Summary
Nöropeptitlerin kütle spektrometrik karakterizasyonu sekans, kantitasyon ve lokalizasyon bilgileri sağlar. Bu optimize edilmiş iş akışı sadece nöropeptit çalışmaları için değil, aynı zamanda diğer endojen peptitler için de yararlıdır. Burada verilen protokoller, LC-ESI-MS, MALDI-MS lekeleme ve MALDI-MS görüntüleme kullanılarak nöropeptitlerin örnek hazırlama, MS edinimi, MS analizi ve veritabanı oluşturmayı açıklamaktadır.
Abstract
Nöropeptitler, gelişim, üreme, gıda alımı ve dış stresörlere yanıt gibi hemen hemen tüm fizyolojik ve davranışsal süreçleri düzenleyen sinyal molekülleridir. Bununla birlikte, nöropeptitlerin biyokimyasal mekanizmaları ve tam tamamlayıcısı ve fonksiyonel rolleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu endojen peptitlerin karakterizasyonu, bu sinyal molekülleri sınıfındaki muazzam çeşitlilik tarafından engellenir. Ek olarak, nöropeptitler, nörotransmitterlerinkinden 100x - 1000x daha düşük konsantrasyonlarda biyoaktiftir ve sinaptik salınımdan sonra enzimatik bozunmaya eğilimlidir. Kütle spektrometresi (MS), kapsamlı a priori bilgi olmadan analitleri tanımlayabilen, ölçebilen ve lokalize edebilen oldukça hassas bir analitik araçtır. Nöropeptitlerin küresel olarak profillenmesi ve yeni peptitlerin keşfine yardımcı olmak için çok uygundur. Bu peptit sınıfının düşük bolluğu ve yüksek kimyasal çeşitliliği nedeniyle, çeşitli numune hazırlama yöntemleri, MS edinme parametreleri ve veri analizi stratejileri, optimal nöropeptit karakterizasyonuna izin vermek için proteomik tekniklerden uyarlanmıştır. Burada, sıvı kromatografisi (LC)-MS ve matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyonu (MALDI)-MS kullanılarak sekans karakterizasyonu, kantitasyonu ve lokalizasyonu için nöropeptitleri karmaşık biyolojik dokulardan izole etmek için yöntemler tanımlanmıştır. Mavi yengeçten bir nöropeptit veritabanı hazırlamak için bir protokol, kapsamlı genomik bilgiye sahip olmayan bir organizma olan Callinectes sapidus dahil edilmiştir. Bu iş akışları, çeşitli aletler kullanılarak farklı türlerdeki diğer endojen peptit sınıflarını incelemek için uyarlanabilir.
Introduction
Sinir sistemi karmaşıktır ve bir organizma boyunca sinyalleri iletmek için bir nöron ağı gerektirir. Sinir sistemi duyusal bilgileri ve biyolojik tepkiyi koordine eder. Sinyal iletiminde yer alan karmaşık ve kıvrımlı etkileşimler, nörotransmiterler, steroidler ve nöropeptitler gibi birçok farklı sinyal molekülü gerektirir. Nöropeptitler, strese ve diğer uyaranlara karşı fizyolojik tepkileri aktive etmede kilit rol oynayan en çeşitli ve güçlü sinyal molekülleri olduğundan, bu fizyolojik süreçlerdeki spesifik rollerini belirlemek ilgi çekicidir. Nöropeptit fonksiyonu, hareketliliği, reseptör etkileşimini ve afinite1'i belirleyen amino asit yapıları ile ilgilidir. Nöropeptitler dokunun farklı bölgelerinde sentezlenebildiği, depolanabildiği ve salınabildiği için önemli olan histokimya ve elektrofizyoloji gibi teknikler, nöropeptit yapısını ve fonksiyonunu araştırmak için kullanılmıştır 2,3,4, ancak bu yöntemler nöropeptitlerin geniş dizi çeşitliliğini çözmek için verim ve özgüllük ile sınırlıdır.
Kütle spektrometresi (MS), nöropeptit yapısının ve bolluğunun yüksek verimli analizini sağlar. Bu, farklı MS teknikleriyle, en yaygın olarak sıvı kromatografi-elektrosprey iyonizasyon MS (LC-ESI-MS)5 ve matris yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon MS (MALDI-MS) 6 ile gerçekleştirilebilir. Yüksek hassasiyetli kütle ölçümleri ve MS parçalanması kullanan MS, fonksiyonlarını belirlemeye yardımcı olmak için a priori bilgi olmadan karmaşık karışımlardan nöropeptitlere amino asit dizisi ve post-translasyonel modifikasyon (PTM) durumu atama yeteneği sağlar 7,8. Nitel bilgilere ek olarak, MS, etiketsiz kantitasyon (LFQ) veya izotopik veya izobarik etiketleme9 gibi etiket tabanlı yöntemler yoluyla nöropeptitlerin nicel bilgisini sağlar. LFQ'nun başlıca avantajları arasında basitliği, düşük analiz maliyeti ve numune kaybını en aza indirebilecek daha az numune hazırlama adımları sayılabilir. Bununla birlikte, LFQ'nun dezavantajları, çalıştırmadan çalıştırmaya değişkenlikten kaynaklanan nicel hatayı ele almak için birden fazla teknik çoğaltma gerektirdiğinden, artan cihaz zaman maliyetlerini içerir. Bu aynı zamanda küçük varyasyonları doğru bir şekilde ölçme yeteneğinin azalmasına da yol açar. Etiket tabanlı yöntemler, birden fazla numune çeşitli kararlı izotoplar kullanılarak farklı şekilde etiketlenebildiği, tek bir numunede birleştirilebildiği ve aynı anda kütle spektrometresi ile analiz edilebildiği için daha az sistematik varyasyona tabi tutulur. Bu aynı zamanda verimi de artırır, ancak izotopik etiketlerin sentezlenmesi veya satın alınması zaman alıcı ve maliyetli olabilir. Tam tarama kütle spektrumu (MS1) spektral karmaşıklığı, çoklama arttıkça da artar, bu da parçalanabilen ve dolayısıyla tanımlanabilen benzersiz nöropeptitlerin sayısını azaltır. Tersine, izobarik etiketleme, MS1 seviyesinde spektral karmaşıklığı arttırmaz, ancak nöropeptitler gibi düşük bolluktaki analitler için zorluklar getirir. İzobarik kantitasyon, fragman iyon kütle spektrumu (MS2) seviyesinde gerçekleştirildiğinden, düşük bolluktaki nöropeptitler, parçalanma için daha bol miktarda matris bileşenleri seçilebileceğinden ve seçilenler nicelleştirilecek kadar yüksek bolluğa sahip olmayabileceğinden, nicelleştirilemeyebilir. İzotopik etiketleme ile, tanımlanan her peptid üzerinde kantitasyon yapılabilir.
Tanımlama ve nicelleştirmeye ek olarak, lokalizasyon bilgileri MS tarafından MALDI-MS görüntüleme (MALDI-MSI) yoluyla elde edilebilir10. Bir lazeri örnek bir yüzey boyunca rasterleştirerek, MS spektrumları her m / z değeri için bir ısı haritası görüntüsünde derlenebilir. Farklı bölgelerdeki geçici nöropeptit sinyal yoğunluğunun koşullar arasında haritalanması, fonksiyon tayini için değerli bilgiler sağlayabilir11. Nöropeptitlerin lokalizasyonu özellikle önemlidir, çünkü nöropeptit fonksiyonulokalizasyon 12. yere bağlı olarak farklılık gösterebilir.
Nöropeptitler, nörotransmiterler gibi diğer sinyal moleküllerinden in vivo olarak daha düşük bollukta bulunur ve bu nedenle tespit için hassas yöntemler gerektirir13. Bu, lipitler11,14 gibi daha yüksek bolluk matrisi bileşenlerinin çıkarılmasıyla sağlanabilir. Nöropeptitlerin analizi için ek hususlar, yaygın proteomik iş akışlarıyla karşılaştırıldığında yapılmalıdır, çünkü çoğu nöropeptidomik analiz enzimatik sindirimi atlar. Bu, nöropeptit veri analizi için yazılım seçeneklerini sınırlar, çünkü çoğu proteomik verilere ve peptid tespiti tarafından bilgilendirilen protein eşleşmelerine dayanan algoritmalarla oluşturulmuştur. Bununla birlikte, PEAKS15 gibi birçok yazılım, de novo dizileme yetenekleri nedeniyle nöropeptit analizine daha uygundur. Nöropeptitlerin analizinde ekstraksiyon yönteminden MS veri analizine kadar çeşitli faktörlerin göz önünde bulundurulması gerekmektedir.
