Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الفحص الجيني لتحديد مثبطات النسخ المتعددة في Schizosaccharomyces pombe

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/63967
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1University School of Biotechnology, G.G.S. Indraprastha University
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا العمل بروتوكولا للشاشة الجينية المثبطة متعددة النسخ في Schizosaccharomyces pombe. تستخدم هذه الشاشة مكتبة بلازميد على نطاق الجينوم لتحديد استنساخ (نسخ) مثبط لنمط ظاهري مفقود الوظيفة مرتبط بسلالة متحولة للاستعلام. تم تحديد مثبطات جينية جديدة للمتحور الفارغ ell1 باستخدام هذه الشاشة.

Abstract

يعد تحديد التفاعلات الجينية أداة قوية لفك رموز وظائف الجينات (الجينات) من خلال توفير رؤى ثاقبة لعلاقاتها الوظيفية مع الجينات الأخرى وتنظيمها في المسارات والعمليات البيولوجية. على الرغم من أن غالبية الشاشات الجينية تم تطويرها في البداية في Saccharomyces cerevisiae ، فقد تم توفير منصة تكميلية لتنفيذ هذه الشاشات الجينية من قبل Schizosaccharomyces pombe. أحد الأساليب الشائعة المستخدمة لتحديد التفاعلات الجينية هو الإفراط في التعبير عن الحيوانات المستنسخة من مكتبة بلازميد عالية النسخ على نطاق الجينوم في متحور يفقد وظيفته ، يليه اختيار المستنسخات التي تقمع النمط الظاهري المتحور.

تصف هذه الورقة بروتوكولا لتنفيذ هذه الشاشة الجينية القائمة على "القمع متعدد النسخ" في S. pombe. ساعدت هذه الشاشة في تحديد مثبط (مثبطات) متعدد النسخ للنمط الظاهري الحساس للإجهاد الوراثي المرتبط بغياب عامل استطالة النسخ Ell1 في S. pombe. بدأت الشاشة عن طريق تحويل سلالة الاستعلام ell1 الطافرة الخالية مع مكتبة بلازميد S. pombe cDNA ذات رقم نسخ مرتفع واختيار المثبطات على ألواح EMM2 التي تحتوي على 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO) ، وهو مركب محفز للإجهاد السام للجينوم. في وقت لاحق ، تم عزل البلازميد من مستعمرتين مثبطتين في القائمة المختصرة وهضمها بواسطة إنزيمات التقييد لإطلاق الحمض النووي المدخل. تم إعادة تحويل البلازميدات التي تطلق جزءا من الحمض النووي المدرج إلى سلالة حذف ell1 لتأكيد قدرة هذه المستنسخات البلازميدية المثبطة على استعادة نمو متحور حذف ell1 في وجود 4-NQO وغيرها من المركبات السامة للجينات. تم تسلسل تلك البلازميدات التي تظهر إنقاذا للنمط الظاهري للحذف لتحديد الجين (الجينات) المسؤول عن قمع النمط الظاهري الحساس للإجهاد المرتبط بالحذف ell1.

Introduction

توفر شبكات التفاعلات الجينية معلومات وظيفية حول الجينات وتحدد المسارات والعمليات البيولوجية التي قد تشارك فيها هذه الجينات في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، قد توفر أيضا رؤى حول كيفية تفاعل الجينات المختلفة مع بعضها البعض ، مما يؤدي إلى نمط ظاهري محدد1،2،3. على مر السنين ، تم تصميم مجموعة متنوعة من الشاشات الجينية من قبل الباحثين للإجابة على الأسئلة البيولوجية الأساسية ودراسة الأمراض البشرية. يمكن إجراء فحوصات لتحديد التفاعلات الجينية بطرق متعددة. يمكن أن تمثل التفاعلات الجينية المحددة في الشاشات الجينية المختلفة علاقات ميكانيكية متميزة بين الجينات. علاوة على ذلك ، كشفت الدراسات أن مجموعة مشتركة من التفاعلات الجينية تتقاسمها الجينات التي تشفر البروتينات التي تنتمي إلى نفس المسار أوالمعقدة 4,5. وبالتالي ، يمكن استخدام شبكات التفاعل الجيني لإنشاء التنظيم الوظيفي في الخلية ، حيث تنتمي الجينات التي تشترك في أكثر الملفات الشخصية تشابها إلى نفس المجمع أو المسار ، وتنتمي تلك الجينات التي تشترك في ملفات تعريف أقل تشابها إلى حد ما إلى نفس العملية البيولوجية ، وتعكس تلك الجينات التي تظهر ملفات تعريف متداخلة ولكنها أكثر تنوعا أعضاء ينتمون إلى نفس المقصورة الخلوية6.

