトロスプレーイオン化MS(LC-ESI-MS)5およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化MS(MALDI-MS)6を介して行うことができる。高精度の質量測定とMSフラグメンテーションを利用して、MSは、先験的な知識なしに複雑な混合物からの神経ペプチドにアミノ酸配列および翻訳後修飾(PTM)ステータスを割り当てる能力を提供し、その機能を確認するのに役立ちます7,8。定性的な情報に加えて、MSは標識フリー定量(LFQ)または同位体または等圧標識などの標識ベースの方法を通じて神経ペプチドの定量情報を可能にします9。LFQの主な利点には、そのシンプルさ、分析の低コスト、サンプル損失を最小限に抑えることができるサンプル調製ステップの削減が含まれます。しかし、LFQの欠点は、実行ごとの変動性からの定量的誤差に対処するために複数の技術的反復を必要とするため、計測器の時間コストの増加です。これはまた、小さな変動を正確に定量化する能力の低下にもつながる。標識ベースの方法は、複数のサンプルをさまざまな安定同位体を使用して差動的に標識し、1つのサンプルに結合し、質量分析によって同時に分析できるため、系統的な変動が少なくなります。これによりスループットも向上しますが、同位体標識は合成や購入に時間とコストがかかる可能性があります。フルスキャンマススペクトル(MS1)スペクトルの複雑さも多重化が増加するにつれて増加し、断片化して同定することができるユニークな神経ペプチドの数が減少する。逆に、等圧標識はMS1レベルでスペクトルの複雑さを増大させませんが、神経ペプチドなどの低存在量の分析物には課題をもたらします。等圧定量はフラグメントイオン質量スペクトル(MS2)レベルで行われるため、より豊富なマトリックス成分がフラグメンテーションのために選択され得るので、存在量の低い神経ペプチドは定量することができず、選択されたものは定量されるのに十分な存在量を有しない可能性がある。同位体標識により、同定されたすべてのペプチドに対して定量を行うことができます。
同定および定量化に加えて、局在化情報は、MALDI−MSイメージング(MALDI−MSI)10を介してMSによって得ることができる。サンプル表面を横切ってレーザーをラスタリングすることにより、MSスペクトルを各 m/z 値のヒートマップ画像にコンパイルすることができます。条件全体にわたる異なる領域における一過性ニューロペプチドシグナル強度のマッピングは、機能決定のための貴重な情報を提供することができる11。神経ペプチドの局在化は、神経ペプチドの機能が位置12によって異なる可能性があるため、特に重要である。
神経ペプチドは、神経伝達物質などの他のシグナル伝達分子よりもインビボで存在量が少なく、したがって検出には高感度な方法が必要である13。これは、脂質11、14などのより存在量の多いマトリックス成分の除去によって達成することができる。神経ペプチドの分析のための追加の考慮事項は、主にほとんどのneuropeptidomic分析が酵素消化を省略しているため、一般的なプロテオミクスワークフローと比較すると、行う必要があります。これは、ほとんどがプロテオミクスデータとペプチド検出によって知らされたタンパク質一致に基づくアルゴリズムで構築されたため、神経ペプチドデータ分析のためのソフトウェアオプションを制限します。しかし、PEAKS15などの多くのソフトウェアは、de novoシーケンシング機能により、神経ペプチド分析に適しています。抽出法からMSデータ解析までの神経ペプチドの解析には、いくつかの要因を考慮する必要があります。
ここで説明するプロトコルには、LC-ESI-MS、MALDI-MS、およびMALDI-MSIによる神経ペプチドのサンプル調製およびジメチル同位体標識、データ取得、およびデータ分析のための方法が含まれる。いくつかの実験からの代表的な結果を通して、青いカニ、 カリネクテス・サピドゥスからの神経ペプチドを同定、定量、および局在化するこれらの方法の有用性および能力が実証される。神経系をよりよく理解するために、モデル系が一般的に使用される。多くの生物は、完全に配列決定されたゲノムを利用可能にしていないため、ペプチドレベルでの包括的な神経ペプチドの発見を妨げている。この課題を軽減するために、完全なゲノム情報を持たない生物のデータベースを生成するための新規神経ペプチドおよびトランスクリプトームマイニングを同定するためのプロトコルが含まれる。ここで提示されるすべてのプロトコールは、任意の種からの神経ペプチドサンプルに対して最適化することができ、また、任意の内因性ペプチドの分析に適用することができる。
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Protocol
記載された全ての組織サンプリングは、ウィスコンシン大学マディソン校ガイドラインに準拠して実施した。
1. 神経ペプチドのLC-ESI-MS解析
- ニューロペプチドの抽出と脱塩
- 組織取得に先立って、16に記載のように酸性化メタノール(acMeOH)(90:9:1 MeOH:水:酢酸)を調製する。
- 甲殻類17 から脳組織を採取し、鉗子を用いて、20μLのacMeOHを含む0.6mLチューブにそれぞれ1つの組織を直ちに配置する。
注:組織解剖プロトコルは、動物や組織タイプによって大きく異なります。読者は、甲殻類から脳組織および複数の他の組織タイプを解剖する方法に関する詳細な説明のためにプロトコル17 を参照される。サンプルは、使用時まで-80°Cで保存することができます(理想的には6ヶ月以内)。記載されているボリュームは、 Callinectes sapidusの単一の脳に使用されます。体積は、組織サイズに合わせてスケーリングする必要があります。組織は溶媒なしで直ちにフラッシュ凍結され得るが、これは内因性タンパク質分解酵素が阻害されず、活性を維持するので推奨されないが、寒いときは遅い速度で。 - サンプルに150 μLのacMeOHを加える。超音波ホモジナイザーで合計超音波処理時間を24秒、パルス時間を8秒、一時停止時間を15秒に設定し、振幅を50%に設定し、氷上でサンプルを均質化します。
メモ:利用可能な異なる均質化システムがあります。サンプルの種類や設備に合わせて設定や条件を調整します。 - サンプルを4 °C で 20,000 x g で 20 分間遠心分離します。ピペットで上清をチューブに移し、約35°Cの真空濃縮器(266 x g、1 x 10-4 Torr)で乾燥させます。
