Summary
A caracterização espectrométrica em massa dos neuropeptídeos fornece informações de sequência, quantitação e localização. Este fluxo de trabalho otimizado não é apenas útil para estudos de neuropeptídeos, mas também para outros peptídeos endógenos. Os protocolos aqui fornecidos descrevem a preparação da amostra, aquisição de MS, análise de MS e geração de neuropeptídeos de banco de dados usando LC-ESI-MS, spotting MALDI-MS e imagens MALDI-MS.
Abstract
Neuropeptídeos são moléculas de sinalização que regulam quase todos os processos fisiológicos e comportamentais, como desenvolvimento, reprodução, ingestão de alimentos e resposta a estressores externos. No entanto, os mecanismos bioquímicos e o complemento completo dos neuropeptídeos e seus papéis funcionais permanecem mal compreendidos. A caracterização desses peptídeos endógenos é dificultada pela imensa diversidade dentro dessa classe de moléculas sinalizadoras. Além disso, neuropeptídeos são bioativos em concentrações 100x - 1000x inferiores aos neurotransmissores e são propensos à degradação enzimática após a liberação sináptica. A espectrometria de massa (MS) é uma ferramenta analítica altamente sensível que pode identificar, quantificar e localizar analitos sem conhecimento a priori abrangente. É adequado para traçar neuropeptídeos globalmente e ajudar na descoberta de novos peptídeos. Devido à baixa abundância e alta diversidade química desta classe de peptídeos, vários métodos de preparação de amostras, parâmetros de aquisição de EM e estratégias de análise de dados foram adaptados a partir de técnicas de proteômica para permitir a caracterização ideal do neuropeptídeo. Aqui, são descritos métodos para isolar neuropeptídeos de tecidos biológicos complexos para caracterização, quantitação e localização de sequências usando cromatografia líquida (LC)-MS e desorpção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI)-MS. Um protocolo para preparar um banco de dados de neuropeptídeo do caranguejo azul, Callinectes sapidus, um organismo sem informações genômicas abrangentes, está incluído. Esses fluxos de trabalho podem ser adaptados para estudar outras classes de peptídeos endógenos em diferentes espécies usando uma variedade de instrumentos.
Introduction
O sistema nervoso é complexo e requer uma rede de neurônios para transmitir sinais através de um organismo. O sistema nervoso coordena informações sensoriais e resposta biológica. As interações complexas e complicadas envolvidas na transmissão de sinais requerem muitas moléculas de sinalização diferentes, como neurotransmissores, esteroides e neuropeptídeos. Como os neuropeptídeos são as mais diversas e potentes moléculas de sinalização que desempenham papéis-chave na ativação de respostas fisiológicas ao estresse e outros estímulos, é de interesse determinar seu papel específico nesses processos fisiológicos. A função neuropeptídeo está relacionada à sua estrutura de aminoácidos, que determina mobilidade, interação receptora e afinidade1. Técnicas como a histoquímica, importante porque os neuropeptídeos podem ser sintetizados, armazenados e liberados em diferentes regiões do tecido, e a eletrofisiologia têm sido empregadas para investigar a estrutura e função do neuropeptídeo 2,3,4, mas esses métodos são limitados pelo throughput e especificidade para resolver a vasta diversidade sequencial de neuropeptídeos.
A espectrometria de massa (MS) permite a análise de alto rendimento da estrutura e abundância do neuropeptídeo. Isso pode ser realizado através de diferentes técnicas de EM, mais comumente cromatografia-eletrospraização líquida MS (LC-ESI-MS)5 e desorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-MS)6. Utilizando medidas de massa de alta precisão e fragmentação de MS, a MS fornece a capacidade de atribuir sequência de aminoácidos e status de modificação pós-translacional (PTM) a neuropeptídeos de misturas complexas sem conhecimento a priori para ajudar na verificação de sua função 7,8. Além das informações qualitativas, a MS permite informações quantitativas de neuropeptídeos por meio de quantitação sem rótulos (LFQ) ou métodos baseados em rótulos, como rotulagem isotópica ou isobárica9. As principais vantagens do LFQ incluem sua simplicidade, baixo custo de análise e diminuição das etapas de preparação da amostra que podem minimizar a perda de amostras. No entanto, as desvantagens do LFQ incluem o aumento dos custos de tempo do instrumento, pois requer múltiplas réplicas técnicas para lidar com o erro quantitativo da variabilidade run-to-run. Isso também leva a uma diminuição da capacidade de quantificar com precisão pequenas variações. Os métodos baseados em rótulos são submetidos a uma variação menos sistemática, pois várias amostras podem ser rotuladas diferencialmente usando uma variedade de isótopos estáveis, combinados em uma amostra, e analisados através de espectrometria de massa simultaneamente. Isso também aumenta o rendimento, embora rótulos isotópicos possam ser demorados e caros para sintetizar ou comprar. A complexidade espectral do espectro de massa de varredura completa (MS1) também aumenta à medida que o multiplexing aumenta, o que diminui o número de neuropeptídeos únicos capazes de ser fragmentados e, portanto, identificados. Por outro lado, a rotulagem isobárica não aumenta a complexidade espectral no nível MS1, embora introduza desafios para analitos de baixa abundância, como neuropeptídeos. Como a quantitação isobárica é realizada no nível de espectro de massa de íons de fragmento (MS2), neuropeptídeos de baixa abundância podem ser incapazes de ser quantificados, pois componentes matriciais mais abundantes podem ser selecionados para fragmentação e aqueles selecionados podem não ter abundância alta o suficiente para serem quantificados. Com rotulagem isotópica, a quantitação pode ser realizada em todos os peptídeos identificados.
Além da identificação e quantificação, as informações de localização podem ser obtidas pela MS através de imagens MALDI-MS (MALDI-MSI)10. Ao rasterar um laser através de uma superfície de amostra, os espectros ms podem ser compilados em uma imagem de mapa de calor para cada valor m/z . Mapear a intensidade do sinal de neuropeptídeo transitório em diferentes regiões em condições pode fornecer informações valiosas para a determinação da função11. A localização de neuropeptídeos é especialmente importante porque a função neuropeptídeo pode diferir dependendo do local12.
Neuropeptídeos são encontrados em menor abundância in vivo do que outras moléculas de sinalização, como neurotransmissores, e assim requerem métodos sensíveis para detecção13. Isso pode ser alcançado através da remoção de componentes de matriz de maior abundância, como lipídios11,14. Considerações adicionais para a análise de neuropeptídeos precisam ser feitas quando comparadas aos fluxos de trabalho proteômicos comuns, principalmente porque a maioria das análises neuropeptidômicas omitem a digestão enzimática. Isso limita as opções de software para análise de dados de neuropeptídeos, pois a maioria foi construída com algoritmos baseados em dados de proteômica e correspondências de proteínas informadas pela detecção de peptídeos. No entanto, muitos softwares como o PEAKS15 são mais adequados à análise de neuropeptídeos devido às suas capacidades de sequenciamento de novo. Vários fatores precisam ser considerados para a análise de neuropeptídeos a partir do método de extração à análise de dados em MS.