Burada açıklanan protokoller, numune hazırlama ve dimetil izotopik etiketleme, veri toplama ve nöropeptitlerin LC-ESI-MS, MALDI-MS ve MALDI-MSI ile veri analizi için yöntemleri içerir. Birkaç deneyden elde edilen temsili sonuçlarla, bu yöntemlerin mavi yengeçlerden nöropeptitleri tanımlama, ölçme ve lokalize etme konusundaki yararı ve yeteneği Callinectes sapidus gösterilmiştir. Sinir sistemini daha iyi anlamak için, model sistemler yaygın olarak kullanılmaktadır. Birçok organizma, peptid seviyesinde kapsamlı nöropeptit keşfini önleyen tam olarak sıralanmış bir genoma sahip değildir. Bu zorluğu hafifletmek için, tam genom bilgisi olmayan organizmalar için veritabanları oluşturmak üzere yeni nöropeptitleri ve transkriptom madenciliğini tanımlamak için bir protokol dahil edilmiştir. Burada sunulan tüm protokoller, herhangi bir türden nöropeptit örnekleri için optimize edilebilir ve ayrıca herhangi bir endojen peptidin analizi için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tanımlanan tüm doku örneklemeleri Wisconsin-Madison Üniversitesi kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Nöropeptitlerin LC-ESI-MS analizi
- Nöropeptit ekstraksiyonu ve tuzdan arındırma
- Doku ediniminden önce,16'da açıklandığı gibi asitleştirilmiş metanol (acMeOH) (90: 9: 1 MeOH: su: asetik asit) hazırlayın.
- Kabuklular17'den beyin dokusunu toplayın ve her biri 20 μL acMeOH içeren 0.6 mL'lik bir tüpe hemen bir doku yerleştirmek için forseps kullanın.
NOT: Doku diseksiyon protokolleri farklı hayvanlar ve farklı doku tipleri için büyük farklılıklar gösterir. Okuyucu, beyin dokusunun ve diğer birçok doku tipinin kabuklulardan nasıl diseke edileceğine dair ayrıntılı bir açıklama için protokol17'ye yönlendirilir. Numuneler kullanıma kadar -80 °C'de saklanabilir (ideal olarak 6 ay içinde). Tanımlanan hacimler, Callinectes sapidus'tan tek bir beyin için kullanılır. Hacimler doku büyüklüğüne göre ölçeklendirilmelidir. Doku, çözücü olmadan hemen dondurulmuş olarak yanıp sönebilir, ancak endojen proteolitik enzimler inhibe edilmeyecek ve soğuk olduğunda daha yavaş bir oranda olsa da aktif kalacaktır. - Numuneye 150 μL acMeOH ekleyin. Toplam sonikasyon süresini 24 s'ye, darbe süresini 8 s'ye, duraklatma süresini 15 s'ye ve genliği ultrasonik homojenizatörde% 50'ye ayarlayın ve buz üzerindeki örnekleri homojenleştirin.
NOT: Farklı homojenizasyon sistemleri mevcuttur. Ayarları ve koşulları numune tipine ve ekipmana göre ayarlayın. - Numuneyi 4 °C'de 20.000 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj yapın. Bir pipetle, süpernatantı bir tüp içine aktarın ve yaklaşık 35 ° C'de bir vakum yoğunlaştırıcısında (266 x g, 1 x 10-4 Torr) kurutun.
NOT: Kurutulmuş numuneler kullanıma kadar -80 °C'de saklanabilir (ideal olarak 6 ay içinde). Vakum yoğunlaştırıcının ısıtılması dikkatli yapılmalıdır. Isı kuruma süresini kısaltırken, peptid bozulmasını en aza indirmek için numune, tüm sıvı buharlaştıktan hemen sonra yoğunlaştırıcıdan çıkarılmalıdır. Bunu önlemek için, ısıtma bundan ve sonraki tüm adımlardan çıkarılabilir. - Tuzdan arındırma için, ekstrakte edilen doku örneğini% 0.1 formik asit (FA) 20 μL'de, vorteks kuyusunda yeniden oluşturun ve oda sıcaklığında bir su banyosunda 1 dakika boyunca sonikat yapın.
NOT: Farklı tuz alma malzemeleri mevcuttur. Çözeltileri ve hacimleri reçine kimliğine ve nöropeptit miktarına göre ayarlayın. Toplam peptid miktarı, ticari bir peptid kantitasyon testi kullanılarak tahmin edilebilir (bakınız Malzeme Tablosu). - pH değerinin 4 < doğrulamak için pH şeridine 0,5 μL numune uygulayın. pH daha yüksekse, pH 4'e < kadar% 10 FA'lık 1 μL alikot ekleyin.
- 18 tuzdan arındırma için üreticinin protokolünü izleyin. 100 μL %50 asetonitril (ACN), 100 μL %0,1 FA içeren denge çözeltisi, %0,1 FA'lık 100 μL içeren yıkama çözeltisi ve 20 μL %25 ACN/%0,1 FA, 20 μL %50 ACN/%0,1 FA ve 20 μL %75 ACN/%0,1 FA içeren bir ıslatma çözeltisi hazırlayın.
- C18 reçinesi ile 10 μL'lik bir tuz alma ucu elde edin (bkz.
- Tuz alma ucunu 15 μL'ye ayarlanmış 20 μL'lik bir pipete yerleştirin. Tuz giderme ucu ıslandıktan sonra, çözelti dışındayken pipeti atılana kadar depresif tutarak havanın geçmesini önleyin.
- Ucu ıslatma çözeltisi ile 3x ve dengeleme çözeltisi ile 3x aspire edin. Numunede 10x aspirat yapın, ardından 3x'i yıkama çözeltisinde yıkayın, her yıkamayı atın. ACN'yi arttırmak için elüsyon çözeltilerinin her birinde 10x aspire ederek elute.
NOT: Elüsyon fraksiyonları ayrı tutulabilir veya daha ileri analizler için birleştirilebilir. - Kullanılan tuzdan arındırma ucunu atın ve salınan nöropeptitleri yaklaşık 35 ° C'de bir vakum yoğunlaştırıcısında (266 x g, 1 x 10-4 Torr) kurutun.
NOT: Bu, kullanıma kadar -80 ° C'de saklanabilir (ideal olarak 6 ay içinde).
- Doku ekstraktında nöropeptitlerin izotopik etiketlenmesi
NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve yalnızca niceleme istendiğinde kullanılır.- 2-plex izotopik dimetil etiketleme çözeltisini bir duman davlumbazında hazırlayın:% 1 CH 2 OH2 (486.5 μL su içinde su çözeltisinde 13.5 μL stok 37 ağırlık / ağırlık yüzdesi (ağırlıkça), % 1 CH 2 OD 2(475 μL suda ağırlıkça% 20 stok 20 % çözelti) ve 0.03 M boran piridin (996.25 μL suda 3.75 μL stok 8 M çözelti).
DİKKAT: Formaldehit toksiktir, bu nedenle tüm çözeltiler havalandırılan bir başlıkta tutulmalıdır. Eldiven, laboratuvar önlüğü, göz koruması ve geçirimsiz ayakkabılar giyin. Bu malzeme ile çalışırken kontakt lens takılmamalıdır.
NOT: Farklı izotopik reaktifler vardır; numune türüne ve istenen etiketleme kanallarının sayısına göre uygun olanları seçin. - Ham nöropeptit ekstraktını 10 μL suda çözün ve 10 dakika boyunca sonikat yapın.
- Kantitatif olarak ölçülecek her farklı deneysel koşula 10 μL farklı bir izotopik formaldehit çözeltisi(yani, CH2 OH 2, CH2 OD2, vb.) ekleyin. Her numuneyi 2.000 x g'de iyice karıştırmak ve kısaca santrifüj etmek için vorteks.