注:乾燥したサンプルは、使用時まで(理想的には6ヶ月以内に)-80°Cで保存することができます。真空濃縮器の加熱は注意して行わなければなりません。熱は乾燥時間を短縮しますが、ペプチドの分解を最小限に抑えるために、すべての液体が蒸発した直後にサンプルを濃縮器から取り除かなければなりません。これを避けるために、加熱は、これおよび後続のすべてのステップから省略されてもよい。 - 脱塩のために、抽出された組織サンプルを20μLの0.1%ギ酸(FA)で再構成し、よくボルテックスし、室温の水浴中で1分間超音波処理する。
注:利用可能な脱塩材料は異なります。樹脂の同一性およびニューロペプチド量に応じて溶液および体積を調整する。全ペプチド量は、市販のペプチド定量アッセイ( 材料表を参照のこと)を用いて推定することができる。 - 0.5 μLのサンプルをpHストリップに塗布し、pHが4<ことを確認します。pHが高い場合は、pHが4になるまで10%FAのアリコートを1μL加<ます。
- 脱塩のための製造業者のプロトコルに従ってください18.100 μL の 50% アセトニトリル (ACN) を含む湿潤溶液、100 μL の 0.1% FA を含む平衡化溶液、100 μL の 0.1% FA を含む洗浄溶液、および 20 μL の 25% ACN/0.1% FA、20 μL の 50% ACN/0.1% FA、および 20 μL の 75% ACN/0.1% FA を含む溶出溶液を調製します。
- C18樹脂で10 μLの脱塩チップを取得します( 材料表を参照)。
- 脱塩チップを 15 μL に設定した 20 μL ピペットの上に置きます。脱塩チップが濡れたら、ピペットが廃棄されるまで溶液がなくなったときにピペットを押し下げておくことで、空気が通過するのを防ぎます。
- 先端3xを湿潤溶液で、3xを平衡化溶液で吸引する。試料10xを吸引し、続いて洗浄液で3xを洗浄し、各洗浄液を廃棄する。ACNを増加させる順にそれぞれの溶出溶液中で10倍吸引して溶出する。
注:溶出画分は、分離しておくことも、さらなる分析のために組み合わせることもできます。 - 使用済みの脱塩チップを捨て、溶出した神経ペプチドを真空濃縮器(266 x g、1 x 10-4 Torr)で約35°Cで乾燥させた。
注:これは、使用時まで-80°Cで保存することができます(理想的には6ヶ月以内)。
- 組織抽出物中の神経ペプチドの同位体標識
メモ: このステップはオプションであり、定量が必要な場合にのみ使用されます。- ヒュームフード内の2-プレックス同位体ジメチル標識溶液を調製する:1%CH2OH2(ストック37重量/重量百分率(重量%)の13.5μLの水)、1%CH2OD2(ストック25μLのストック475μLの水中の20重量%溶液)、および0.03Mボランピリジン(996.25μLの水中のストック8M溶液の3.75μL)。
警告:ホルムアルデヒドは有毒であるため、すべての溶液は換気されたフードに保管してください。手袋、白衣、目の保護具、不浸透性の履物を着用してください。コンタクトレンズは、この材料で作業するときに着用しないでください。
注:異なる同位体試薬があります。サンプルの種類と必要なラベリングチャンネルの数に基づいて適切なものを選択します。 - 粗神経ペプチド抽出物を10μLの水に溶解し、10分間超音波処理する。
- 定量的に測定される各異なる実験条件に、異なる同位体ホルムアルデヒド溶液(すなわち、CH2OH2、CH2OD2など)を10μL加える。渦がよく混合するように、各サンプルを2,000 x gで短時間遠心分離する。
- 各サンプル管に10 μLの0.03 Mボランピリジンを加える。渦がよく混合するように、各サンプルを2,000 x gで短時間遠心分離する。
- サンプルを水浴中で37°Cで15分間インキュベートする。
- サンプルを水浴から取り出し、10 μLの100 mM炭酸水素アンモニウムを加えます。渦がよく混合するように、各サンプルを2,000 x gで短時間遠心分離する。
- 標識したサンプルを1つの2-plexサンプルに結合し、神経ペプチドを真空濃縮器(266 x g、1 x 10-4 Torr)で約35°Cで乾燥させます。
- 標識された神経ペプチドを脱塩するには、手順1.1.5~1.1.10を繰り返して行い、データ取得の準備が整うまで保存します。
- ヒュームフード内の2-プレックス同位体ジメチル標識溶液を調製する:1%CH2OH2(ストック37重量/重量百分率(重量%)の13.5μLの水)、1%CH2OD2(ストック25μLのストック475μLの水中の20重量%溶液)、および0.03Mボランピリジン(996.25μLの水中のストック8M溶液の3.75μL)。
- データ集録
- 乾燥した脱塩ニューロペプチドを12μLの3%ACN/0.1%FAで再構成し、よくボルテックスし、37°Cの水浴中で超音波処理を1分間行い、2,000 x gで短時間遠心分離する。各サンプルをオートサンプラーバイアルに移します。
注: ニューロペプチド量に応じてサンプル量を μL あたり約 1 μg のペプチド濃度に調整します。総ペプチド量は、市販のペプチド定量アッセイ ( 材料表を参照) を使用して見積もることができます。 - オートサンプラーを使用して、1 μL のサンプルを高分解能ナノ LC-MS/MS 装置に注入します ( 材料表を参照)。
- 水中の 0.1% FA を移動相 A として、ACN で 0.1% FA を移動相 B としてサンプルを実行するには、長さ約 15 cm の逆相 (RP) C18 列 ( 材料表を参照) を使用します。B の勾配が 3% ~ 95% のサンプルを 300 nL/分の速度で 11 分間以上実行します。
- ここで使用するMS装置は、スプレー電圧に2.00kV、キャピラリー温度に275°Cの一般的なMS条件を使用してください。
- 分解能60,000、自動ゲイン制御(AGC)ターゲット1 x 106、最大イオン注入時間(IT)150msで、200~2,000m/zの範囲のMSスペクトルを取得します。
- 正規化された衝突エネルギー 30、分離窓 2.0 m/z、分解能 15,000、AGC ターゲット 2 x 105、最大 IT 250 ms を使用して、高エネルギー衝突解離 (HCD) フラグメンテーションのために、最も強度の高い15 個のイオン (最小強度 3.2 x 104) を選択します。
- 動的除外ウィンドウを 30 秒に設定します。電荷が1または≥8のイオンおよび電荷状態が認識されないイオンを除外する。
- 乾燥した脱塩ニューロペプチドを12μLの3%ACN/0.1%FAで再構成し、よくボルテックスし、37°Cの水浴中で超音波処理を1分間行い、2,000 x gで短時間遠心分離する。各サンプルをオートサンプラーバイアルに移します。
- 神経ペプチドの同定と定量