Os protocolos descritos aqui incluem métodos para preparação de amostras e rotulagem isotópica de dimetila, aquisição de dados e análise de dados de neuropeptídeos por LC-ESI-MS, MALDI-MS e MALDI-MS. Através de resultados representativos de vários experimentos, demonstra-se a utilidade e a capacidade desses métodos de identificar, quantificar e localizar neuropeptídeos de caranguejos azuis, Callinectes sapidus. Para entender melhor o sistema nervoso, os sistemas de modelos são comumente usados. Muitos organismos não têm um genoma totalmente sequenciado disponível, o que impede a descoberta abrangente de neuropeptídeos no nível do peptídeo. Para mitigar esse desafio, está incluído um protocolo de identificação de novos neuropeptídeos e mineração de transcriptome para gerar bancos de dados para organismos sem informações completas do genoma. Todos os protocolos aqui apresentados podem ser otimizados para amostras de neuropeptídeos de qualquer espécie, bem como aplicados para a análise de quaisquer peptídeos endógenos.
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Protocol
Todas as amostras de tecido descritas foram realizadas em conformidade com as diretrizes da Universidade de Wisconsin-Madison.
1. Análise LC-ESI-MS de neuropeptídeos
- Extração e desalamento de neuropeptídeos
- Antes da aquisição de tecidos, prepare o metanol acidificado (acMeOH) (90:9:1 MeOH:água:ácido acético) como descrito em16.
- Colete tecido cerebral do crustáceo17 e use fórceps para colocar imediatamente um tecido cada um em um tubo de 0,6 mL contendo 20 μL de acMeOH.
NOTA: Os protocolos de dissecção de tecidos variam muito para diferentes animais e diferentes tipos de tecidos. O leitor é encaminhado ao protocolo17 para uma descrição detalhada sobre como dissecar tecido cerebral e vários outros tipos de tecido do crustáceo. As amostras podem ser armazenadas a -80 °C até o uso (idealmente dentro de 6 meses). Os volumes descritos são usados para um único cérebro de Callinectes sapidus. Os volumes devem ser dimensionados para o tamanho do tecido. O tecido pode ser congelado imediatamente sem solvente, embora isso não seja recomendado, pois enzimas proteolíticas endógenas não serão inibidas e permanecerão ativas, embora a uma taxa mais lenta quando frias. - Adicione 150 μL de acMeOH à amostra. Defina o tempo total de sônica para 24 s, o tempo de pulso para 8 s, o tempo de pausa para 15 s e a amplitude para 50% em um homogeneizador ultrassônico e homogeneize as amostras no gelo.
NOTA: Existem diferentes sistemas de homogeneização disponíveis. Ajuste as configurações e condições de acordo com o tipo de amostra e o equipamento. - Centrifugar a amostra a 4 °C a 20.000 x g por 20 min. Com uma pipeta, transfira o supernasal em um tubo e seque-o em um concentrador de vácuo (266 x g, 1 x 10-4 Torr) a aproximadamente 35 °C.
NOTA: As amostras secas podem ser armazenadas a -80 °C até o uso (idealmente dentro de 6 meses). O aquecimento do concentrador de vácuo deve ser realizado com cautela. Enquanto o calor encurta o tempo seco, a amostra deve ser removida do concentrador imediatamente depois de todo o líquido ter evaporado para minimizar a degradação do peptídeo. Para evitar isso, o aquecimento pode ser omitido desta e de todas as etapas subsequentes. - Para desalar, reconstitua a amostra de tecido extraído em 20 μL de ácido fórmico (FA), vórtice bem e sonicato em banho-maria à temperatura ambiente por 1 min.
NOTA: Existem diferentes materiais de desalhados disponíveis. Ajuste as soluções e volumes de acordo com a identidade de resina e a quantidade de neuropeptídeo. A quantidade total de peptídeo pode ser estimada usando um ensaio comercial de quantitação de peptídeos (ver Tabela de Materiais) . - Aplique 0,5 μL de amostra em uma tira de pH para confirmar que pH < 4. Se o pH for maior, adicione 1 μL alíquotas de FA de 10% até que o pH < 4.
- Siga o protocolo do fabricante para desalar18. Prepare uma solução de molhar contendo 100 μL de acetonitrilo de 50% (ACN), solução de equilíbrio contendo 100 μL de 0,1% fa, solução de lavagem contendo 100 μL de FA de 0,1% e soluções de eluição contendo 20 μL de 25% ACN/0,1% FA, 20 μL de 50% ACN/0,1% FA e 20 μL de 75% ACN/0,1% FA.
- Obtenha uma ponta de desalh de 10 μL com resina C18 (ver Tabela de Materiais).
- Coloque a ponta de desalar em uma pipeta de 20 μL que está definida para 15 μL. Uma vez que a ponta de desalada esteja molhada, evite que o ar passe mantendo a pipeta deprimida quando estiver fora de solução até que seja descartada.
- Aspire a ponta 3x com solução de molhar e 3x com solução de equilíbrio. Aspirar na amostra 10x seguido de lavar 3x na solução de lavagem, descartando cada lavagem. Elute aspirando 10x em cada uma das soluções de elução para aumentar a ACN.
NOTA: As frações de elução podem ser mantidas separadas ou combinadas para análises posteriores. - Descarte a ponta de desalamento usada e seque os neuropeptídeos elucidos em um concentrador de vácuo (266 x g, 1 x 10-4 Torr) a aproximadamente 35 °C.
NOTA: Pode ser armazenado a -80 °C até o uso (idealmente dentro de 6 meses).
- Rotulagem isotópica de neuropeptídeos no extrato de tecido
NOTA: Esta etapa é opcional e só é usada quando deseja a quantificação.- Prepare a solução de rotulagem de dimetil isotópica de 2 plex em um capô de fumaça: 1% CH2OH2 (13,5 μL de estoque 37 percentual de peso/peso (wt. %) na solução de água em 486,5 μL de água), 1% CH2OD2 (25 μL de estoque 20 wt. % solução em 475 μL de água) e 0,03 M borane pyridina (3,75 μL de estoque 8 M solução em 996,25 μL de água).
ATENÇÃO: O formaldeído é tóxico, por isso todas as soluções devem ser mantidas em um capô ventilado. Use luvas, jaleco, proteção ocular e calçados impermeáveis. As lentes de contato não devem ser usadas ao trabalhar com este material.
NOTA: Existem diferentes reagentes isotópicos; selecione os apropriados com base no tipo de amostra e no número de canais de rotulagem desejados. - Dissolver extrato de neuropeptídeo bruto em 10 μL de água e sonicato por 10 minutos.
- Adicione 10 μL de uma solução de formaldeído isotópica diferente (ou seja, CH2OH2, CH2OD2, etc.) a cada condição experimental diferente a ser medida quantitativamente. Vórtice para misturar bem e centrifugar brevemente cada amostra a 2.000 x g.