- Her numune tüpüne 10 μL 0,03 M boran piridin ekleyin. Her numuneyi 2.000 x g'de iyice karıştırmak ve kısaca santrifüj etmek için vorteks.
- Numuneleri bir su banyosunda 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Numuneleri su banyosundan çıkarın ve 10 μL 100 mM amonyum bikarbonat ekleyin. Her numuneyi 2.000 x g'de iyice karıştırmak ve kısaca santrifüj etmek için vorteks.
- Etiketli numuneleri bir 2-plex numune için birleştirin ve nöropeptitleri yaklaşık 35 ° C'de bir vakum yoğunlaştırıcısında (266 x g, 1 x 10-4 Torr) kurutun.
- 1.1.5 - 1.1.10 adımlarını yeniden uygulayarak etiketli nöropeptitlerin tuzunu çözün ve veri toplama için hazır olana kadar saklayın.
- 2-plex izotopik dimetil etiketleme çözeltisini bir duman davlumbazında hazırlayın:% 1 CH 2 OH2 (486.5 μL su içinde su çözeltisinde 13.5 μL stok 37 ağırlık / ağırlık yüzdesi (ağırlıkça), % 1 CH 2 OD 2(475 μL suda ağırlıkça% 20 stok 20 % çözelti) ve 0.03 M boran piridin (996.25 μL suda 3.75 μL stok 8 M çözelti).
- Veri Toplama
- Kurutulmuş tuzdan arındırılmış nöropeptitleri% 3 ACN / % 0.1 FA'nın 12 μL'sinde, vorteks kuyusunda, 37 ° C su banyosunda 1 dakika boyunca sonikat ve 2.000 x g'de kısaca santrifüjle yeniden oluşturun. Her numuneyi otomatik numune alma şişelerine aktarın.
NOT: Numune hacmini nöropeptit miktarına göre μL başına ~1 μg peptid konsantrasyonuna ayarlayın. toplam peptid miktarı, ticari bir peptid kantitasyon testi kullanılarak tahmin edilebilir (bkz. - Yüksek çözünürlüklü bir nano-LC-MS/MS cihazına 1 μL numune enjekte etmek için bir otomatik örnekleyici kullanın (bkz.
- Mobil faz A olarak suda %0,1 FA ve ACN'de %0,1 FA ile mobil faz B olarak çalıştırmak için yaklaşık 15 cm uzunluğunda ters fazlı (RP) C18 sütunu kullanın (bkz.
- Burada kullanılan MS cihazı için, püskürtme voltajı için 2,00 kV ve kılcal sıcaklık için 275 °C'lik ortak MS koşullarını kullanın.
- 60.000 çözünürlük, 1 x 10 6 otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefi ve 150 ms maksimum iyon enjeksiyon süresi (IT) ile 200 - 2.000 m/z aralığında MS spektrumları elde edin.
- 30 m/z normalleştirilmiş çarpışma enerjisi, 2,0 m/z izolasyon penceresi, 15.000 çözünürlük, 2 x 10 5 AGC hedefi ve maksimum 250 ms BT kullanarak daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması (HCD) parçalanması için en yoğun15 iyonu (minimum yoğunluk 3,2 x 104) seçin.
- 30 sn'lik bir dinamik dışlama penceresi ayarlayın. 1 veya ≥ 8 yüklü iyonları ve tanınmayan yük durumlarına sahip iyonları hariç tutun.
- Kurutulmuş tuzdan arındırılmış nöropeptitleri% 3 ACN / % 0.1 FA'nın 12 μL'sinde, vorteks kuyusunda, 37 ° C su banyosunda 1 dakika boyunca sonikat ve 2.000 x g'de kısaca santrifüjle yeniden oluşturun. Her numuneyi otomatik numune alma şişelerine aktarın.
- Nöropeptit tanımlama ve nicelleştirme
NOT: Veritabanı arama ve peptid ölçümü (hem açık kaynaklı hem de ticari) için birçok yazılım mevcuttur. Burada PEAKS Studio (proteomik yazılım)15 kullanılacaktır.- 1.4.2 - 1.4.6'da özetlenen adımları kullanarak veritabanı araması gerçekleştirin.
- Yeni bir proje oluşturun ve enzim için Hiçbiri , cihaz için Orbitrap , parça için HCD ve elde etme için veriye bağımlı edinme (DDA) seçerek LC-MS verilerini ekleyin.
NOT: Veri toplama parametrelerine göre uygun parametreleri seçin. - Tanımlamalar'ı seçin ve Doğru Öncü [DDA] ve Yalnızca kütle'yi seçin.
- Veritabanı Araması'nı seçin ve öncü kütle için monoizotopik kütle ve parça iyon kütlesi için 0,02 Da, enzim tipi için yok, sindirim modu için spesifik olmayan, maksimum kaçırılan bölünmeler için 100 ve peptid başına izin verilen maksimum değişken PTM ile aşağıdaki değişken PTM'leri kullanarak 20,0 ppm'lik bir hata toleransı ayarlayın: Amidasyon, Oksidasyon (M), E'den Pyro-glu, ve Q'dan Pyro-glu.
- Nöropeptit Veritabanı'nı seçin, aldatmaca-füzyon ile yanlış keşif oranını (FDR) tahmin edin.
NOT: Kütle toleransı hatası, toplanan verilerle eşleşecek şekilde ayarlanmalıdır. Örnek türü için uygun veritabanını kullanın. Hiçbir enzim seçilmediğinde, maksimum kaçırılan bölünmeler parametresi aramayı etkilemez. Ancak, yazılımın bir seçenek olarak Belirtilmemiş özet modu yoksa, çok sayıda kaçırılmış bölünme gereklidir. - Etiketsiz niceleme isteniyorsa, Niceleme'yi seçin, Etiketsiz'i seçin ve 20,0 ppm'lik bir hata toleransı ve 1,0 dakikalık bir bekletme süresi toleransı ayarlayın.
- İzotopik etiketleme için adım 1.2 gerçekleştirilmişse, öncü iyon ölçümü gerçekleştirin.
- Niceleme'yi seçin, Öncü İyon Ölçümü'nü seçin, 1,0 dakikalık bir bekletme süresi aralığı kullanın ve %1'lik bir FDR eşiği kullanın.
- Yöntem Seç açılır menüsünden bir hazır ayar veya özel niceleme yöntemi seçin.
- Yeni bir özel yöntem oluşturmak için, Q Yöntemini Etiketle > Pencere > Yapılandırması'nı > Yeni'yi tıklatın. Yeni yöntemi adlandırın ve Yöntem Türü için Öncü İyon Ölçümü'nü seçin. Satır Ekle'yi seçin ve PTM Seçenekleri listesinden değişikliği seçin.
- LC-MS verilerini ekleyin ve deneyin kontrol koşulundan nöropeptitler üzerindeki modifikasyon olması için Referans Koşulu'nu seçin.
- Arama sonuçlarını 1.4.9 - 1.4.11 adımlarında açıklandığı gibi değerlendirin.
- -10lgP ve 20 ≥ sahip peptitler ve proteinler için özet sekmesinden sonuçları filtreleyin, 1 benzersiz ≥ peptid seçin ve Önemli Peptitlerle etiketli kutuyu seçin.
- Protein.csv nöropeptit tanımlamalarını ve Peptit.csv nöropeptit fragman tanımlamalarını temsil ettiği veritabanı arama sonuçlarını değerlendirin.
- Veritabanı aramasında protein ve peptit puanlarını, kütle doğruluğunu ve dizi kapsamını inceleyin.
NOT: Her veritabanı arama yazılımı benzersiz puanlama algoritmaları kullanır ve buna göre değerlendirilmesi gerekebilir. Tanımlamalar, tüm fragman iyon serisini içeren tanımlanmış peptitler için gözlemlenen spektrumları manuel olarak inceleyerek değerlendirilebilir.
2. Nöropeptitlerin MALDI-MS lekelenme analizi
- Numune Hazırlama
- Niceleme isteniyorsa, adım 1.2.8 hariç olmak üzere adım 1.1 veya adım 1.1 - 1.2'yi izleyin (MALDI-MS analizinden önce izotopik etiketlemeden sonra tuzdan arındırma gerekli değildir).