تعد شاشات التفاعل الجيني القائمة على قمع الجرعة ("قمع النسخ العالي أو النسخ المتعددة") واحدة من الأساليب الشائعة الاستخدام. يمكن إجراء هذه الشاشات عن طريق تحويل سلالة متحورة للاستعلام باستخدام مكتبة جينومية أو cDNA عالية النسخ ، تليها تقنيات الفحص / الاختيار المناسبة لتحديد قمع أو تعزيز التفاعلات الجينية 7,8,9. لضمان تغطية شاملة على نطاق الجينوم ، تم إجراء هذه الشاشات أيضا عن طريق المبالغة في التعبير عن جين معين ذي أهمية في مجموعة من المتحورات المفقودة للوظيفة على نطاق الجينوم أو عن طريق المبالغة في التعبير عن مكتبة جينومية عالية العدد من البلازميد المشفر بالبلازميد أو cDNA في متحفر استعلام فقدان الوظيفة 9,10,11,12,13,14,15 . يمكن أن تعمل استراتيجية النسخ المتعددة أيضا باستخدام نهج مهيمن / مفرط في التعبير باستخدام مروج قابل للتنظيم.

تتمثل المزايا الرئيسية لاستخدام الشاشات القائمة على المثبطات في أن قمع النمط الظاهري الموجود مسبقا في سلالة متحولة بواسطة جين آخر ينشئ علاقة وراثية بين هذين المنتجين الجينيين ربما لم يتم إثباتهما باستخدام أساليب أخرى. ثانيا، لوحظ أن وجود طفرة موجودة مسبقا يحسس مسارا معينا، مما يسمح بتحديد مكونات إضافية لهذا المسار من خلال عزل المثبطات، والتي ربما لم يتم تحديدها عن طريق اختيارات جينية أكثر مباشرة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الشاشة لتحديد المثبطات التي لها آليات قمع مختلفة16. عادة ما تحدث التفاعلات المثبطة بين الجينات ذات الصلة وظيفيا ويمكن استخدامها لتوضيح التسلسلات الهرمية في المسارات. قد تختلف الآلية الأساسية الدقيقة للقمع بناء على عدة عوامل، بما في ذلك نوع متحور الاستعلام المستخدم في الشاشة، والظروف التجريبية، ومستوى التعبير الجيني. تتضمن إحدى آليات قمع الجرعة الشائعة جينات ترميز المنتجات التي تعمل معا في نفس المجمع أو بالتوازي في نفس العملية الخلوية / البيولوجية. يمكن توسيع نتائج هذه الشاشات في الكائنات الحية النموذجية الأبسط مثل الخميرة إلى الكائنات حقيقية النواة الأعلى حيث يتم الحفاظ على معظم المسارات والعمليات البيولوجية الأساسية عبر التطور.

يمكن أيضا تعديل هذه الشاشات الجينية بعدة طرق للإجابة على الأسئلة البيولوجية المختلفة. على سبيل المثال ، يمكن تحديد الجينات التقويمية من الكائنات الحية المختلفة التي يمكنها قمع النمط الظاهري لسلالة الاستعلام المتحولة. كما تم استخدامه لتحديد آليات المقاومة المحتملة وتحديد أهداف البروتين للمركبات الجديدة المضادة للبكتيريا17,18 والمضادة للفطريات 19,20 والمضادة للطفيليات 21 والمضادة للسرطان 22. كما تم استغلال هذه الشاشة لتحديد مثبطات نشاط الأدوية الصيدلانية التي لا تعرف آلية عملها. وبالتالي ، من حيث المبدأ ، يمكن تحسين هذه الشاشات المثبطة متعددة النسخ واستخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات في الكائنات الحية المختلفة. على الرغم من أن معظم الشاشات الجينية التي يستخدمها باحثو الخميرة قد تم تطويرها في البداية في S. cerevisiae ، فقد برزت S. pombe كنظام نموذجي تكميلي لإجراء مختلف الفحوصات الجينية والفحوصات23. علاوة على ذلك ، فإن التنظيم الجينومي والعمليات البيولوجية في S. pombe ، مثل حدوث الإنترونات في المزيد من الجينات ، وتعقيد أصول تكرار الحمض النووي ، وبنية centromere ، وتنظيم دورة الخلية ووجود آلية RNAi ، تظهر تشابها أكبر بين S. pombe وحقيقيات النوى الأعلى23,24 ، مما يؤكد أهمية تصميم واستخدام الأدوات الجينية في S. pombe.