- Adicione 10 μL de 0,03 M de piraidina de borano a cada tubo de amostra. Vórtice para misturar bem e centrifugar brevemente cada amostra a 2.000 x g.
- Incubar as amostras por 15 min a 37 °C em banho-maria.
- Remova as amostras do banho de água e adicione 10 μL de 100 mM de bicarbonato de amônio. Vórtice para misturar bem e centrifugar brevemente cada amostra a 2.000 x g.
- Combine as amostras rotuladas para uma amostra de 2 plex e seque os neuropeptídeos em um concentrador de vácuo (266 x g, 1 x 10-4 Torr) a aproximadamente 35 °C.
- Desaltar os neuropeptídeos rotulados reperformando as etapas 1.1.5 - 1.1.10 e armazená-las até estar pronta para aquisição de dados.
- Prepare a solução de rotulagem de dimetil isotópica de 2 plex em um capô de fumaça: 1% CH2OH2 (13,5 μL de estoque 37 percentual de peso/peso (wt. %) na solução de água em 486,5 μL de água), 1% CH2OD2 (25 μL de estoque 20 wt. % solução em 475 μL de água) e 0,03 M borane pyridina (3,75 μL de estoque 8 M solução em 996,25 μL de água).
- Aquisição de Dados
- Reconstitua os neuropeptídeos secos dessaptídeos em 12 μL de 3% ACN/0,1% FA, bem vórtice, sonicato em banho de água de 37 °C por 1 min, e brevemente centrífuga a 2.000 x g. Transfira cada amostra em frascos de autosampler.
NOTA: Ajuste o volume da amostra de acordo com a quantidade de neuropeptídeo para uma concentração de ~1 μg de peptídeo por μL. A quantidade total de peptídeo pode ser estimada usando um ensaio comercial de quantitação de peptídeo (ver Tabela de Materiais) . - Use um autosampler para injetar 1 μL de amostra em um instrumento nano-LC-MS/MS de alta resolução (ver Tabela de Materiais).
- Use uma coluna C18 de fase invertida de aproximadamente 15 cm de comprimento (RP) (ver Tabela de Materiais) para executar a amostra com 0,1% fa na água como fase móvel A e 0,1% FA na ACN como fase móvel B. Execute as amostras com um gradiente de 3% - 95% de B a uma taxa de 300 nL/min por mais de 11 min.
- Para o instrumento MS utilizado aqui, utilize condições comuns de MS de 2,00 kV para tensão de pulverização e 275 °C para temperatura capilar.
- Adquirir espectros MS na faixa de 200 - 2.000 m/z com resolução de 60.000, controle automático de ganho (AGC) alvo de 1 x 106, e tempo máximo de injeção de íons (TI) de 150 ms.
- Selecione os 15 íons mais intensos (intensidade mínima de 3,2 x 104) para fragmentação de colisão de maior energia (HCD) utilizando uma energia de colisão normalizada de 30, janela de isolamento de 2,0 m/z, resolução de 15.000, uma meta AGC de 2 x 105, e TI máxima de 250 ms.
- Defina uma janela de exclusão dinâmica de 30 s. Exclua íons com carga de 1 ou ≥ 8 e íons com estados de carga não reconhecidos.
- Reconstitua os neuropeptídeos secos dessaptídeos em 12 μL de 3% ACN/0,1% FA, bem vórtice, sonicato em banho de água de 37 °C por 1 min, e brevemente centrífuga a 2.000 x g. Transfira cada amostra em frascos de autosampler.
- Identificação e quantificação do neuropeptídeo
NOTA: Muitos softwares para pesquisa de banco de dados e quantificação de peptídeos (tanto de código aberto quanto comercial) estão disponíveis. Aqui, o PEAKS Studio (software proteômica)15 será usado.- Realize a pesquisa de banco de dados usando as etapas descritas em 1.4.2 - 1.4.6.
- Crie um novo projeto e adicione os dados LC-MS selecionando Nenhum para a enzima, Orbitrap para o instrumento, HCD para o fragmento e aquisição dependente de dados (DDA) para aquisição.
NOTA: Selecione os parâmetros apropriados com base nos parâmetros de aquisição de dados. - Selecione Identificações e selecione Apenas Precursor Correto [DDA] e Massa.
- Selecione Pesquisa de banco de dados e defina uma tolerância de erro de 20,0 ppm usando massa monoisotópica para massa precursora e 0,02 Da para massa de íons fragmentados, Nenhum para tipo enzim, inespecífico para modo de digestão, 100 para decotes máximos perdidos e as seguintes PTMs variáveis com a variável máxima permitida PTM por peptídeo de 3: Amidação, Oxidação (M), Pyro-glu de, Eglu e Pyro-glu de Q.
- Selecione o Banco de Dados de Neuropeptídeos, estime a taxa de descoberta falsa (FDR) com fusão de isca.
NOTA: O erro de tolerância em massa deve ser ajustado para corresponder aos dados coletados. Use o banco de dados apropriado para o tipo de amostra. Quando nenhuma enzima é selecionada, o parâmetro máximo de decotes perdidos não afeta a pesquisa. No entanto, um grande número de decotes perdidos é necessário se o software não tiver o modo de digestão não especificado como uma opção. - Se for desejada quantificação sem rótulo, selecione Quantificação, selecione Label-Free e defina uma tolerância de erro de 20,0 ppm e tolerância ao tempo de retenção de 1,0 min.
- Realize a quantificação de íons precursores se a etapa 1.2 para rotulagem isotópica for realizada.
- Selecione Quantificação, selecione Quantificação de Íon Precursor, use um intervalo de tempo de retenção de 1,0 min e use um limiar FDR de 1%..
- Selecione um método de quantificação predefinido ou personalizado no menu suspenso Do método Select .
- Para criar um novo método personalizado, clique em Configuração de > de janela > Método Q de rótulo > novo. Nomeie o novo método e selecione Quantificação de Íon Precursor para Tipo de Método. Selecione Adicionar linha e selecione modificação na lista de opções PTM.
- Adicione os dados LC-MS e selecione Condição de Referência para ser a modificação dos neuropeptídeos da condição de controle do experimento.
- Avalie os resultados da pesquisa conforme descrito nas etapas 1.4.9 - 1.4.11.
- Filtre os resultados através da guia de resumo para peptídeos e proteínas com -10lgP ≥ 20, selecione ≥ 1 peptídeo exclusivo e selecione caixa rotulada com Peptídeos Significativos.
- Avalie os resultados de pesquisa do banco de dados onde a Protein.csv representa identificações de neuropeptídeos e Peptídeo.csv representa identificações de fragmentos de neuropeptídeos.
- Inspecione a pesquisa do banco de dados por escores de proteínas e peptídeos, precisão em massa e cobertura de sequência.
NOTA: Cada software de pesquisa de banco de dados usa algoritmos de pontuação únicos e pode precisar ser avaliado de acordo. As identificações podem ser avaliadas inspecionando manualmente os espectros observados para peptídeos identificados contendo a série completa de íons de fragmento.