- Kurutulmuş tuzdan arındırılmış nöropeptitleri% 0.1 FA'lık 5 μL'de, vorteks kuyusunda, 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 dakika boyunca sonikat ve 2.000 x g'de kısaca santrifüj içinde yeniden oluşturun.
- Kabuklu dokularında nöropeptitlerin lekelenmesi için, matris olarak% 50 metanol (MeOH) / % 0.1 FA (v / v) içinde 150 mg / mL 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) hazırlayın.
- Hidrofobik bir film üzerine 3 μL'lik bir numune damlacığı pipeti (bkz. Malzeme Tablosu) ve matrisin 3 μL'lik pipetini doğrudan numune damlacığı üzerine yerleştirin. Karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet.
- 1:1 numunenin 1 μL'lik pipeti: matris karışımı MALDI paslanmaz çelik hedef plakanın bir kuyucuğuna yerleştirilir. Her karışımı numunenin kenarlarına iyice yaymak için pipet ucunu kullanın. Numune, düzgün dağılımı kolaylaştırmak için kuyu gravürünün kenarlarına dokunmalıdır (Şekil 4A).
- 1:1 kalibrantın 1 μL'lik noktası: matris karışımı (ticari veya özel kalibrasyon karışımı, polimer malzemeler (yani, MeOH'de çözünmüş kırmızı fosfor) veya ortak matris kümesi iyonları)12 numunenin yakınındaki bir kuyucuğa.
NOT: Kırmızı fosforun lekelenmeden önce matrisle karıştırılmasına gerek yoktur.
- Veri toplama
- Kurutulmuş numune noktaları içeren hedef plakayı MALDI Tandem Uçuş Süresi (TOF/TOF) cihazına yerleştirin (bkz.
- DHB matrisi için lazer gücünü %95'e ayarlayın, Otomatik Optimum Dedektör Kazancı ve Akıllı - Tam Numune taşıyıcı hareket modunu seçin. 200 - 3200 m / z aralığında MS spektrumları elde edin ve nöropeptit sinyal-gürültü oranını artırmak için her noktadan birlikte çoklu spektrumlar ekleyin.
NOT: Lazer gücü, dedektör kazancı yüzdesini optimize edin ve uygun numune taşıyıcı hareket modunu seçin, böylece her edinme kabaca tüm noktayı kapsar ve sonraki edinimler önceki konumlara gitmez. - Cihazı kalibre edin.
NOT: Kütle aralığını, istenen nöropeptit aralığını kapsayacak şekilde ayarlayın.
- Veri analizi
- MALDI-MS dosyasını veri analiz yazılımında açın (bkz. Malzeme Tablosu) ve burada kullanılan yazılım için Temel Çıkarma'yı tıklatın.
- Toplu Liste Bul'u tıklatarak tepe noktası belirleme işlemini gerçekleştirin. Çok az tepe noktası varsa, Kütle Listesini Düzenle'yi seçerek kütle listesini manuel olarak düzenleyin ve bunları kütle listesine eklemek için spektrumdaki zirvelere tıklayın.
- Kütle listesini [M+H]+m/z değerlerini içeren nöropeptit veritabanıyla karşılaştırarak doğru kütle eşleştirmesi yapın (200 ppm hatası ±).
NOT: [M+K]+, [M+Na]+ ve [M+NH4]+ gibi yaygın tuz katkıları da doğru kütle eşleştirme hedef listesine dahil edilmelidir. - Tanımlanan pikleri doğrulamak için, ilgilenilen m / z'nin bir listesini oluşturun ve MS / MS deneyleri yapın.
3. Nöropeptitlerin MALDI-MS görüntüleme analizi
- Numune hazırlama
NOT: Bölümlenemeyecek kadar ince dokular için gömme ve kesitleme adımları gerekli değildir.- Yarım kriyostat kabını jelatinle doldurun (37 °C, deiyonize suda 100 mg / mL) ve oda sıcaklığında katılaşmasını bekleyin. Artık sıvı jelatini 37 °C su banyosunda sıcak tutun.
- İstenilen nöronal dokuyu hayvandan toplayın ve dokuyu derhal 1 s için deiyonize su içeren 0.6 mL'lik bir tüpe batırmak için forseps kullanın.
NOT: Nöronal doku diseksiyonu için Adım 1.1.2 NOT'a bakınız. - Dokuyu katı jelatinin üzerine yerleştirin ve kriyostat kabının geri kalanını sıvı jelatinle doldurun. Dokuyu konumlandırmak için forseps kullanın.
- Kriyostat kabını düz bir yüzeye yerleştirin ve kuru buzla dondurun.
NOT: Numuneleri kullanıma kadar -80 °C'de saklayın (ideal olarak 6 ay içinde). - Kesit hazırlığı için, jelatin gömülü numuneyi, kalıbı keserek kriyostat kalıbından ayırın.
- Gömülü dokuyu, aynaya 1 mL'lik bir deiyonize su damlacığı pipetleyerek ve gömülü dokuyu hemen damlacık üzerine bastırarak bir kriyostat mandren üzerine monte edin.
- Dondurulduktan sonra, pipet, mandrene daha fazla sabitlemek için dokunun etrafında daha fazla deiyonize su elde edin. Bu adımları -20 °C'ye ayarlanmış kriyostat kutusunun içinde gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Dokuyu yaklaşık bir hücre kalınlığında (numune tipine bağlı olarak 8-20 μm) kesitleyin ve her bir bölümü, slaytın bir tarafını bölümün yanına yerleştirerek ve camı yavaşça ısıtmak ve bölümün slayda yapışmasına izin vermek için slaytın diğer tarafına bir parmağınızı yerleştirerek indiyum kalay oksit (ITO) kaplı bir cam slayt üzerine monte edin.
NOT: Doku kesitleri, jelatinin bir kenarı cımbızla (-20 °C'ye soğutulmuş) alınarak, İTO kaplı cam kızağın üzerine yerleştirilerek ve camı yavaşça ısıtmak ve bölümün slayda yapışmasına izin vermek için parmağınızı slaytın diğer tarafına yerleştirerek çözülerek de monte edilebilir. - Kalibrant olarak kullanılacak numuneyi (kalibrant seçenekleri için adım 2.1.6'ya bakın), hidrofobik bir kalem kullanarak doku bölümünün yakınında küçük bir daire çizerek ve dairenin içindeki kalibrantı tespit ederek tespit edin.
- Slaytın her köşesini, öğretme noktaları olarak kullanılmak üzere keskin kenarlar (yani x) içeren küçük bir şekle sahip beyaz bir kalemle işaretleyin.
- Cam slaytı MALDI slayt adaptörü plakasına yerleştirin ve bir tarayıcı kullanarak yüksek çözünürlüklü (≥2400 DPI) optik görüntü taraması yapın.
- Otomatik bir püskürtücü kullanarak doku bölümüne püskürtme matrisi uygulayın (püskürtücü ayrıntıları ve talimatları için Malzeme Tablosu'na bakın).
- Kabuklu dokularındaki nöropeptitlerin MSI'sı için, matris olarak% 50 metanol veyasolda% 0.1 FA (v / v) içinde 40 mg / mL DHB kullanın, nozul sıcaklığını 80 ° C'ye, hızı 1.250 mm / dak'ya, akış hızını 0.1 mL / dak'ya, geçiş sayısını 12'ye ve otomatik püskürtücü için her geçiş arasında 30 s'ye ayarlayın.
- Veri toplama
- Matrisle püskürtülen çözülmüş doku kesitlerini içeren tamamen kurutulmuş hedef plakayı yerleştirin.
- MS görüntüleme alma dosyası parametrelerini, lazer çapı raster adım boyutundan daha küçük olacak şekilde ayarlayın.
- Taranan optik görüntüyü yükleyin ve x öğretme noktalarını kullanarak numune plakasını kalibre edin. Gerçek doku bölümünden biraz daha büyük ölçülecek doku alanlarını, sadece matris içeren alanları da içerecek şekilde tanımlayın.