注:データベース検索とペプチド定量のための多くのソフトウェア(オープンソースと商用の両方)が利用可能です。ここでは、PEAKS Studio(プロテオミクスソフトウェア)15 を使用します。- 1.4.2 ~ 1.4.6 で概説されている手順を使用してデータベース検索を実行します。
- 新しいプロジェクトを作成し、LC-MS データを追加し、酵素の場合は None を選択し、機器には Orbitrap 、フラグメントの場合は HCD 、集録にはデータ依存取得 (DDA) を選択します。
メモ: データ集録パラメータに基づいて適切なパラメータを選択します。 - [ 識別 ] を選択し、[前駆体の 修正 [DDA ] と [質量のみ] を選択します。
- データベース検索を選択し、前駆体質量にモノアイソトピック質量、フラグメントイオン質量に0.02Da、酵素タイプになし、消化モードに非特異的、最大欠落切断に100、ペプチドあたりの最大許容可変PTMが3の次の可変PTMを使用して、エラー許容を20.0ppmに設定します:アミド化、酸化(M)、Eからのパイログル、 Qからのパイログル。
- ニューロペプチドデータベースを選択し、おとり融合による偽発見率(FDR)を推定する。
メモ: 質量公差誤差は、収集されたデータと一致するように調整する必要があります。サンプル・タイプに適したデータベースを使用します。酵素が選択されていない場合、最大欠落切断パラメータは検索には影響しません。ただし、ソフトウェアにオプションとして [未指定] ダイジェスト モードがない場合は、多数の切断の欠落が必要です。 - ラベルフリーの定量が必要な場合は、[ 定量] を選択し、[ ラベルフリー ] を選択して、誤差許容値を 20.0 ppm、 保持時間許容値を 1.0 分に設定します。
- 同位体標識のための工程1.2が行われた場合は前駆体イオン定量を行う。
- 「定量」を選択し、「前駆体イオン定量」を選択し、保持時間範囲 1.0 分を使用し、FDR しきい値 1% を使用します。
- プリセットまたはカスタム定量方法を [方法の選択] ドロップダウン メニューから選択します。
- 新しいカスタムメソッドを作成するには、「 ウィンドウ>構成」>「Qメソッド>新規ラベル付け」をクリックします。新しい方法に名前を付け、[方法の種類] で [ 前駆体イオン定量] を選択します。「 行の追加」 を選択し、「PTM オプション」リストから「変更」を選択します。
- LC-MSデータを追加し、実験の対照条件から神経ペプチドに対する修飾となる 参照条件 を選択する。
- 手順 1.4.9 ~ 1.4.11 の説明に従って検索結果を評価します。
- -10lgP ≥ 20 のペプチドとタンパク質の [概要] タブで結果をフィルター処理し、 1 つの 一意のペプチド≥選択し、[ 有意なペプチド] とラベル付けされたボックスを選択します。
- データベース検索結果を評価します (ここで、Protein.csv は神経ペプチドの同定を表し、Peptide.csv は神経ペプチドフラグメントの同定を表します。
- データベース検索で、タンパク質およびペプチドのスコア、質量精度、および配列カバレッジを調べます。
メモ: 各データベース検索ソフトウェアは固有のスコアリングアルゴリズムを使用するため、それに応じて評価が必要な場合があります。同定は、完全なフラグメントイオン系列を含む同定されたペプチドについて観察されたスペクトルを手動で検査することによって評価することができる。
2. 神経ペプチドのMALDI−MSスポッティング解析
- サンプル調製
- 定量が必要な場合は、ステップ1.1またはステップ1.1~1.2に従い、ステップ1.2.8を除きます(MALDI-MS分析の前に同位体標識後の脱塩は必要ありません)。
- 乾燥した脱塩ニューロペプチドを5μLの0.1%FA中で再構成し、よくボルテックスし、超音波処理物を37°Cの水浴中で1分間、2,000 x gで短時間遠心分離する。
- 甲殻類組織における神経ペプチドのスポッティングのために、マトリックスとして50%メタノール(MeOH)/ 0.1%FA(v / v)中に150mg / mLの2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)を調製する。
- 疎水性フィルム上にサンプルの3 μLの液滴をピペット( 材料表を参照)し、サンプル液滴上にマトリックスのピペット3 μLを直接置きます。ピペットを上下にして混ぜる。
- 1:1サンプルのピペット1 μL:MALDIステンレス鋼ターゲットプレートのウェルへのマトリックス混合物。ピペットチップを使用して、各混合物をサンプルウェルの端に広げます。サンプルは、均一な分布を容易にするために、ウェル彫刻のエッジに触れる必要があります(図4A)。
- 1:1 キャリバーント:マトリックス混合物(市販またはカスタム校正ミックス、ポリマー材料(MeOHに溶解した赤リン)、または一般的なマトリックスクラスターイオン)12 をサンプル近くのウェルに1 μLスポットします。
注:赤リンは、斑点を見つける前にマトリックスと混合する必要はありません。
- データ集録
- 乾燥したサンプルスポットを含むターゲットプレートをMALDIタンデム飛行時間(TOF/TOF)機器に挿入します( 材料表を参照)。
- DHBマトリックスの場合、レーザー出力を 95%に設定し、 自動最適検出器ゲイン、および スマート - 完全なサンプルサンプル キャリア移動モードを選択します。200~3200 m/z の範囲のMSスペクトルを取得し、各スポットから複数のスペクトルを一緒に追加して、神経ペプチドの信号対雑音比を高めます。
メモ:レーザー出力、検出器ゲインの割合を最適化し、適切なサンプルキャリア移動モードを選択して、すべての集録がスポット全体をほぼカバーし、その後の集録が前の位置に進まないようにします。 - 機器を校正します。
注:所望の神経ペプチド範囲を包含するように質量範囲を調整してください。
- データ解析
- データ解析ソフトウェア( 材料表を参照)でMALDI-MSファイルを開き、ここで使用するソフトウェアの ベースライン減算 をクリックします。
- ピークピッキングを実行するには、[ マスリストを検索]をクリックします。ピークが少なすぎる場合は、「マスリストを編集」を選択してマスリストを手動で編集し、スペクトル内のピークをクリックして マスリスト に追加します。
- 質量リストを[M+H]+ m/z 値を含むニューロペプチドデータベースと比較することにより、正確な質量マッチングを実行します(200ppm誤差±)。