2. ANÁLISE DE MANCHAS MALDI-MS de neuropeptídeos
- Preparação da amostra
- Siga o passo 1.1 ou as etapas 1.1 - 1.2 se a quantificação for desejada, excluindo a etapa 1.2.8 (a desalagem após a rotulagem isotópica não é necessária antes da análise MALDI-MS).
- Reconstitua os neuropeptídeos secos dessacados em 5 μL de 0,1% FA, bem vórtice, sonicato em um banho de água de 37 °C por 1 min, e brevemente centrífuga a 2.000 x g.
- Para detectar neuropeptídeos em tecidos crustáceos, prepare 150 mg/mL 2,5-dihidroxibenóico ácido (DHB) em 50% de metanol (MeOH)/0,1% FA (v/v) como matriz.
- Pipeta uma gotícula de 3 μL de amostra em uma película hidrofóbica (ver Tabela de Materiais) e pipeta 3 μL da matriz diretamente na gotícula da amostra. Pipeta para cima e para baixo para misturar.
- Pipeta 1 μL da amostra 1:1: mistura matricial em um poço da placa de aço inoxidável MALDI. Use a ponta da pipeta para espalhar cada mistura para as bordas da amostra bem. A amostra deve tocar as bordas da gravura do poço para facilitar a distribuição uniforme (Figura 4A).
- Ponto 1 μL de 1:1 calibrante:mistura de matriz (mistura comercial ou personalizada de calibração, materiais de polímero (ou seja, fósforo vermelho dissolvido em MeOH), ou íons comuns de aglomerados de matriz)12 em um poço perto da amostra.
NOTA: O fósforo vermelho não precisa ser misturado com matriz antes de detectar.
- Aquisição de dados
- Insira a placa-alvo contendo manchas de amostra seca no instrumento MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) (ver Tabela de Materiais).
- Para a matriz DHB, defina a potência laser para 95%, selecione O Ganho Automático do Detector Ideal e o modo de movimento do portador da amostra inteligente - amostra completa . Adquira espectros ms na faixa de 200 a 3200 m/z e adicione vários espectros de cada ponto juntos para aumentar a relação sinal-ruído de neuropeptídeo.
NOTA: Otimize a porcentagem de potência a laser, o ganho do detector e selecione o modo de movimento adequado do portador da amostra para que cada aquisição cubra aproximadamente todo o local e as aquisições subsequentes não vão para as posições anteriores. - Calibrar o instrumento.
NOTA: Ajuste a faixa de massa para abranger a faixa de neuropeptídeo desejada.
- Análise de dados
- Abra o arquivo MALDI-MS no software de análise de dados (ver Tabela de Materiais) e clique em Subtração de Linha de Base para o software usado aqui.
- Execute a escolha de pico clicando em "Encontrar lista de massas". Se houver poucos picos, edite a lista de massa manualmente selecionando Editar lista de massas e clique em picos no espectro para adicioná-los à lista de massa.
- Execute uma correspondência de massa precisa comparando a lista de massa com o banco de dados de neuropeptídeos contendo valores [M+H]+ m/z (± erro de 200 ppm).
NOTA: Adutos comuns de sal, como [M+K]+, [M+Na]+, e [M+NH4]+, também devem ser incluídos na lista de alvos de correspondência de massa precisa. - Para verificar os picos identificados, gere uma lista de m/z de interesse e realize experimentos de MS/MS.
3. ANÁLISE DE IMAGEM MALDI-MS de neuropeptídeos
- Preparação da amostra
NOTA: As etapas de incorporação e secção não são necessárias para que os tecidos muito finos sejam seccionados.- Encha meio copo criostat com gelatina (37 °C, 100 mg/mL em água deionizada) e deixe-o solidificar à temperatura ambiente. Mantenha a gelatina líquida restante quente em um banho de água de 37 °C.
- Colete tecido neuronal desejado do animal e use fórceps para mergulhar imediatamente o tecido em um tubo de 0,6 mL contendo água deionizada para 1 s.
NOTA: Consulte a etapa 1.1.2 NOTA para dissecção do tecido neuronal. - Coloque o tecido em cima da gelatina sólida e encha o resto do copo criostat com gelatina líquida. Use fórceps para posicionar o tecido.
- Coloque o copo criostat em uma superfície plana e congele com gelo seco.
NOTA: Armazene amostras a -80 °C até usar (idealmente dentro de 6 meses). - Para a preparação da secção, separe a amostra embutida de gelatina do molde criostat, cortando o molde.
- Monte o tecido incorporado em um mandril criostat, canalizado uma gota de 1 mL de água desionizada no mandril e pressione imediatamente o tecido incorporado na gotícula.
- Uma vez congelada, a pipeta mais água deionizada ao redor do tecido para fixá-lo ainda mais no mandril. Execute estas etapas dentro da caixa criostat (ver Tabela de Materiais) definida a -20 °C.
- Se sectionia o tecido em uma espessura aproximada de uma célula (8-20 μm dependendo do tipo de amostra) e descongele montar cada seção em um deslizamento de vidro revestido de óxido de lata de índio (ITO) colocando um lado da lâmina perto da seção e colocando um dedo do outro lado da lâmina para aquecer lentamente o vidro e permitir que a seção grude no slide.
NOTA: As seções teciduais também podem ser montadas com degelo, pegando uma borda da gelatina com pinças (refrigerada a -20 °C), colocando-a no slide de vidro revestido de ITO e colocando um dedo do outro lado do slide para aquecer lentamente o vidro e permitir que a seção grude no slide. - Localizá-lo como calibrante (ver passo 2.1.6 para opções calibrantes) desenhando um pequeno círculo perto da seção de tecido usando uma caneta hidrofóbica e detectando o calibrador dentro do círculo.
- Marque cada canto do slide com uma caneta branca com uma pequena forma contendo bordas afiadas (ou seja, x) para ser usada como pontos de ensino.
- Coloque o deslizamento de vidro na placa do adaptador de slides MALDI e faça uma varredura óptica de imagem óptica de alta resolução (≥2400 DPI) usando um scanner.
- Matriz de pulverização na seção de tecido usando um pulverizador automatizado (consulte Tabela de Materiais para obter detalhes e instruções do pulverizador).
- Para o MSI de neuropeptídeos em tecidos crustáceos use 40 mg/mL DHB em 50% de metanol/0,1% FA (v/v) como matriz, definir a temperatura do bocal para 80 °C, velocidade para 1.250 mm/min, vazão para 0,1 mL/min, número de passes para 12 e 30 s entre cada passe para o pulverizador automático.
- Aquisição de dados
- Insira a placa alvo completamente seca contendo seções de tecido montadas com degelo que foram pulverizadas com a matriz.
- Configure os parâmetros do arquivo de aquisição de imagens MS para que o diâmetro do laser seja menor do que o tamanho do passo raster.
- Carregue a imagem óptica digitalizada e calibrar a placa de amostra usando os pontos de ensino x. Defina as áreas de interesse do tecido a serem medidas ligeiramente maiores do que a seção de tecido real para incluir também áreas que contenham apenas matriz.