- Cihazı kalibre edin ve 200 - 3200 m / z aralığında spektrumlar elde edin. Kütle aralığını, istenen nöropeptit aralığını kapsayacak şekilde ayarlayın.
- Veri analizi
- Verileri işlemek için MS görüntüleme veri kümesini istediğiniz yazılıma aktarın, bir temel kaldırma algoritması seçin ve Toplam İyon Sayısı'nı kullanarak verileri normalleştirin.
NOT: Medyan, kök ortalama kare (RMS) değeri veya referans m/z değerinin yoğunluğu gibi farklı normalleştirme algoritmalarının seçilmesi, birçok m/z değerinin uzamsal dağılımını değiştirecektir. İstenilen analitler için en uygun normalleştirme algoritmasını seçin. - Teorik bir tepe listesinden her m/z değeri için bir görüntü oluşturmak üzere nöropeptit [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+ vb. içeren virgülle ayrılmış değerler (CSV) dosyası yükleyin. Dosya > Alma > Peak Listesi'ni tıklatarak m/z değerlerini elde edin. Tepe listesini adlandırın.
- Uygun ppm hata eşiğini tahmin etmek için, önce MS spektrumundaki bir nöropeptit zirvesini manuel olarak tanımlayın ve nöropeptit teorik kütlesi ile karşılaştırın. ppm hatasını hesaplayın ve Dosya > Dosya Özellikleri > Aralık Genişliği ve giriş ppm hatası'nı tıklatın.
- Açılır menüden tepe listesini seçin ve Tepe Listesinin Her Aralığı İçin m/z Görüntüleri Oluştur'u tıklatın.
- Her m/z Görüntüsünün Ekran Görüntüsünü Kaydet'i tıklatarak her m/z görüntüsünü kaydedin.
NOT: Varsayılan nöropeptit tanımlaması, analit sinyalinin çevreleyen matriste değil, sadece doku içinde lokalize olduğu m / z görüntülerini tanımlayarak gerçekleştirilebilir. - En yüksek kimliği doğrulamak için, ilgilenilen m/ z'nin bir listesini oluşturun ve MS/MS deneyleri gerçekleştirin.
- Verileri işlemek için MS görüntüleme veri kümesini istediğiniz yazılıma aktarın, bir temel kaldırma algoritması seçin ve Toplam İyon Sayısı'nı kullanarak verileri normalleştirin.
4. De novo dizileme kullanarak yeni varsayılan nöropeptitlerin keşfedilmesi
- 1.4.2 - 1.4.5 arasındaki adımları uygulayın.
- PEAKS yazılımından sadece peptidleri ihraç .csv ve ortalama yerel güven (ALC) puanı ≥ 75'tir.
NOT: De novo sıralama gerçekleştirmek için her biri kendi puanlama algoritmalarına sahip ve buna göre değerlendirilmesi gereken birçok yazılım vardır. - Belirli nöropeptit ailelerine ait nöropeptitlerin göstergesi olan bilinen dizi motifleri için peptid listesini araştırın19.
NOT: Motifler türler arasında yaygın olarak iyi korunmuş olsa da, aranan motifler örnek organizma dikkate alınarak seçilmelidir.
5. Tahmin edilen nöropeptit dizileri için transkriptom madenciliği
NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve yalnızca varolan bir nöropeptit veritabanına eklemek veya yeni bir nöropeptit veritabanı oluşturmak için kullanılır.
- İlgilendiğiniz bilinen bir preprohormon amino asit dizisini seçin ve tBLASTn kullanın (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
_LOC=blasthome), nr/nt, Refseq_genomes, EST ve TSA gibi veritabanlarına karşı sorgu preprohormon dizisini aramak için.
NOT: Sorgu dizilerini protein veritabanına karşı aramak için BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).- Hedef organizmayı (vergi kimliği) seçin ve düşük puan hizalamalarını dahil etmek için Beklenti Eşiği algoritması parametrelerini 1000 olarak değiştirin.
- BLAST programını çalıştırın ve ardından önemli hizalamalar üreten sorgu ve konu dizileri arasında yüksek homoloji puanları için sonuçları kontrol edin. Nükleotid dizisini içeren FASTA dosyasını kaydedin.
NOT: Benzer homoloji skorlarına sahip birkaç denek dizisi varsa, varsayılan dizileri20,21 daraltmak için bir MAFFT hizalaması gerçekleştirin.
- Expasy Translate aracını (https://web.expasy.org/translate/) kullanarak preprohormon nükleotid dizisini preprohormon peptid dizilerine çevirin. C. sapidus için, genetik kod için Omurgasız Mitokondriyal'i seçin.
- SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP) kullanarak peptid dizilerinde sinyal peptid dizisi ve prohormon bölünme bölgeleri olup olmadığını kontrol edin.
NOT: Bilinen preprohormon işleme şemalarına homoloji, prohormon bölünme bölgelerini tanımlamak için de kullanılabilir. İstenirse, sinyal peptitleri için olası post-translasyonel modifikasyonlar tahmin edilebilir. Sülfinatör (https://web.expasy.org/sulfinator/), tirozin kalıntılarının sülfatlanma durumunu tahmin etmek için kullanılabilir. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/), disülfit bağ bağlantısını tahmin etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Numune hazırlama ve MS analizi için iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Nöronal dokunun diseksiyonundan sonra, nöropeptit örneklerini saflaştırmak için homojenizasyon, ekstraksiyon ve tuzdan arındırma yapılır. İzotopik etiket tabanlı niceleme isteniyorsa, numuneler daha sonra bir kez daha etiketlenir ve tuzdan arındırılır. Elde edilen numune, nöropeptit tanımlama ve nicelleştirme için LC-MS / MS ile analiz edilir.
Proteomik yazılım aracılığıyla tanımlanan nöropeptitler, iyi bir peptit parçalanma dizisi kapsamına sahip olmalıdır, ancak bu küresel olarak tanımlanmamıştır veya standartlaştırılmamıştır. Mutlak tanımlama için, her amino asit, kesin tanımlama ve lokalizasyon sağlayan bir parça iyonu üretmelidir. Bu aynı zamanda her bir parça iyonunun yoğunluğunun doğrulanması için sentezlenmiş bir peptit ile karşılaştırılmalıdır. Bunu her varsayılan tanımlamada gerçekleştirmenin maliyeti mümkün olmadığından, tanımlama genellikle daha fazla gözlenen fragman iyonlarının peptid tanımlama güvenini arttırdığı güvene dayanarak tanımlanır. Şekil 2A, B, her ikisi de% 100 sekans kapsamı ve 0.02 Da'nın maksimum sınırı ile tanımlanan düşük kütle hatası ile tanımlanan iki nöropeptiti tasvir ederken, Şekil 2B'deki nöropeptit için sadece gözlenen zayıf parçalanma kapsamı (sadece üç iyondan), spesifik bir izoformun tanımlanmasının güvenini azaltır. Şekil 2C, LFQ için kullanılan iki örnekte tespit edilen bir nöropeptitin tutma süresinin bir fonksiyonu olarak seçilen bir m / z değerinin sinyal yoğunluğunu içeren bir grafik olan ekstrakte edilmiş iyon kromatogramlarını (XIC'ler) göstermektedir. Nöropeptit için tutma süreleri biraz farklıdır, çünkü iki ayrı ve ardışık çalışmada tanımlanmıştır; ancak, fark 1 dakikalık güvenilir eşik değeri içindedir. Bu nedenle, XIC'den eğrinin altındaki yazılım tarafından hesaplanan alan arasındaki oran, bu nöropeptitin LFQ'su için kullanılır.
Dimetil etiketli nöropeptitlerin kantitasyonu için, MS1 spektrumu, teorik nöropeptit m / z değerinde bir tepe noktası ve kullanılan izotopik etiketleme reaktifleri arasındaki kütle farkı ile ilişkili bir kütle kayması ile m / z değerinde bir tepe içermelidir. Şekil 2D'de, bu 2-plex dimetil etiketli numunenin kütle kayması 4.025 Da'dır. XIC'lerinden öncü iyonun eğrisinin altındaki alan daha sonra yazılım tarafından hesaplanır ve göreceli bolluk oranlarını hesaplamak için kullanılır. Tanımlanmış nöropeptitleri ve bunların LFQ oranlarını içeren proteomik yazılım ihracat tablosunun basitleştirilmiş bir versiyonu Tablo 1'de gösterilmiştir. İzotopik olarak etiketlenmiş nöropeptitler için de benzer sonuçlar elde edilir.