注: [M+K]+、[M+Na]+、および [M+NH4]+ などの一般的な塩付加物も、正確な質量一致ターゲット リストに含める必要があります。 - 同定されたピークを検証するには、目的の m/z のリストを生成し、MS/MS実験を実行します。
3. 神経ペプチドのMALDI−MSイメージング解析
- サンプル調製
メモ: 切片化するには薄すぎる組織には、埋め込みおよび切片化の手順は必要ありません。- クライオスタットカップの半分にゼラチン(37°C、脱イオン水で100mg/mL)を入れ、室温で固化させます。残った液体ゼラチンを37°Cの水浴中で温かく保ちます。
- 動物から所望のニューロン組織を収集し、鉗子を使用して、脱イオン水を含む0.6mLチューブに組織を直ちに1秒間浸漬する。
注: ニューロン組織郭清については、ステップ 1.1.2 注 を参照してください。 - 固体ゼラチンの上に組織を置き、クライオスタットカップの残りの部分を液体ゼラチンで満たします。鉗子を使用して組織を配置します。
- クライオスタット カップを平らな面に置き、ドライアイスで凍らせます。
注:使用時まで-80°Cでサンプルを保管してください(理想的には6ヶ月以内)。 - 切片作製のために、ゼラチン包埋サンプルをクライオスタットモールドから分離し、モールドを切断する。
- 1mLの脱イオン水の液滴をチャックにピペッティングし、直ちに埋め込み組織を液滴に押し付けることによって、埋め込み組織をクライオスタットチャック上に取り付ける。
- 凍結したら、組織の周りにさらに脱イオン水をピペットで留め、さらにチャックに固定する。これらの手順は、-20 °C に設定したクライオスタット ボックス ( 材料表を参照) 内で実行します。
- 組織を1つの細胞のおおよその厚さ(サンプルの種類に応じて8〜20μm)で切断し、スライドの片側をセクションの近くに置き、スライドの反対側に指を置いてガラスをゆっくりと温め、セクションがスライドにくっつくようにすることによって、各セクションをインジウムスズ酸化物(ITO)コーティングされたスライドガラスにマウントして解凍します。
注:組織切片は、ゼラチンの一方の端をピンセットで拾い上げ(-20°Cに冷やし)、ITOコーティングされたスライドガラスの上に置き、スライドの反対側に指を置いてガラスをゆっくりと温め、セクションがスライドにくっつくようにすることによって、解凍して取り付けることもできます。 - 疎水性ペンを使用して組織切片の近くに小さな円を描き、その円の内側にキャリブラントを配置して、キャリブラントとして使用するサンプルを見つけます(キャリブラントのオプションについてはステップ2.1.6を参照)。
- スライドの各角にホワイトアウト ペンのマークを付け、ティーチ ポイントとして使用する鋭いエッジ (つまり、x) を含む小さな図形を付けます。
- スライドガラスをMALDIスライドアダプタプレートに入れ、スキャナを使用して高解像度(≥2400 DPI)の光学画像スキャンを行います。
- 自動噴霧器を使用して組織断面にマトリックスをスプレーします(噴霧器の詳細と手順については 、材料表 を参照してください)。
- 甲殻類組織中の神経ペプチドのMSIについては、マトリックスとして50%メタノール/0.1%FA(v/v)中の40mg/mL DHBを使用し、ノズル温度を80°C、速度を1,250mm/min、流量を0.1mL/min、パス数を12、各パス間に30秒設定して自動噴霧器とした。
- データ集録
- マトリックスを噴霧した解凍マウント組織切片を含む完全に乾燥したターゲットプレートを挿入する。
- MS イメージング取得ファイルのパラメータを設定して、レーザーの直径がラスターのステップ サイズより小さくなるようにします。
- スキャンした光学画像をロードし、xティーチポイントを使用してサンプルプレートを校正します。実際の組織切片よりもわずかに大きい測定対象の組織領域を定義して、マトリックスのみを含む領域も含むようにします。
- 機器を校正し、200 ~ 3200 m/z の範囲のスペクトルを取得します。所望の神経ペプチド範囲を包含するように質量範囲を調整する。
- データ解析
- データを処理するには、MSイメージングデータセットを目的のソフトウェアにインポートし、ベースライン除去アルゴリズムを選択し、 総イオン数を使用してデータを正規化します。
注: 中央値、二乗平均平方根 (RMS) 値、参照 m/z 値の強度など、さまざまな正規化アルゴリズムを選択すると、多くの m/z 値の空間分布が変わる可能性があります。目的の分析物に最も適した正規化アルゴリズムを選択します。 - 理論上のピークリストから各m / z値の画像を生成するには、神経ペプチド[M + H]+、[M + Na]+、[M + NH4]+などを含むカンマ区切り値(CSV)ファイルをアップロードします。m/z 値を取得するには、「ファイル」>「ピーク・リスト>インポート」をクリックします。ピーク リストに名前を付けます。
- 適切なppm誤差閾値を推定するには、まずMSスペクトル中のニューロペプチドピークを手動で同定し、それをニューロペプチド理論質量と比較します。ppm 誤差を計算し、「 ファイル>ファイルのプロパティ」>「間隔幅 」および「入力 ppm 誤差」をクリックします。
- ドロップダウンメニューからピークリストを選択し、「 ピークリストの間隔ごとにm /z イメージを作成」をクリックします。
- 各 m/ z 画像 のスクリーンショットを保存をクリックして、各 m/z 画像を保存します。
注:推定神経ペプチド同定は、分析物シグナルが組織内にのみ局在し、周囲のマトリックスには局在しない m / z 画像を同定することによって行うことができる。 - ピークの同一性を検証するには、目的の m/z のリストを生成し、MS/MS実験を実行します。
- データを処理するには、MSイメージングデータセットを目的のソフトウェアにインポートし、ベースライン除去アルゴリズムを選択し、 総イオン数を使用してデータを正規化します。
4. de novo シーケンシングを用いた新規推定神経ペプチドの発見
- 手順 1.4.2 ~ 1.4.5 を実行します。
- PEAKSソフトウェアからde novoのみのペプチドをエクスポートし.csv平均ローカル信頼度(ALC)スコア は≥75です。
注: de novo シーケンシングを実行するために使用できるソフトウェアは多数あり、それぞれに独自のスコアリングアルゴリズムがあり、それに応じて評価する必要があります。 - 特定の神経ペプチドファミリー19に属する神経ペプチドを示す既知の配列モチーフについてペプチドリストを検索する。
注:モチーフは種を超えて一般的によく保存されていますが、検索されたモチーフはサンプル生物を考慮して選択する必要があります。