- Calibrar o instrumento e adquirir espectros na faixa de 200 a 3200 m/z. Ajuste a faixa de massa para abranger a faixa de neuropeptídeo desejada.
- Análise de dados
- Para processar dados, importe o conjunto de dados de imagem MS no software desejado, selecione um algoritmo de remoção de linha de base e normalize os dados usando a Contagem total de íons.
NOTA: A seleção de diferentes algoritmos de normalização, como o valor médio, o valor médio médio do quadrado (RMS) ou a intensidade de um valor de referência m/z , provavelmente alterará a distribuição espacial de muitos valores de m/z . Escolha o algoritmo de normalização mais adequado para analitos desejados. - Para gerar uma imagem para cada valor m/z a partir de uma lista de picos teóricos, carregue um arquivo de valores separados por címula (CSV) contendo neuropeptídeo [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, etc. Obtenha valores m/z clicando em Arquivo > Importar > Lista de Pico. Diga o nome da lista de picos.
- Para estimar o limiar de erro ppm apropriado, primeiro identifique manualmente um pico de neuropeptídeo no espectro de MS e compare-o com a massa teórica do neuropeptídeo. Calcule o erro ppm e clique em Propriedades de arquivo > arquivo > largura de intervalo e erro de ppm de entrada.
- Selecione a lista de picos no menu suspenso e clique em Criar imagens m/z para cada intervalo da lista de picos.
- Salve cada imagem m/z clicando em Salvar captura de tela de cada m/z imagem.
NOTA: A identificação de neuropeptídeos putativos pode ser realizada identificando imagens m/z onde o sinal de analito é localizado apenas dentro do tecido e não na matriz circundante. - Para verificar a identidade máxima, gere uma lista de m/z de interesse e realize experimentos de MS/MS.
- Para processar dados, importe o conjunto de dados de imagem MS no software desejado, selecione um algoritmo de remoção de linha de base e normalize os dados usando a Contagem total de íons.
4. Descobrir novos neuropeptídeos putativos usando de novo sequenciamento
- Realizar etapas 1.4.2 - 1.4.5.
- Exportação de novo apenas peptídeos.csv do software PEAKS com uma pontuação média de confiança local (ALC) de ≥ 75.
NOTA: Existem muitos softwares disponíveis para realizar o novo sequenciamento, cada um com seus próprios algoritmos de pontuação e deve ser avaliado de acordo. - Pesquise na lista de peptídeos por motivos de sequência conhecidos indicativos de neuropeptídeos pertencentes a famílias específicas de neuropeptídeos19.
NOTA: Embora os motivos sejam comumente bem conservados entre as espécies, os motivos pesquisados devem ser selecionados com consideração ao organismo amostral.
5. Mineração de transcriptome para sequências de neuropeptídeos previstas
NOTA: Esta etapa é opcional e usada apenas para adicionar a um banco de dados de neuropeptídeo existente ou construir um novo banco de dados de neuropeptídeos.
- Escolha uma sequência de aminoácidos préprohormone conhecida de interesse e use tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
_LOC=blasthome) para pesquisar a sequência de préprohormona de consulta em bancos de dados incluindo nr/nt, Refseq_genomes, EST e TSA.
NOTA: Para pesquisar sequências de consultas contra banco de dados de proteínas, use BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).- Selecione o organismo alvo (id fiscal) e altere os parâmetros do algoritmo Expect Threshold para 1000 para incluir alinhamentos de pontuação baixa.
- Execute o programa BLAST e, em seguida, verifique os resultados para obter altos escores de escoologia entre consulta e sequências de assunto produzindo alinhamentos significativos. Salve o arquivo FASTA contendo sequência de nucleotídeos.
NOTA: Se houver várias sequências de sujeitos com pontuações de escoologia semelhantes, realize um alinhamento MAFFT para reduzir as sequências putativas20,21.
- Traduza a sequência de nucleotídeos préprohormona em sequências de peptídeos préprohormone usando a ferramenta Expasy Translate (https://web.expasy.org/translate/). Para C. sapidus, selecione Invertebrado Mitocondrial para código genético.
- Verifique se há sequência de peptídeos de sinal e locais de decote de prohormone nas sequências de peptídeos usando SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
NOTA: A homologia de esquemas de processamento préprohormone conhecidos também pode ser usada para identificar locais de decote prohormone. Possíveis modificações pós-translacionais para peptídeos de sinal podem ser previstas se desejarem. Sulfinador (https://web.expasy.org/sulfinator/) pode ser usado para prever o estado de sulfação de resíduos de tyrosina. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) pode ser usado para prever a conectividade de ligação de dissulfeto.
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Representative Results
O fluxo de trabalho para preparação da amostra e análise de MS é retratado na Figura 1. Após a dissecção do tecido neuronal, a homogeneização, extração e dessacração são realizadas para purificar amostras de neuropeptídeos. Se a quantificação isotópica à base de rótulo for desejada, as amostras ão então rotuladas e desálvadas mais uma vez. A amostra resultante é analisada através de LC-MS/MS para identificação e quantificação de neuropeptídeos.
Neuropeptídeos identificados através do software de proteômica devem ter uma boa cobertura de sequência de fragmentação de peptídeos, no entanto, isso não é definido globalmente ou padronizado. Para identificação absoluta, cada aminoácido deve produzir um íon fragmentado que forneça identificação e localização inequívocas. Isso também deve ser comparado com um peptídeo sintetizado para confirmação da intensidade de cada íon fragmento. Como o custo para realizar isso em cada identificação putativa não é viável, a identificação é comumente descrita com base na confiança, onde íons de fragmentos mais observados aumentam a confiança de identificação de peptídeos. Enquanto a Figura 2A,B retrata dois neuropeptídeos que foram identificados com cobertura de sequência de 100% e um erro de massa baixo, definido pelo limite máximo de 0,02 Da, a baixa cobertura de fragmentação (de apenas três íons) observada apenas para o neuropeptídeo na Figura 2B diminui a confiança de identificação de uma isoforme específica. A Figura 2C retrata os cromatógramas de íons extraídos (XICs), que é um enredo contendo a intensidade do sinal de um valor de m/z selecionado em função do tempo de retenção, de um neuropeptídeo detectado em duas amostras usadas para LFQ. Os tempos de retenção do neuropeptídeo diferem ligeiramente porque foi identificado em duas corridas separadas e consecutivas; no entanto, a diferença está dentro do valor limiar confiável de 1 min. Assim, a razão entre a área calculada por software sob a curva do XIC é usada para o LFQ deste neuropeptídeo.