Yazılım algoritmaları, yeni varsayılan nöropeptitleri tespit etmek için spektrumların de novo dizilimini sağlar. Sözde yeni nöropeptitlerin tespitini iddia ederken, yüksek güven tanımlamaları, tüm amino asitlerin fragman iyonu gözlemine dayanarak açık bir şekilde tanımlandığı ve lokalize edildiği ideal vakalardır. Şekil 3 , C-terminalinde -RYamide motifini içeren de novo sıralı bir peptidin spektrumunu, kabuklu RYamide ailesi22'nin bilinen nöropeptitleri tarafından paylaşılan korunmuş bir dizi motifini göstermektedir. Veri tabanından% 100 dizi kapsamı ile bir peptit eşleştirildi, tüm amino asit oluşturan fragman iyonları gözlendi, maksimum 0.02 Da sınırı ile tanımlanan düşük fragman iyon kütlesi hatası ve bir gaussian elüsyon profili içeriyordu. Bu sonuçlar, kabuklular -RYamid nöropeptit ailesine ait endojen bir peptidin gözlendiğini göstermektedir.
MALDI-MS nokta ölçümleri, LC-ESI-MS tanımlamasını tamamlayan nöropeptit tanımlamaları sağlayabilir ve daha yüksek verim yetenekleri sunabilir. Ham doku homojenatı nöropeptitler için ekstrakte edildikten sonra, tuzdan arındırıldıktan ve etiketlendikten sonra (istenirse), numune matris ile karıştırılabilir ve Şekil 4A'da gösterildiği gibi MALDI paslanmaz çelik hedef plakasında tespit edilebilir. Homojen numune noktalarının başarılı pipetlenmesi, özellikle kalibrasyon spektrumu içinde açıkça çözülmüş pikler üretir (Şekil 4B). Bir MALDI-TOF cihazı kullanırken, cihaz her deneyin başında kalibre edilmelidir. Bilinen kütlelere sahip herhangi bir analit, numunenin istenen kütle aralığında olması durumunda cihazı kalibre etmek için kullanılabilir. Burada, cihazın pozitif iyon kütlesi kalibrasyonu için kırmızı fosfor kullanılır. Oda sıcaklığındaki kararlılığı, ucuz maliyeti, polimerizasyonu nedeniyle bol pikleri, yüksek sinyal-gürültü oranı nedeniyle peptid kalibrasyon karışımlarını kullanmaya göre avantajları vardır ve iyonizasyon için bir matris gerektirmez.
Nöropeptitlerin MALDI-MS görüntülemesi için, kullanılan MALDI TOF/TOF cihazı, optik görüntüyü numune ile ilişkilendirmek için İTO kaplı slaydın (adım 3.1.10) manuel görüntü kalibrasyonunu gerektirir. Şekil 5'teki diyagram, cihazın taranan optik görüntüyü gerçek numune plakasıyla ilişkilendirmesine izin vermek için öğretme noktaları olarak kullanılacak beyazlatma artı işaretlerinin uygun şekilde yerleştirilmesini göstermektedir. Ayrıca, ITO kaplı slaytın kullanıcı tarafından kaçınılması gereken alanlarını da gösterir (yani, örnek veya matris içermez). Kütle kalibrasyonu için, kalibrasyon numune noktasının ITO-kaplı slayt üzerindeki doku numunesine göre yerleştirilmesi, uçuş süresi kütle analizörlerinin doğal doğası nedeniyle kütle hatasını doğrudan etkiler, ancak bu sorunun büyüklüğü hedef analitlerin bolluğuna bağlıdır. Bu sorunun bir çözümü, tepe kaymasının kanıtı için MS1 spektrumlarındaki pikleri farklı doku kesitlerinden manuel olarak kontrol etmektir. Tepe kayması varsa, her doku bölümünün hemen yanındaki İTO kaplı kızağa ek kütle kalibrasyon noktaları eklemeyi düşünün. Oradan, kullanıcı kalibrasyon noktalarından spektrumların ortalamasını alabilir veya yalnızca doku bölümüne en yakın kalibrasyon noktasını kullanarak bir seferde bir doku bölümünde MS görüntüleme gerçekleştirebilir. Numune toplandıktan sonra, varsayılan bir nöropeptit tanımlaması atamadan önce, nöropeptitlere karşılık gelen m / z değerlerinden gelen sinyalin yalnızca doku bölgesi içinde lokalize olduğunu doğrulayın (Şekil 6).
Şekil 1: Kütle spektrometresi analizi için nöropeptit numune hazırlama iş akışı. Doku ekstraktı analizi için ham doku homojenatı tuzdan arındırılır, kararlı izotopik etiketlerle etiketlenir, tekrar tuzdan arındırılır ve MS tarafından analiz edilir. Görüntüleme analizi için bozulmamış doku gömülür, kriyoseksiyon yapılır, matris ile uygulanır ve MALDI-MSI ile analiz edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Proteomik yazılım aracılığıyla gerçekleştirilen tanımlama ve niceleme. Nöropeptitler, (A) iyi veya (B) zayıf MS2 parçalanma kapsamı ile değişen kalitede spektrumlar yoluyla tespit edilir. Fragman iyon kütle eşleştirme hatası spektrumların altında gösterilmiştir. (C) XIC profil şekilleri ve tutma süresi (RT), LFQ aracılığıyla ölçülen nöropeptitler için manuel olarak denetlenebilir. (D) MS1 spektrumları, dimetil etiketli nöropeptitleri tespit etmek ve ölçmek için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yeni nöropeptit tespiti için de novo dizileme . (A) Sözde yeni bir RYamide'in MS2 spektrumu, her parça için düşük kütle hatasıyla iyi parçalanma kapsamı göstermektedir. (B) Tanımlanan parça iyonları manuel inceleme için listelenir. (C) Yeni nöropeptitin XIC'si Gauss tepe şekli için manuel olarak incelenir. Kısaltmalar: RT = bekletme süresi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: MALDI-MS noktaları ve kalibrasyon spektrumu. (A) MS spektrum kalitesi, MALDI paslanmaz çelik hedef kuyusundaki tekdüze matris-peptit dağılımına dayanır. Soldaki üç nokta, kuyu gravürünün kenarlarına dokunan iyi noktaların örnekleridir ve sağ üç nokta kötü noktaların örnekleridir. Her iki nokta da α-Siyano-4-hidroksisinnamik asit (CHCA) matrisi ve bir peptid standart karışımı içerir. (B) 500 - 3200 m/z arasındaki kırmızı fosfor kümeleri kullanılarak kalibrasyon spektrumu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İTO kaplı cam slaytın tasviri. (A) Önemli alanların belirtildiği şematik: doku kesitlerinin yerleştirileceği yerler (açık mavi dikdörtgenler), kaçınılması gereken otomatik öğretme noktaları yerleri (kırmızı dikdörtgenler), öğretme noktalarının çizilebileceği örnek yerler (beyaz artı işaretleri) ve vidaların adaptör plakasına takıldığı ve kaçınılması gereken yerler (koyu mavi ovaller). (B) İki doku bölümü, kalibrasyon karışımı içeren bir nokta ve artı işareti içeren cam slaytın fotoğrafı. Doku bölümünün yeri ve kalibrasyon noktaları, cam kızağın diğer tarafında özetlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: C. sapidus sinüs bezlerinin MS görüntüleri. (A) HL/IGSL/IYRamid (m/z 844.48), (B) Allatostatin A-tipi NPYAFGLamid veya GGPYAFGLamid (m/z 780.40), (C) Allatostatin A-tipi GQYAFGLamid (m/z 754.39) ve (D) RFamid GRNFLRFamid (m/z 908.52)'nin nöropeptit [M+H]+ iyon dağılım görüntüleri gösterilmiştir. Görüntüler, teorik m/z değerinden ± 50 ppm'lik bir pencere kullanılarak oluşturulur. Renk çubuğu, sinyal yoğunluğunun %0 ila %100 aralığını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Veritabanı araması ve LFQ sonuçları. Nöropeptitler LC-MS ve proteomik yazılım ile tanımlanmış ve nicelleştirilmiştir. Tanımlanan PTM'ler, LFQ için her iki örnekte tespit edilen peptitlerin yoğunlukları ve ortaya çıkan LFQ oranı ile birlikte listelenir. FASTA dosyasından ortalama kitleler ve gözlenen nöropeptit tanımları listelenmiştir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sinir sisteminde bulunan nöropeptitlerin ve endojen peptitlerin doğru tanımlanması, nicelleştirilmesi ve lokalizasyonu, fonksiyonlarını anlamak için çok önemlidir23,24. Kütle spektrometresi, tam olarak sıralanmış bir genomu olmayan organizmalarda bile, tüm bunların gerçekleştirilmesine izin verebilecek güçlü bir tekniktir. Bu protokolün, LC-ESI- ve MALDI- MS'in bir kombinasyonu yoluyla C. sapidus'tan toplanan dokudan nöropeptitleri tespit etme, ölçme ve lokalize etme yeteneği gösterilmiştir.