5. 予測された神経ペプチド配列のトランスクリプトームマイニング
注: このステップはオプションであり、既存のニューロペプチドデータベースへの追加または新しいニューロペプチドデータベースの構築にのみ使用されます。
- 目的の既知のプレプロホルモンアミノ酸配列を選択し、tBLASTn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE を使用する
_TYPE=ブラスト検索&SHOW_DEFAULTS=オン&リンク
_LOC=blasthome) を使用して、nr/nt、Refseq_genomes、EST、TSA などのデータベースに対してクエリ プレプロホルモン配列を検索します。
注: タンパク質データベースに対してクエリ配列を検索するには、BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE を使用します。
_TYPE=ブラストサーチ&SHOW_DEFAULTS=オン&ブラスト
_SPEC=&LINK_LOC=ブラストタブ&LAST_PAGE=トブラストn)。- ターゲット生物 (税 ID) を選択し、[ 期待しきい値] アルゴリズム パラメーターを 1000 に変更して、低スコアのアライメントを含めます。
- BLASTプログラムを実行し、有意なアライメントを生成するクエリ配列と被験者配列の間で高い相同性スコアがないか結果を確認します。塩基配列を含むFASTAファイルを保存します。
注:類似の相同性スコアを有する複数の対象配列がある場合、推定配列20、21を絞り込むためにMAFFTアラインメントを実施する。
- Expasy Translationツールを使用して、プレプロホルモンヌクレオチド配列をプレプロホルモンペプチド配列 に翻訳する (https://web.expasy.org/translate/)。C. sapidusの場合、遺伝暗号として 無脊椎動物のミトコンドリア を選択します。
- SignalP(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP)を用いてペプチド配列中のシグナルペプチド配列およびプロホルモン切断部位を確認する。
注:既知のプレプロホルモンプロセシングスキームに対する相同性はまた、プロホルモン切断部位を同定するために使用され得る。シグナルペプチドに対する可能な翻訳後修飾は、所望により予測され得る。スルフィネーター(https://web.expasy.org/sulfinator/)は、チロシン残基の硫酸化状態を予測するために使用することができる。DiANNA(http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/)は、ジスルフィド結合結合の結合性を予測するために使用することができる。
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Representative Results
サンプル調製とMS分析のワークフローを 図1に示します。ニューロン組織の解剖後、均質化、抽出、および脱塩を行い、ニューロペプチドサンプルを精製する。同位体標識ベースの定量が必要な場合は、サンプルを標識し、再度脱塩します。得られたサンプルは、神経ペプチドの同定および定量のためにLC-MS/MSを介して分析されます。
プロテオミクスソフトウェアを介して同定された神経ペプチドは、良好なペプチド断片化配列カバレッジを有するべきであるが、これは世界的に定義または標準化されていない。絶対同定のためには、すべてのアミノ酸は、明確な同定および局在化を提供するフラグメントイオンを生成するべきである。これはまた、各フラグメントイオンの強度の確認のために合成ペプチドと比較しなければならない。すべての推定同定でこれを実行するためのコストは実現不可能であるため、同定は一般に、より観察されたフラグメントイオンがペプチド同定の信頼度を高める信頼度に基づいて記述される。図2A,Bは、100%の配列カバレッジと0.02Daの最大限界によって定義される低い質量誤差で同定された2つのニューロペプチドを描いていますが、図2Bのニューロペプチドについてのみ観察された(3つのイオンのみからの)断片化カバレッジが低いと、特定のアイソフォームの同定の信頼性が低下します。図2Cは、LFQに使用された2つのサンプルで検出されたニューロペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム(XIC)を、保持時間の関数として選択されたm/z値のシグナル強度を含むプロットである。神経ペプチドの保持時間は、2つの別々の連続した実行で同定されたため、わずかに異なります。ただし、その差は信頼できるしきい値の 1 分以内です。したがって、XICからのソフトウェア計算された曲線下面積との比が、この神経ペプチドのLFQに使用される。
ジメチル標識神経ペプチドの定量のために、MS1スペクトルは、理論上の神経ペプチドm/z値のピークと、使用する同位体標識試薬間の質量差に相関する質量シフトを伴うm/z値のピークを含むべきである。図2Dにおいて、この2-プレックスジメチル標識試料の質量シフトは4.025Daである。次に、XICからの前駆体イオンの曲線下面積がソフトウェアによって計算され、相対存在比を計算するために使用される。同定された神経ペプチドおよびそれらのLFQ比を含むプロテオミクスソフトウェア輸出表の簡略化されたバージョンを表1に示す。同位体標識された神経ペプチドについても同様の結果が得られる。
ソフトウェアアルゴリズムにより、スペクトルの de novo シーケンシングが可能になり、新規の推定神経ペプチドを検出できます。推定される新規神経ペプチドの検出を主張する場合、高い信頼度同定は、フラグメントイオン観察に基づいて、すべてのアミノ酸が明確に同定され、局在化する理想的なケースである。 図3 は、C末端に−RYamideモチーフを含む de novo 配列決定ペプチドのスペクトルを、甲殻類RYamideファミリー22の公知の神経ペプチドによって共有される保存された配列モチーフとして描写する。100%の配列カバレッジを有するデータベースからペプチドをマッチングし、観察されたすべてのアミノ酸形成フラグメントイオン、0.02Daの最大限界によって定義される低いフラグメントイオン質量誤差、およびガウス溶出プロファイルを含んでいた。これらの結果は、甲殻類-RYamide神経ペプチドファミリーに属する内因性ペプチドが観察されたことを示す。