Para a quantificação de neuropeptídeos rotulados por dimetila, o espectro MS1 deve conter um pico no valor teórico neuropeptídeo m/z e um pico no valor m/z com uma mudança de massa que se correlaciona com a diferença de massa entre os reagentes isotópicos de rotulagem utilizados. Na Figura 2D, a mudança de massa desta amostra de 2 plex dimetil rotulado é de 4.025 Da. A área sob a curva do íon precursor de seus XICs é então calculada pelo software e usada para calcular proporções relativas de abundância. Uma versão simplificada da tabela de exportação de software proteômica contendo neuropeptídeos identificados e suas razões LFQ é mostrada na Tabela 1. Resultados semelhantes são obtidos para neuropeptídeos isotopéticamente rotulados.
Algoritmos de software permitem o sequenciamento de novo de espectro para detectar novos neuropeptídeos putativos. Ao reivindicar a detecção de neuropeptídeos putativos novos, identificações de alta confiança são casos ideais onde todos os aminoácidos são identificados e localizados de forma inequívoca, com base na observação de íons fragmentados. A Figura 3 retrata o espectro de um peptídeo sequenciado de novo contendo o motivo -RYamida no terminal C, um motivo de sequência conservado compartilhado por neuropeptídeos conhecidos da família RYamidacrustácea 22. Um peptídeo foi combinado do banco de dados com cobertura de sequência de 100%, todos os aminoácidos formando íons fragmentados observados, erro de massa de íon de baixo fragmento definido pelo limite máximo de 0,02 Da e continha um perfil de eluição gaussiana. Esses resultados indicam que foi observado um peptídeo endógeno pertencente à família de neuropeptídeos crustáceos -RYamida.
As medidas pontuais maldi-MS podem fornecer identificações de neuropeptídeos complementares à identificação LC-ESI-MS, bem como oferecer maiores recursos de rendimento. Após a homogeneidade do tecido bruto ser extraída para neuropeptídeos, desseladas e rotuladas (se desejarem), a amostra pode ser misturada com matriz e avistada na placa alvo de aço inoxidável MALDI, como mostrado na Figura 4A. A pipetação bem sucedida de manchas de amostra homogênea produz picos claramente resolvidos, especialmente dentro do espectro de calibração (Figura 4B). Ao utilizar um instrumento MALDI-TOF, o instrumento deve ser calibrado no início de cada experimento. Qualquer analito com massas conhecidas pode ser usado para calibrar o instrumento se estiver dentro da faixa de massa desejada da amostra. Aqui, o fósforo vermelho é usado para a calibração de massa de íons positivos do instrumento. Tem vantagens sobre o uso de misturas de calibração de peptídeos devido à sua estabilidade à temperatura ambiente, custo barato, picos abundantes devido à sua polimerização, alta relação sinal-ruído, e não requer uma matriz para ionização.
Para a imagem MALDI-MS de neuropeptídeos, o instrumento MALDI TOF/TOF utilizado requer calibração manual de imagem do slide revestido de ITO (passo 3.1.10) para correlacionar a imagem óptica com a amostra. O diagrama na Figura 5 mostra a colocação adequada da mira whiteout a ser usada como pontos de ensino para permitir que o instrumento correlacione a imagem óptica digitalizada com a placa de amostra real. Também ilustra áreas do slide revestido de ITO que devem ser evitadas pelo usuário (ou seja, não contêm amostra ou matriz). Para a calibração em massa, a colocação da mancha da amostra de calibração em relação à amostra de tecido no slide revestido da ITO impacta diretamente o erro de massa devido à natureza inerente dos analisadores de massa tempo de voo, embora a magnitude deste problema dependa da abundância dos analitos alvos. Uma solução para este problema é verificar manualmente os picos do espectro MS1 de diferentes seções teciduais para obter evidências de mudança de pico. Se houver mudança de pico, considere adicionar pontos adicionais de calibração de massa no slide revestido de ITO ao lado de cada seção de tecido. A partir daí, o usuário pode mediar os espectros dos pontos de calibração juntos ou realizar imagens de MS em uma seção de tecido de cada vez usando apenas o ponto de calibração mais próximo da seção tecidual. Após a coleta da amostra, verifique se o sinal dos valores m/z correspondentes aos neuropeptídeos só é localizado dentro da região tecidual (Figura 6) antes de atribuir uma identificação de neuropeptídeo putativo.
Figura 1: Fluxo de trabalho de preparação da amostra de neuropeptídeo para análise de espectrometria de massa. Para análise de extrato de tecido, o tecido cru homogenate é desálado, rotulado com rótulos isotópicos estáveis, desálido novamente e analisado por ESM. Para análise de imagem, o tecido intacto é incorporado, criosectionado, aplicado com matriz e analisado pelo MALDI-MSI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Identificação e quantificação realizadas através do software de proteômica. Neuropeptídeos são detectados através de espectros de qualidade variando com (A) boa ou (B) má cobertura de fragmentação MS2. O erro de correspondência de massa de íons de fragmento é mostrado abaixo do espectro. (C) As formas de perfil XIC e o tempo de retenção (RT) podem ser inspecionados manualmente para neuropeptídeos quantificados através do LFQ. (D) Os espectros MS1 são usados para detectar e quantificar neuropeptídeos rotulados por dimetila. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: De novo sequenciamento para detecção de novo neuropeptídeo. (A) O espectro MS2 de um romance putativo RYamida demonstra boa cobertura de fragmentação com baixo erro de massa para cada fragmento. (B) Os íons de fragmentos identificados estão listados para inspeção manual. (C) O XIC do novo neuropeptídeo é inspecionado manualmente para a forma de pico gaussiana. Abreviaturas: RT = tempo de retenção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Manchas MALDI-MS e espectro de calibração. (A) A qualidade dos espectros ms depende da distribuição uniforme de peptídeos matricial no poço de aço inoxidável MALDI. Os três pontos esquerdos são exemplos de bons pontos que tocam as bordas da gravura do poço e os três pontos certos são exemplos de pontos ruins. Ambos os pontos contêm matriz de ácido α-Cyano-4-hidroxicinâmico (CHCA) e uma mistura padrão de peptídeos. (B) Espectro de calibração utilizando aglomerados de fósforo vermelho de 500 a 3200 m/z. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Representação de lâmina de vidro revestida de ITO. (A) Esquema com áreas importantes anotadas: locais para colocar seções de tecido (retângulos azuis claros), locais automáticos de pontos de ensino que devem ser evitados (retângulos vermelhos), locais de exemplo de onde os pontos de ensino podem ser desenhados (mira branca) e onde os parafusos se prendem à placa do adaptador e devem ser evitados (ovalos azuis escuros). (B) Foto de lâmina de vidro contendo duas seções de tecido, um ponto contendo uma mistura de calibração e marcas de mira. A localização da seção tecidual e os pontos de calibração são delineados do outro lado da lâmina de vidro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagens em MS das glândulas c. sapidus sinus. Imagens de distribuição de íons neuropeptídeos [M+H]+ de (A) HL/IGSL/IYRamide (m/z 844,48), (B) Allatostatin A-type NPYAFGLamide ou GGPYAFGLamide (m/z 2 São mostrados 780,40), (C) Allatostatin A-type GQYAFGLamide (m/z 754,39) e (D) RFamide GRNFLRFamida (m/z 908,52). As imagens são geradas usando uma janela de ± de 50 ppm do valor teórico m/z . A barra de cor indica a faixa de intensidade do sinal de 0 a 100%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Pesquisa de banco de dados e resultados do LFQ. Neuropeptídeos identificados e quantificados através do software LC-MS e proteômica. Os PTMs identificados são listados juntamente com as intensidades de peptídeos detectados em ambas as amostras para LFQ, juntamente com a razão LFQ resultante. As massas médias e as descrições observadas de neuropeptídeos do arquivo FASTA estão listadas. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
A identificação precisa, quantificação e localização de neuropeptídeos e peptídeos endógenos encontrados no sistema nervoso são cruciais para entender sua função23,24. A espectrometria de massa é uma técnica poderosa que pode permitir que tudo isso seja realizado, mesmo em organismos sem um genoma totalmente sequenciado. A capacidade deste protocolo de detectar, quantificar e localizar neuropeptídeos a partir de tecido coletado de C. sapidus através de uma combinação de LC-ESI- e MALDI-MS é demonstrada.