LC-ESI-MS analizi için numune hazırlama sırasında dikkat edilmesi gereken noktalar belirtilmelidir. MS hassas bir teknik olmasına rağmen, nöronal dokunun düşük peptid konsantrasyonu (femtomolar aralık25'e kadar) ciddi bir sınırlama getirmektedir. Sadece proteinler ve lipitler gibi daha bol ve müdahale eden matris bileşenlerini uzaklaştırmak için değil, aynı zamanda her adımda nöropeptitlerin kaybını en aza indirmek için dikkatli numune hazırlama gereklidir26,27. Örneğin, peptid adsorpsiyonuna dirençli mikrosantrifüj tüpleri kullanılarak numune kaybı azaltılabilir. İlgilenilen dokunun bileşimine bağlı olarak, farklı boyutlarda ve kimyasal özelliklere sahip biyomoleküllerin ayrılması için çeşitli çözücülerin (ekstraksiyon veya çökeltme için) veya katı faz ekstraksiyon malzemelerinin kullanılması kullanılabilir. Nöropeptit ekstraktında hidrofilik veya hidrofobik peptitlerin bulunduğundan emin olmak için, farklı fizikokimyasal özelliklere sahip nöropeptitleri hedeflemek için isteğe bağlı olarak çoklu ekstraksiyon çözücü sistemleri kullanılabilir. Bunların, proteaz inhibitörlerinin kullanımı ile birlikte, nöropeptit geri kazanımını iyileştirmek için optimize edilmiş saflaştırma için modifiye edilmesi gerekebilir28. Çoklu ekstraksiyon sistemleri kullanmanın dezavantajları, genel olarak daha yüksek bir peptid içeriği gereksinimini karşılamak ve aynı zamanda verimi azaltmak için birkaç nöronal dokunun bir araya getirilmesi gerektiğidir. Tuzdan arındırma, izotopik etiketleme ve MS enjeksiyonu gibi birçok adım, belirli başlangıç peptid miktarlarını önermektedir. Nöropeptitler gibi değerli numunelerin karakterizasyonu için, yabancı peptid tüketimini önlemek için genellikle peptid tahlillerinden kaçınılır. Ek olarak, endojen peptitlerden farklı kimyasal özelliklere sahip protein sindirimlerinden doğru peptid konsantrasyonunu belirlemek için peptid testleri geliştirilmiştir. Bilinmeyen nöropeptit konsantrasyonundan kaynaklanan komplikasyonların üstesinden gelmek için, sonuçların sonraki tüm analizler için bir tahmin olarak kullanıldığı havuzlanmış nöronal doku ekstraktları kullanılarak bir ilk peptid testi yapılabilir, ancak çözeltideki tüm peptitlerin ölçüldüğü ve bunların hepsinin nöropeptitler olmadığı akılda tutulmalıdır29. Bu yöntemin diğer sınırlamaları, polar olmayan ve hidrofobik nöropeptitlere potansiyel önyargıları ve doğal yapı korunumunun eksikliğini içerir. Bunu ele almak için çözücü bileşimlerinde ve malzemelerde, daha hidrofobik çözeltilerin kullanılması veya organik çözücülerin kullanımının ihmal edilmesi gibi değişiklikler yapılabilir.
MALDI-MS ölçümleri, tutarlı sonuçlar için dikkatli numune hazırlama adımlarına dayanır ve LC-ESI-MS ölçümlerinden farklı numune hususlarına sahip olabilir. MS analizinden önce nöropeptit ekstraktının buz üzerinde tutulması gibi adımlar hala uygulanmaktadır. Nöropeptit yıkımını önlemenin ek yöntemleri, yoğuşmanın30 birikmesini önlemek için diseksiyondan sonra çözülmüş doku kesitleri içeren cam slaytları bir kurutucu kutusunda tutmayı içerir, ancak doku örneğini kuruduktan sonra kurutucuda bırakmak da numune bozulmasına neden olabilir. Doku slaytlarının matriks uygulamasından hemen önce 5-10 dakika boyunca vakumlu bir kurutucuya (son basınç: oda sıcaklığında 1x10-4 Torr) yerleştirilmesi önerilir. Matriks doku kaydırağı üzerine bırakıldıktan sonra, gece boyunca buzdolabında veya dondurucuda saklanabilir ve MALDI-MS görüntüleme ölçümünden önce vakumlu kurutucuda kurutulabilir. MALDI nokta ölçümleri için, matris-peptit kristal yapısı, öyle görünse bile, MALDI hedefi boyunca eşit olarak dağılmaz. Bu işlem nedeniyle teknik replikalardan kütle spektrumu varyasyonlarını azaltmanın yolları vardır. İlk olarak, lazerin kuyu boyunca rastgele rasterlendiği birden fazla lazer atışı (tipik olarak yüzlerce ila binlerce) kullanarak her kuyudan ortalama bir spektrum elde edin (yani, cihaz parametrelerinde SMART veya Rastgele numune taşıyıcı hareketini seçmek). Her numune tipi için en az beş teknik replika edinin ve istenen pikler için sinyal yoğunluğundaki değişimin en düşük olduğu üç teknik replika seçin. Buradaki ödünleşim, deneysel verimdir. Lazer atışlarının sayısı, lazer çapı ve diğer cihaz ayarları gibi parametrelerin elde edilen tüm spektrumlar için tutarlı tutulması gerekir. İdeal olarak, tüm teknik replikalar ve biyolojik replikalar, aynı matris çözeltisi ve cihaz kalibrasyonu kullanılarak aynı anda analiz edilir. Nöropeptit tanımlaması, teorik [M + H] +, [M + Na] +, [M + NH 4] +, [M + K] + ve tek başına yüklü iyon m / z değerleri üreten diğer tuz katkılarını içeren bir tepe listesine doğru kütle eşleştirmesi ile gerçekleştirilebilir. Verilerin normalleştirilmesi, MALDI-MS deneylerinden elde edilen sistematik eserleri en aza indirmek için kritik öneme sahiptir. Tekrarlanabilirliğin değerlendirilmesi, MALDI-MS nokta ölçümleri stabil izotop etiketleme (SIL) ile nöropeptit ölçümü için kullanıldığında özellikle önemlidir. Numune hazırlama ve veri toplama kalitesi, bir peptid standardı veya nöropeptit ekstraktı alınarak, iki eşit alikot'a bölünerek, her numuneyi SIL ile farklı şekilde etiketleyerek ve eşleştirilmiş piklerin göreceli yoğunluğunun 1: 1 olduğundan emin olmak için numuneyi analiz ederek değerlendirilebilir. Bu oranlardan bildirilen varyasyon, kullanıcı hatasına atfedilen genel deneydeki varyans düzeyini tahmin etmek için kullanılabilir.