MALDI-MSスポット測定は、LC-ESI-MS同定を補完する神経ペプチド同定を提供し、より高いスループット能力を提供することができます。粗組織ホモジネートが神経ペプチドについて抽出され、脱塩され、(所望により)標識された後、サンプルをマトリックスと混合し、 図4Aに示すようにMALDIステンレス鋼ターゲットプレート上にスポットすることができる。均質なサンプルスポットのピペッティングに成功すると、特にキャリブレーションスペクトル内で明確に分解されたピークが生成されます(図4B)。MALDI-TOF装置を使用する場合、各実験の開始時に装置を校正する必要があります。既知の質量を有する任意の分析種は、試料の所望の質量範囲内にある場合、装置を較正するために使用することができる。ここで、赤リンは、機器の正イオン質量校正に使用される。室温での安定性、安価なコスト、重合による豊富なピーク、高い信号対雑音比、およびイオン化のためのマトリックスを必要としないため、ペプチド校正ミックスを使用するよりも利点があります。
神経ペプチドのMALDI-MSイメージングでは、使用されるMALDI TOF/TOF装置は、光学画像をサンプルと相関させるためにITOコーティングされたスライドの手動画像校正(ステップ3.1.10)を必要とします。図5の 図 は、計測器がスキャンした光学画像を実際のサンプルプレートと相関させるためのティーチングポイントとして使用するホワイトアウト十字線の適切な配置を示しています。また、ITOコーティングされたスライドの、ユーザーが避けるべき領域(すなわち、サンプルまたはマトリックスを含まない)も示している。質量較正の場合、ITOコーティングされたスライド上の組織サンプルに対する較正サンプルスポットの配置は、飛行時間質量分析器の固有の性質による質量誤差に直接影響しますが、この問題の大きさはターゲット分析物の存在量に依存します。この問題の解決策は、ピークシフトの証拠について、異なる組織切片からのMS1スペクトルからのピークを手動でチェックすることです。ピークシフトがある場合は、各組織切片のすぐ隣にあるITOコーティングスライドに質量校正スポットを追加することを検討してください。そこから、ユーザーはキャリブレーションスポットからのスペクトルを一緒に平均化したり、組織セクションに最も近いキャリブレーションスポットのみを使用して一度に1つの組織セクションに対してMSイメージングを実行することができます。サンプルが収集されたら、推定神経ペプチド同定を割り当てる前に、神経ペプチドに対応する m/z 値からのシグナルが組織領域内にのみ局在していることを確認してください(図6)。
図1:質量分析分析のための神経ペプチドサンプル調製ワークフロー。 組織抽出分析のために、粗組織ホモジネートを脱塩し、安定同位体標識で標識し、再度脱塩し、MSで分析した。画像解析のために、インタクトな組織を包埋し、凍結切除し、マトリックスと共に塗布し、MALDI−MSIによって分析した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:プロテオミクスソフトウェアを介して行われた同定と定量。 神経ペプチドは、(A)良好または(B)不良なMS2フラグメンテーションカバレッジを有する範囲品質のスペクトルを介して検出される。フラグメントイオン質量マッチング誤差はスペクトルの下に示されている。(C)XICプロファイル形状および保持時間(RT)は、LFQを介して定量された神経ペプチドについて手動で検査することができる。(D)MS1スペクトルは、ジメチル標識神経ペプチドを検出および定量するために使用される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:新規神経ペプチド検出のための De novo シーケンシング。 (A)推定新規RYamideのMS2スペクトルは、各フラグメントの質量誤差が低く、良好なフラグメンテーションカバレッジを示しています。(B)同定されたフラグメントイオンは、手動検査のためにリストされる。(c)新規神経ペプチドのXICをガウスピーク形状について手動で検査する。省略形: RT = 保持時間。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:MALDI-MSスポットと較正スペクトル (A)MSスペクトルの品質は、MALDIステンレス鋼ターゲットウェル内の均一なマトリックス - ペプチド分布に依存する。左の3つのスポットは、井戸彫刻の端に触れる良いスポットの例であり、右の3つのスポットは悪いスポットの例です。両方のスポットは、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)マトリックスおよびペプチド標準混合物を含む。(B)500~3200m /zの赤リンクラスターを用いた校正スペクトル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ITOコーティングされたスライドガラスの描写。(A)重要な領域が記された回路図:組織切片を配置する場所(水色の長方形)、自動ティーチポイントを避けるべき場所(赤色の長方形)、ティーチポイントを描画できる場所の例(白い十字線)、およびネジがアダプタプレートに取り付けられて避けるべき場所(濃い青色の楕円形)。(b)2つの組織切片、較正ミックスを含むスポット、および十字痕を含むスライドガラスの写真。組織切片および較正スポットの位置は、スライドガラスの反対側に概説されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:C. sapidus 洞腺のMS画像。(A)HL/IGSL/IYRamide(m/z 844.48)、(B)アラトスタチンA型NPYAFGLアミドまたはGGPYAFGLアミド(m/z 780.40)、(C)アラトスタチンA型GQYAFGLアミド(m/z 754.39)、および(D)RFamideGRNFLRFamide(m/z 908.52)の神経ペプチド[M+H]+イオン分布画像が示されている。画像は、理論上のm/z値から±50ppmのウィンドウを使用して生成されます。カラーバーは、0 ~ 100% の信号強度の範囲を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表 1: データベース検索と LFQ の結果 LC-MSおよびプロテオミクスソフトウェアを介して同定および定量された神経ペプチド。同定されたPTMは、LFQについて両方のサンプルで検出されたペプチドの強度とともに、結果として生じるLFQ比とともにリストされる。FASTAファイルからの平均質量および観察された神経ペプチド記述がリストされている。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