Durante a preparação da amostra para a análise LC-ESI-MS, devem ser feitas considerações. Embora a ESM seja uma técnica sensível, a baixa concentração de peptídeos do tecido neuronal (até a faixa femtomolar25) representa uma séria limitação. A preparação cuidadosa da amostra é necessária para não apenas remover componentes matriciais mais abundantes e interferentes, como proteínas e lipídios, mas também minimizar a perda de neuropeptídeos em cada etapa26,27. Por exemplo, a perda de amostras pode ser reduzida usando tubos de microcentrifuuge que resistem à adsorção de peptídeos. Dependendo da composição do tecido de interesse, o uso de vários solventes (para extração ou precipitação) ou materiais de extração em fase sólida pode ser utilizado para separar biomoléculas com diferentes tamanhos e propriedades químicas. Para garantir que peptídeos hidrofílicos ou hidrofóbicos estejam presentes no extrato de neuropeptídeos, sistemas de solventes de extração múltipla podem ser usados opcionalmente para atingir neuropeptídeos com diferentes propriedades fisicoquímicas. Estes, juntamente com o uso de inibidores de protease, podem precisar ser modificados para purificação otimizada para melhorar a recuperação de neuropeptídeos28. As desvantagens do uso de múltiplos sistemas de extração são que vários tecidos neuronais precisam ser agrupados para atender a um requisito geral de maior teor de peptídeos, bem como diminuição do throughput. Muitos passos como desalar, rotulagem isotópica e injeção de MS recomendam certas quantidades de peptídeo inicial. Para a caracterização de amostras preciosas, como neuropeptídeos, os ensaios de peptídeos são geralmente evitados para evitar o consumo de peptídeos ínteuos. Além disso, foram desenvolvidos ensaios de peptídeos para determinar a concentração precisa de peptídeos a partir de digestões proteicas, que têm propriedades químicas diferentes dos peptídeos endógenos. Para superar complicações da concentração de neuropeptídeos desconhecidos, um ensaio inicial de peptídeos pode ser realizado usando extratos de tecido neuronal agrupados, onde os resultados são usados como estimativa para todas as análises subsequentes, embora seja necessário ter em mente que todos os peptídeos em solução são medidos, e nem todos estes são neuropeptídeos29. Outras limitações deste método incluem vieses potenciais a neuropeptídeos não polídos e hidrofóbicos e a falta de conservação de estruturas nativas. Podem ser realizadas modificações em composições e materiais solventes, como o uso de soluções mais hidrofóbicas ou omitidas do uso de solventes orgânicos para lidar com isso.
As medidas maldi-MS dependem de etapas cuidadosas de preparação de amostras para resultados consistentes e podem ter considerações amostrais diferentes das medidas LC-ESI-MS. Etapas como manter o extrato de neuropeptídeo no gelo antes da análise de EM ainda são aplicadas. Métodos adicionais de prevenção da degradação do neuropeptídeo incluem manter lâminas de vidro contendo seções de tecido montadas no degelo em uma caixa de dessecante após dissecção para evitar que a condensação acumule30, embora deixar a amostra de tecido no dessecador depois de secar também pode resultar em degradação amostral. Colocar os slides teciduais em um desiccador a vácuo (pressão final: 1x10-4 Torr à temperatura ambiente) por 5-10 min imediatamente antes da aplicação da matriz é sugerido. Depois que a matriz é depositada na lâmina do tecido, ela pode ser mantida na geladeira ou freezer durante a noite e seca no desiccador de vácuo antes da medição de imagem MALDI-MS. Para medições de manchas MALDI, a estrutura cristalina matriz-peptídeo não é igualmente distribuída por todo o alvo MALDI, mesmo que pareça assim. Existem maneiras de mitigar as variações de espectros de massa a partir de réplicas técnicas devido a este processo. Primeiro, adquira um espectro médio de cada poço usando vários tiros a laser (tipicamente centenas a milhares) onde o laser é aleatoriamente rasterizado em todo o poço (ou seja, selecionando o movimento do portador de amostras SMART ou Random nos parâmetros do instrumento). Adquira pelo menos cinco réplicas técnicas para cada tipo de amostra e selecione três réplicas técnicas onde a variação na intensidade do sinal para picos desejados é a mais baixa. A troca aqui é de rendimento experimental. É necessário manter parâmetros como o número de tiros a laser, diâmetro do laser e outras configurações de instrumentos consistentes para todos os espectros adquiridos. Idealmente, todas as réplicas técnicas e réplicas biológicas são analisadas ao mesmo tempo utilizando a mesma solução matricial e calibração de instrumentos. A identificação do neuropeptídeo pode ser realizada por correspondência de massa precisa com uma lista de pico contendo valores teóricos [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, [M+K]+, e outros adutos de sal que produzem valores de íons m/z carregados. A normalização dos dados é fundamental para minimizar artefatos sistemáticos de experimentos MALDI-MS. A avaliação da reprodutibilidade é especialmente importante quando as medidas de manchas maldi-MS são usadas para quantificação de neuropeptídeos por rotulagem estável de isótopos (SIL). A qualidade da preparação da amostra e aquisição de dados pode ser avaliada tomando um padrão de peptídeo ou extrato de neuropeptídeo, dividindo-o em duas alíquotas iguais, rotulando diferenciadamente cada amostra por SIL e analisando a amostra para garantir que a intensidade relativa dos picos emparelhados seja 1:1. A variação relatada a partir dessas proporções pode ser usada para estimar o nível de variância no experimento global atribuído ao erro do usuário.