MALDI-MS'in aynı zamanda dizi ve nicel bilgi sağlayabildiğine dikkat etmek önemlidir; Bununla birlikte, tipik olarak MALDI tarafından üretilen tek yüklü iyonlar, peptid fragmanı tespitini sınırlar, bu da tam dizinin elde edilmesini zorlaştırır ve LC-ESI-MS için tartışılan kantitasyon yöntemlerini inhibe eder. Ne olursa olsun, MALDI-MS, numune12,31'deki tuzlar ve safsızlıklar için daha yüksek toleransın yanı sıra yüksek verim kapasitesi nedeniyle çekici bir yöntemdir. Ek olarak, MALDI-MS görüntülemenin antikor gerektiren diğer geleneksel görüntüleme tekniklerine göre avantajları vardır. Çoğu MS modalitesinde, kütle çözünürlüğünün düşürülmesi, duyarlılığı artıracak ve düşük bolluktaki nöropeptitlerin daha iyi tespit edilmesini sağlayacaktır. Bu strateji, her deney için MALDI cihazını kalibre etme kolaylığı nedeniyle MALDI-TOF/TOF cihazları için LC-ESI-MS cihazlarından daha pratik olabilir. MALDI'nin nöropeptidomikler için avantajlı olmasının bir başka yolu da spektrum ortalamasıdır. Tipik olarak, LC-ESI-MS ölçümlerinden ortalama spektrumlar kullanılmaz, çünkü LC ayırmanın faydalarını reddeder; Bu nedenle, nöropeptitleri tanımlamak için biyoinformatik yazılımına büyük ölçüde güvenilmektedir ve tanımlamalar manuel olarak doğrulanmaktadır. Bununla birlikte, MALDI-MS ölçümlerinden spektrumların ortalamasının alınması için daha az sonuç vardır, çünkü ilk ayırma yoktu; bu nedenle, ham veriler daha küçüktür ve kullanıcının el ile taraması daha kolaydır. Veri yönetiminin kolaylığı, kullanıcının nöropeptit tanımlama ve doğrulama stratejilerine yaklaşabileceği sırayı değiştirdiği için önemlidir. LC-ESI-MS'den nöropeptit tanımlamalarına duyulan güven, veri analizi yazılımındaki eşik sıkılık seviyesini artırmaktan fayda sağlayabilirken, bu stratejinin MALDI-MS tanımlamalarına fayda sağlama olasılığı daha düşüktür. Kabuklu nöropeptitler örneğinde, laboratuarda oluşturulan veritabanından 1000'den az giriş olması (yani, manuel olarak taranacak maksimum <1000 spektral tepe noktası veya MS görüntüsü), önce MALDI-MS verilerini cömert bir kütle hatası eşiği ile filtrelemeyi ve ardından izotopik zarfları MS1 düzeyinde inceleyerek bu tanımlamaları manuel olarak doğrulamayı mümkün kılar, Temsili Sonuçlar bölümünde tartışılan diğer doğrulama yöntemlerinin yanı sıra. Popüler MS görüntüleme veri analizi yazılımı, bir nöropeptit kütle veritabanına doğru kütle eşleştirmesi yapabilir ve ilgili MS görüntülerini çıkarabilir. Biyobelirteç keşfi gibi klinik tabanlı araştırma soruları için, bu yazılımlar ilgilenilen bir doku bölgesine özgü m / z değerlerini (tipik olarak İlgi Çekici Bölge (ROI) analizi olarak adlandırılır)32 çıkarabilir ve iki doku bölgesinin ne kadar farklı olduğunu ölçmek için istatistiksel testler gerçekleştirebilir. MS görüntüleme için LC-ESI-MS'den daha az veri analiz yazılımı seçeneği olduğunu da belirtmek gerekir.
Nöropeptitler için LC-ESI-MS veritabanı aramaları yapmak, genellikle sindirilmiş peptitlerin analizi için oluşturulmuş yazılım algoritmalarının kullanılmasını gerektirir. Bu nedenle, yazılımın spesifik olmayan enzim veritabanı aramalarını gerçekleştirebilmesi veya aramayı tamamlamak için gereken süre için sınırlamalar vardır. Şu anda, endojen peptit aramaları maksimum kaçırılan bölünme sayısı ile gerçekleştirilmektedir, ancak bu sayı hala sınırlıdır ve potansiyel olarak kaçırılmış tanımlamalara yol açmaktadır. Bir türün genomu, C. sapidus'ta olduğu gibi, tam olarak dizilenmediğinde, bilinmeyen / yeni nöropeptitleri bilinen korunmuş nöropeptit dizisi motifleri aracılığıyla tanımlamak için de novo dizileme yapılabilir, ancak bu yöntem bilinmeyen motiflere sahip olan veya nöropeptit ailesi tanımlayıcıları olarak kullanılan motifleri içermeyen nöropeptitleri tanımlamakta başarısız olur.19. Örneğin, WSSMRGAWamide, allatostatin B-tipi nöropeptit ailesi19 için bir motiftir. Burada, tamamen çözülmüş bir genom dizisi olmayan türler için öngörülen nöropeptit dizileri için transkriptom madenciliğinin önemi yatmaktadır33. Nöropeptit tanımlamaları daha sonra varsayılan peptid dizisinin sentezlenmesi ve MS / MS spektrumlarının sentetik peptit ve biyolojik dokudan karşılaştırılmasıyla doğrulanır34. Bir dizi doğrulandıktan sonra bile, bazen tam nöropeptit dizisi mi yoksa bir bozunma ürünü mü olduğu bilinmemektedir. MALDI ve ESI-MS iyonizasyon kaynakları arasındaki farklılıkların (ESI, MALDI'den daha yumuşak bir iyonizasyon yöntemidir) farklı yapay bozulma oranlarına (yani kaynak içi parçalanma) neden olabileceğini belirtmek gerekir. Bir peptidin kesilmiş bir versiyonunu, yapay olarak indüklenen (yani in vivo değil) bir bozunma ürününden ayırt etmek için, bu nöropeptit için preprohormon işleme yolu bilinmelidir. Bu genellikle böyle olmadığından, fizyolojik tahlillerde peptidin sentetik bir formu kullanılmalı ve biyolojik aktivite için doğrulanmalıdır.
Genel olarak, nöropeptit analizi için burada örneklenen iş akışı, çeşitli farklı alanlara fayda sağlayabilir. Peptitlerin orta-aşağı MS analizindeki teknik bir boşluğu doldurur, çünkü tipik olarak aşağıdan yukarıya veya yukarıdan aşağıya MS analizleri ile analiz edilen proteinlerden daha küçük olan endojen peptitler için optimize edilmiştir. Bu nedenle, nöropeptidomikler tarafından kullanılan numune hazırlama yöntemleri, tıbbi kimyagerler tarafından antibakteriyel özellikler için hedeflenenler gibi diğer biyoaktif endojen peptitlere büyük ölçüde çevrilebilir olmalıdır35. Bu protokolün bir yararı, ek bir çevrilebilirlik derecesi sunan popüler satıcılardan ortak enstrümanlar kullanmasıdır. Bu şekilde, iş akışı, farmasötik ilaç adaylarının veya ilaç hedeflerinin taranması gibi akademik ve ticari ortamlarda kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma Ulusal Bilim Vakfı (CHE-1710140 ve CHE-2108223) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından R01DK071801 hibesi ile desteklenmiştir. AP kısmen NIH Kimya-Biyoloji Arayüzü Eğitim Hibesi (T32 GM008505) tarafından desteklenmiştir. N.V.Q., Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü'nden Wisconsin-Madison Üniversitesi Kardiyovasküler Araştırma Merkezi'ne (T32 HL007936) Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmeti Ödülü kapsamında Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenmiştir. L.L., NIH hibeleri R56 MH110215, S10RR029531 ve S10OD025084'ün yanı sıra Wisconsin Mezunları Araştırma Vakfı ve Wisconsin-Madison Üniversitesi Eczacılık Fakültesi tarafından sağlanan fon ile Vilas Seçkin Başarı Profesörlüğü ve Charles Melbourne Johnson Profesörlüğünden finansman desteğini kabul etmek ister.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde - D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge - 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac - SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) - Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
- Hökfelt, T., et al.
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, P.
- Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
- Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
- Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
- Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
- Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
- Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
- Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
- Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
- Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
- Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
- Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
- Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
- Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
- Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737 (2021).
- DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
- Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
- Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
- Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S.
- DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).
- Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
- Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
- Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
- Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
- Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
- Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
- Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
- Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
- Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
- Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).