神経系に見られる神経ペプチドおよび内因性ペプチドの正確な同定、定量、および局在化は、それらの機能を理解する上で極めて重要である23,24。質量分析は、完全に配列決定されたゲノムを持たない生物でも、これらすべてを達成できる強力な技術です。LC-ESI-およびMALDI-MSの組み合わせを介してC. sapidusから採取された組織から神経ペプチドを検出、定量、および局在化するこのプロトコルの能力が実証されている。
LC-ESI-MS分析のサンプル調製中に、考慮する必要があります。MSは高感度な技術ですが、ニューロン組織のペプチド濃度が低い(フェムトモル範囲25まで)ことは深刻な制限をもたらします。タンパク質や脂質などのより豊富で干渉的なマトリックス成分を除去するだけでなく、各ステップ26、27における神経ペプチドの損失を最小限に抑えるためにも、慎重なサンプル調製が必要である。例えば、ペプチド吸着に抵抗する微量遠心管を使用することにより、サンプル損失を低減することができる。関心のある組織の組成に応じて、様々な溶媒(抽出または沈殿用)または固相抽出材料の使用を、異なるサイズおよび化学的特性を有する生体分子を分離するために使用することができる。親水性または疎水性ペプチドがニューロペプチド抽出物中に存在することを確実にするために、複数の抽出溶媒系が、異なる物理化学的特性を有するニューロペプチドを標的化するために任意選択で使用され得る。これらは、プロテアーゼ阻害剤の使用とともに、神経ペプチド回収率28を改善するために最適化された精製のために修飾される必要があるかもしれない。複数の抽出システムを使用することの欠点は、全体的なより高いペプチド含量要件とスループットの低下を満たすために、いくつかのニューロン組織をプールする必要があることです。脱塩、同位体標識、MS注射などの多くのステップでは、特定の開始ペプチド量を推奨します。神経ペプチドなどの貴重なサンプルの特性評価では、ペプチドアッセイは一般に、無関係なペプチド消費を防ぐために避けられています。さらに、ペプチドアッセイは、内因性ペプチドとは異なる化学的特性を有するタンパク質消化物から正確なペプチド濃度を決定するために開発された。未知の神経ペプチド濃度による合併症を克服するために、プールされたニューロン組織抽出物を用いて初期ペプチドアッセイを行うことができ、そこでは、その結果がその後のすべての分析の推定値として使用されるが、溶液中のすべてのペプチドが測定され、これらのすべてが神経ペプチドではないことに留意しなければならない29。この方法の他の限界には、非極性および疎水性の神経ペプチドに対する潜在的なバイアス、および天然構造保存の欠如が含まれる。より疎水性である溶液の使用または有機溶媒の使用の省略などの溶媒組成物および材料に対する修飾は、これに対処するために行われ得る。
MALDI-MS測定は、一貫した結果を得るために慎重なサンプル調製ステップに依存しており、LC-ESI-MS測定とは異なるサンプル考慮事項を持つことができます。MS分析の前に神経ペプチド抽出物を氷上に保持するなどのステップは依然として適用される。ニューロペプチド分解を防止するさらなる方法は、解凍された装着組織切片を含むスライドガラスを解剖後に乾燥剤箱に保持して凝縮30を防止することを含むが、乾燥後に組織試料をデシケータ内に残すことは、同様に試料の分解をもたらし得る。マトリックス塗布の直前に、組織スライドを真空デシケーター(最終圧力:室温で1x10-4Torr)に5〜10分間置くことが推奨されます。マトリックスが組織スライド上に堆積した後、冷蔵庫または冷凍庫に一晩保管し、MALDI−MSイメージング測定の前に真空デシケーターで乾燥させることができる。MALDIスポット測定の場合、マトリックスペプチドの結晶構造は、たとえそう見えてもMALDIターゲット全体に均等に分布していません。このプロセスによる技術的反復による質量スペクトルの変動を緩和する方法があります。まず、複数のレーザーショット(通常は数百~数千)を使用して各ウェルから平均スペクトルを取得し、レーザーをウェル全体でランダムにラスタライズします(つまり、機器パラメータでSMARTまたはランダムサンプルキャリアの動きを選択します)。サンプルタイプごとに少なくとも5つの技術反復を取得し、目的のピークの信号強度の変動が最も低い3つの技術反復を選択します。ここでのトレードオフは実験的なスループットです。レーザーショット数、レーザー直径、その他の機器設定などのパラメータは、取得したすべてのスペクトルに対して一貫性を保つ必要があります。理想的には、すべての技術的反復と生物学的反復は、同じマトリックス溶液と機器校正を使用して同時に分析されます。神経ペプチド同定は、理論上の[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+K]+、および単独で荷電イオンm/z値を生成する他の塩付加物を含むピークリストへの正確な質量マッチングによって行うことができる。データの正規化は、MALDI-MS実験による体系的な成果物を最小限に抑えるために重要です。安定同位体標識(SIL)による神経ペプチド定量にMALDI−MSスポット測定を使用する場合、再現性の評価は特に重要である。サンプル調製およびデータ取得の品質は、ペプチド標準または神経ペプチド抽出物を採取し、それを2つの等しいアリコートに分割し、SILによって各サンプルを差動的に標識し、サンプルを分析して、対になったピークの相対強度が1:1であることを確認することによって評価することができる。これらの比率から報告された変動を使用して、ユーザーエラーに起因する実験全体の分散水準を推定できます。
MALDI−MSはまた、配列および定量的情報を提供することができることに注意することが重要です。しかしながら、MALDIによって典型的に生成される単独で荷電したイオンはペプチド断片の検出を制限し、完全な配列を得ることをより困難にし、LC-ESI-MSについて議論される定量方法を阻害する。それにもかかわらず、MALDI−MSは、高スループットのためのその能力、ならびに試料12、31内の塩および不純物に対するより高い耐性のために、魅力的なモダリティである。さらに、MALDI−MSイメージングは、抗体を必要とする他の従来のイメージング技術よりも利点を有する。ほとんどのMSモダリティでは、質量分解能を下げると感度が向上し、存在量の少ない神経ペプチドの検出が改善されます。この戦略は、各実験でMALDI機器を校正することが容易であるため、LC-ESI-MS機器よりもMALDI-TOF/TOF機器にとってより実用的かもしれません。MALDIがneuropeptidomicsにとって有利であり得るもう一つの方法は、スペクトル平均化によるものである。