É importante notar que o MALDI-MS também é capaz de fornecer informações sequenciais e quantitativas; no entanto, os íons carregados tipicamente produzidos pela detecção de fragmentos de peptídeos limitantes MALDI, dificultando a obtenção da sequência completa e inibindo os métodos de quantitação discutidos para LC-ESI-MS. Independentemente disso, o MALDI-MS é uma modalidade atraente devido à sua capacidade de alta produtividade, bem como maior tolerância a sais e impurezas dentro da amostra 12,31. Além disso, a imagem MALDI-MS tem vantagens sobre outras técnicas convencionais de imagem que requerem anticorpos. Na maioria das modalidades de MS, a redução da resolução de massa aumentará a sensibilidade, permitindo uma melhor detecção de neuropeptídeos de baixa abundância. Essa estratégia pode ser mais prática para os instrumentos MALDI-TOF/TOF do que os instrumentos LC-ESI-MS devido à facilidade de calibrar o instrumento MALDI para cada experimento. Outra forma de o MALDI ser vantajoso para a neuropeptidômica é através da média de espectros. Normalmente, a média de espectros das medições LC-ESI-MS não é utilizada porque nega os benefícios da separação da LC; portanto, o software bioinformática é fortemente confiado para identificar neuropeptídeos e as identificações são verificadas manualmente. No entanto, há menos consequências para a média de espectros das medições do MALDI-MS porque não houve separação inicial; portanto, os dados brutos são menores e mais fáceis para um usuário pentear manualmente. A facilidade de gerenciamento de dados é importante, pois muda a ordem em que o usuário pode abordar estratégias de identificação e verificação de neuropeptídeos. Embora a confiança nas identificações de neuropeptídeos do LC-ESI-MS possa se beneficiar do aumento do nível de stringency limiar dentro do software de análise de dados, essa estratégia é menos provável que beneficie as identificações maldi-MS. No exemplo de neuropeptídeos crustáceos, o fato de haver menos de 1000 entradas do banco de dados construído em laboratório (ou seja, um máximo de picos espectrais <1000 ou imagens de MS para digitalizar manualmente), torna possível primeiro filtrar os dados maldi-MS com um generoso limiar de erro de massa e, em seguida, verificar manualmente essas identificações examinando os envelopes isotópicos no nível MS1, e, em seguida, verificar manualmente essas identificações examinando os envelopes isotópicos no nível MS1, e, em seguida, verificar manualmente essas identificações examinando os envelopes isotópicos no nível MS1, e, em seguida, verificar manualmente essas identificações examinando os envelopes isotópicos no nível MS11, e, em seguida, verificar manualmente essas identificações examinando os envelopes isotópicos no nível MS1, e, em seguida, verificar manualmente essas identificações examinando os envelopes isotópicos no nível MS11, e, em seguida, verificar manualmente essas identificações examinando os envelopes isotópicos no nível MS1, e, em seguida, verificar manualmente essas identificações examinando os envelopes isotópicos no nível MS1, e, em seguida, verificar manualmente essas identificações examinando os envelopes isotópicos no nível MS1, bem como outros métodos de verificação discutidos na seção Resultados Representativos. O popular software de análise de dados de imagem MS pode executar correspondências em massa precisas com um banco de dados de massa de neuropeptídeo e extrair as imagens de MS correspondentes. Para questões de pesquisa de base clínica, como a descoberta de biomarcadores, esses softwares são capazes de extrair valores m/z exclusivos de uma região de interesse tecidual (tipicamente chamada de análise região de interesse (ROI)32 e realizar testes estatísticos para quantificar o quão diferentes são as duas regiões teciduais. Também vale a pena notar que há também menos opções de software de análise de dados para imagens de MS do que para LC-ESI-MS.
Realizar pesquisas de banco de dados LC-ESI-MS por neuropeptídeos geralmente implica o uso de algoritmos de software construídos para a análise de peptídeos digeridos. Como tal, há limitações para que o software seja capaz de realizar pesquisas inespecíficas de banco de dados de enzimas ou o tempo necessário para concluir a pesquisa. Atualmente, as buscas de peptídeos endógenos são realizadas com o número máximo de decotes perdidos, mas esse número ainda é limitado, levando a identificações potencialmente perdidas. Quando o genoma de uma espécie não é totalmente sequenciado, como com C. sapidus, de novo sequenciamento pode ser realizado para identificar neuropeptídeos desconhecidos/novos através de motivos conhecidos de sequência de neuropeptídeos conservados, embora este método não identifique neuropeptídeos que tenham motivos desconhecidos ou não contenham os motivos usados como identificadores de família neuropeptídeos19. Por exemplo, WSSMRGAWamide é um motivo para a família de neuropeptídeo tipo B allatostatina19. Aqui reside o significado da mineração de transcriptome para sequências de neuropeptídeos previstas para espécies sem uma sequência de genoma completamente decodificada33. As identificações de neuropeptídeos são então confirmadas pela sintetização da sequência de peptídeos putativos e comparando os espectros de MS/MS de peptídeo sintético e tecido biológico34. Mesmo depois de uma sequência ser verificada, às vezes não se sabe se é a sequência completa de neuropeptídeos ou um produto de degradação. Vale ressaltar que as diferenças entre as fontes de ionização maldi e esi-MS (o ESI é um método de ionização mais suave do que o MALDI) podem resultar em diferentes taxas de degradação artificial (ou seja, fragmentação na fonte). Para distinguir entre uma versão truncada de um peptídeo de um produto de degradação induzido artificialmente (ou seja, não in vivo), deve-se conhecer o caminho de processamento préprohormone para esse neuropeptídeo. Como isso muitas vezes não é o caso, uma forma sintética do peptídeo deve ser usada em ensaios fisiológicos e verificada para atividade biológica.
No geral, o fluxo de trabalho exemplificado aqui para análise de neuropeptídeos pode beneficiar uma variedade de diferentes campos. Ele preenche uma lacuna técnica dentro da análise de PEPTídeos de MS médio-down porque é otimizado para peptídeos endógenos que são menores do que as proteínas tipicamente analisadas por análises de MS de baixo para cima ou de cima para baixo. Portanto, os métodos de preparação amostral utilizados pela neuropeptidomia devem ser em grande parte traduzíveis para outros peptídeos endógenos bioativos, como os destinados por químicos medicinais para propriedades antibacterianas35. Um benefício deste protocolo é que ele utiliza instrumentos comuns de fornecedores populares que oferecem um grau adicional de tradução também. Dessa forma, o fluxo de trabalho pode ser utilizado em ambientes acadêmicos e comerciais, como triagem para candidatos a medicamentos farmacêuticos ou alvos de medicamentos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela National Science Foundation (CHE-1710140 e CHE-2108223) e Institutos Nacionais de Saúde (NIH) através da bolsa R01DK071801. A.P. foi apoiada em parte pela NiH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde, sob o Prêmio Nacional de Serviço de Pesquisa Ruth L. Kirschstein do National Heart Lung and Blood Institute para o Centro de Pesquisa Cardiovascular da Universidade de Wisconsin-Madison (T32 HL007936). L.L. gostaria de reconhecer as bolsas NIH R56 MH110215, S10RR029531 e S10OD025084, bem como o apoio de financiamento de um Professor de Conquista Distinto de Vilas e Professor de Charles Melbourne Johnson com financiamento fornecido pela Wisconsin Alumni Research Foundation e pela University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde - D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge - 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac - SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) - Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
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- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
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