通常、LC-ESI-MS測定からのスペクトルの平均化は、LC分離の利点を否定するため、使用されません。したがって、バイオインフォマティクスソフトウェアは神経ペプチドの同定に大きく依存しており、同定は手動で検証されています。しかし、最初の分離がなかったため、MALDI−MS測定からのスペクトルの平均化の結果は少なくなります。したがって、生データは小さくなり、ユーザーが手動で調べやすくなります。データ管理の容易さは、ユーザーが神経ペプチドの同定および検証戦略にアプローチできる順序を変えるため、重要です。LC-ESI-MSによる神経ペプチド同定の信頼性は、データ解析ソフトウェア内の閾値ストリンジェンシーのレベルを上げることで恩恵を受ける可能性がありますが、この戦略はMALDI-MS同定に利益をもたらす可能性は低いです。甲殻類の神経ペプチドの例では、実験室で構築されたデータベースからのエントリが1000未満(すなわち、手動でスキャンする最大<1000のスペクトルピークまたはMS画像)があるという事実は、最初に寛大な質量誤差閾値でMALDI−MSデータをフィルタリングし、次いでMS1レベルで同位体エンベロープを調べることによってそれらの同定を手動で検証することを可能にする。 代表的な結果 のセクションで説明したその他の検証方法も同様です。一般的なMSイメージングデータ解析ソフトウェアは、神経ペプチド質量データベースへの正確な質量マッチングを実行し、対応するMS画像を抽出することができます。バイオマーカーの発見など、臨床に基づく研究課題の場合、これらのソフトウェアは、関心のある組織領域に固有の m / z 値(通常は関心領域(ROI)分析と呼ばれる)32 を抽出し、統計的テストを実行して2つの組織領域がどれほど異なるかを定量化することができます。また、MSイメージング用のデータ解析ソフトウェアのオプションがLC-ESI-MSよりも少ないことも注目に値します。
神経ペプチドのLC-ESI-MSデータベース検索を実行するには、一般に、消化ペプチドの分析用に構築されたソフトウェアアルゴリズムを使用する必要があります。そのため、ソフトウェアが非特異的酵素データベース検索を実行できるかどうか、または検索を完了するのにかかる時間には制限があります。現在、内因性ペプチド検索は、欠損切断の最大数で行われているが、この数は依然として限られており、潜在的に欠落した同定につながる。種のゲノムが完全に配列決定されていない場合、 C. sapidusと同様に、 de novo シーケンシングを実行して、既知の保存された神経ペプチド配列モチーフを介して未知の/新規の神経ペプチドを同定することができるが、この方法は未知のモチーフを有するか、または神経ペプチドファミリー識別子として使用されるモチーフを含まない神経ペプチドを同定することができない19。例えば、WSSMRGAWamideは、アラトスタチンB型神経ペプチドファミリー19のモチーフである。ここに、完全に解読されたゲノム配列を持たない種についての予測された神経ペプチド配列に対するトランスクリプトームマイニングの重要性がある33。次いで、推定ペプチド配列を合成し、合成ペプチドと生体組織からのMS/MSスペクトルを比較することによって、神経ペプチド同定が確認される34。配列が検証された後でさえ、それが完全な神経ペプチド配列であるか分解産物であるかは時々不明である。MALDIとESI-MSのイオン化源の違い(ESIはMALDIよりもソフトなイオン化方法である)は、異なる速度の人工分解(すなわち、ソース内の断片化)をもたらす可能性があることは注目に値します。ペプチドのトランケートされたバージョンと、人工的に誘導された(すなわち、 インビボではない)分解産物とを区別するために、そのニューロペプチドのプレプロホルモン処理経路が既知でなければならない。これはしばしば当てはまらないので、ペプチドの合成形態を生理学的アッセイに使用し、生物学的活性について検証すべきである。
全体として、神経ペプチド分析のためにここで例示したワークフローは、さまざまな異なる分野に利益をもたらすことができる。これは、ボトムアップまたはトップダウンMS分析によって通常分析されるタンパク質よりも小さい内因性ペプチドに最適化されているため、ペプチドのミドルダウンMS分析内の技術的なギャップを埋める。したがって、neuropeptidomicsによって利用されるサンプル調製方法は、抗菌特性のために薬効化学者によって標的とされるものなど、他の生理活性内因性ペプチドに大部分が翻訳可能であるべきである35。このプロトコルの利点は、一般的なベンダーの一般的な機器を利用して、翻訳可能性も向上させることです。このようにして、ワークフローは、医薬品候補または薬物標的のスクリーニングなどの学術的および商業的設定において使用することができる。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、米国国立科学財団(CHE-1710140およびCHE-2108223)および米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R01DK071801を通じて支援されました。A.P.は、NIH化学生物学界面トレーニング助成金(T32 GM008505)によって部分的に支援されました。N.V.Q.は、国立心肺血液研究所からウィスコンシン大学マディソン心臓血管研究センター(T32 HL007936)へのルース・L・キルシュシュタイン国立研究サービス賞の下で、国立衛生研究所によって部分的に支援されました。L.L.は、NIHの助成金R56 MH110215、S10RR029531、S10OD025084、ならびにウィスコンシン同窓会研究財団とウィスコンシン大学マディソン薬学部が提供する資金援助を受けて、ヴィラス特別業績教授職とチャールズメルボルンジョンソン教授職からの資金援助を認めたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde - D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge - 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac - SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) - Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
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