تصف هذه الورقة بروتوكولا لتحديد التفاعلات الجينية بناء على "قمع الجرعة" للنمط الظاهري المتحور المفقود الوظيفة في S. pombe. أساس هذا البروتوكول هو أنه طريقة سريعة وفعالة لفحص مكتبة cDNA التي تبالغ في التعبير عن جينات النوع البري إما على بلازميد متعدد النسخ و / أو من مروج قوي. يحتوي هذا البروتوكول على أربع خطوات رئيسية: تحويل المكتبة إلى سلالة متحولة للاستعلام ، واختيار مستنسخات البلازميد التي تقمع النمط الظاهري المطلوب لسلالة الاستعلام المتحولة ، واسترداد البلازميد (البلازميدات) من هذه المستنسخات المثبطة ، وتحديد الجين المسؤول عن قمع النمط الظاهري. كما هو الحال بالنسبة لأي طريقة تعتمد على اختيار وتحديد cDNAs من المكتبة ، يعتمد نجاح الشاشة على استخدام مكتبة عالية الجودة وعالية التعقيد حيث يمكن للشاشة استرداد فقط تلك المستنسخات cDNA الموجودة في المكتبة.

باستخدام هذا البروتوكول ، نجحنا في تحديد اثنين من المثبطات الجديدة للنمط الظاهري الحساس للإجهاد السام الوراثي للاستعلام S. pombe ell1 null mutant. عائلة ELL (أحد عشر تسعة عشر ليسين الغنية بسرطان الدم) من عوامل استطالة النسخ تمنع التوقف المؤقت العابر لبوليميراز الحمض النووي الريبي II على قوالب الحمض النووي في المقايسات الكيميائية الحيوية في المختبر ويتم حفظها عبر الكائنات الحية المختلفة ، من الخميرة الانشطارية إلى البشر25. وقد قدمت أعمال سابقة أدلة على أن متحور S. pombe ell1 الفارغ يظهر حساسية الإجهاد السام وراثيا في وجود 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO) وميثيل ميثان سلفونات (MMS)26. لذلك ، قمنا بتحويل مكتبة cDNA متعددة النسخ المشفرة بالبلازميد S. pombe إلى الاستعلام S. pombe ell1 null mutant وحددنا اثنين من المستنسخات المفترضة التي أظهرت القدرة على قمع حساسية الإجهاد السام الوراثي للمتحور الفارغ S. pombe ell1 في وجود 4-NQO ، وهو مركب يحفز آفات الحمض النووي. حدد التسلسل اللاحق للإدراج الموجود في استنساخ البلازميد أن الجينات التي تشفر rax2+ و osh6+ كانت مسؤولة عن قمع حساسية الإجهاد السام الجيني للمتحور الفارغ ell1 عند المبالغة في التعبير عنه في المتحور الفارغ ell1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحويل مكتبة cDNA إلى سلالة S . pombe المتحولة للاستعلام لفحص المثبطات متعددة النسخ

ملاحظة: تم اتباع طريقة الليثيوم - خلات الليثيوم القياسية27 لتحويل مكتبة S. pombe cDNA إلى سلالة S. pombe ell1Δ مع بعض التعديلات:

  1. تنمو سلالة S. pombe ell1Δ عند 32 درجة مئوية على لوحة متوسطة YE (الجدول 1) مكملة ب 225 ميكروغرام / مل لكل من الأدينين والليوسين واليوراسيل. قم بتلقيح حلقة مليئة بالتلقيح من سلالة ell1Δ من اللوحة المذكورة أعلاه في 15-20 مل من وسط YE مع استكمال 225 ميكروغرام / مل لكل من الأدينين والليوسين واليوراسيل. احتضنه بين عشية وضحاها عند 32 درجة مئوية مع الاهتزاز (200-250 دورة في الدقيقة).
  2. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الثقافة بين عشية وضحاها في 100 مل من وسط YE الطازج مع المكملات الغذائية المطلوبة إلى OD 600 nm (الكثافة البصرية عند 600 nm) من 0.3 واحتضنها عند 32 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200-250 دورة في الدقيقة حتى يصل OD600 nm إلى مرحلة منتصف السجل.
  3. قسم مزرعة 100 مل إلى أنبوبين لأجهزة الطرد المركزي سعة 50 مل، يليهما الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 4000 × جم.
  4. تخلص من المادة الفائقة واغسل حبيبة الخلية ب 1 مل من الماء المعقم ، أي أعد تعليق الخلايا في 1 مل من الماء المعقم وأجهزة الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. تخلص من المادة الفائقة واغسل كل حبيبة خلية بمحلول 1 مل من 1x LiAc-TE (100 mM lithium acetate ، 10 mM Tris-HCl ، 1 mM EDTA ، pH 7.5) كما هو موضح في الخطوة 1.4.
  6. قم بإزالة supernatant وأعد تعليق كل حبيبة خلية في 250 ميكرولتر من 1x LiAc-TE. استخدم هذه الخلايا المختصة S. pombe (500 ميكرولتر) للتحويل باستخدام الحمض النووي محل الاهتمام. نقل 125 ميكرولتر من الخلايا المختصة إلى أربعة أنابيب مختلفة لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة المعقمة لخطوات التحويل اللاحقة.
  7. غلي الحمض النووي الناقل من خصيتي السلمون أو الحيوانات المنوية الرنجة لمدة 1 دقيقة ووضعها على الفور على الجليد. لكل تحويل، أضف 10 ميكرولتر من الحمض النووي الناقل المشوه أحادي الخيط إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على 125 ميكرولتر من الخلايا المختصة، يليه خلط لطيف باستخدام طرف ماصة دقيقة. بعد ذلك ، أضف 50 ميكروغرام من مكتبة S. pombe cDNA إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الحامل للخلايا المختصة الذي يحتوي على خليط الحمض النووي.
  8. احتضن أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، ثم أضف 260 ميكرولتر من محلول خلات البولي إيثيلين جليكول ليثيوم (40٪ [w / v] PEG 4000 ، 100 mM lithium acetate ، 10 mM Tris-HCl ، 1 mM EDTA ، pH 7.5) إلى الأنابيب واخلطها بلطف بمساعدة طرف ماصة دقيقة.
  9. احتضان أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على خليط التحويل عند 32 درجة مئوية لمدة 2 ساعة دون اهتزاز. أضف 43 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ثنائي الميثيل المسخن مسبقا (DMSO) إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق واخلطه بلطف. بعد ذلك ، قم بتعريض الأنابيب لصدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  10. اضرب الخلايا على 4000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الفائقة وقم بإزالة محلول PEG- LiAc-TE المتبقي بمساعدة طرف ماصة دقيقة.
  11. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من الماء المعقم والصفيحة على لوحة EMM2 واحدة (الجدول 1) (150 مم) مع المكملات الغذائية المطلوبة و 0.2 ميكروغرام / مل من 4-NQO.
  12. احتضن الألواح عند 32 درجة مئوية لمدة 5-6 أيام للسماح للمستعمرات بالظهور على اللوحات. قم بربط المستعمرات التي تم الحصول عليها على نفس اللوحة المتوسطة في وجود 0.2 ميكروغرام / مل من 4-NQO واستخدامها لمزيد من الفحص.
  13. بالنسبة لتجربة تحويل مكتبة واحدة، استخدم 500 ميكرولتر من الخلايا المختصة (125 ميكرولتر من الخلايا المختصة × 4 أنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة) للتحويل كما هو موضح في الخطوات من 1.8 إلى 1.14 أعلاه.
  14. كعنصر تحكم ، لوحة 1/10th من خليط التحويل على لوحة EMM2 واحدة (150 مم) مع المكملات المطلوبة ، ولكن تفتقر إلى 4-NQO ، لحساب العدد الإجمالي لاستنساخ المكتبة التي تم الحصول عليها بعد تحويل المكتبة ، وفحص عزل المستنسخات المثبطة.

2. اختبار والتحقق من صحة إنقاذ / قمع النمط الظاهري المرتبط بسلالة الاستعلام المتحورة بواسطة الكابت المفترض

ملاحظة: تم إجراء اختبارات بقعة الإجهاد كما هو موضح أدناه لاختبار والتحقق من صحة إنقاذ / قمع حساسية الإجهاد 4-NQO المرتبطة بالحذف ell1 بواسطة المثبط (المثبطات) المفترضة.

  1. أضف 100-200 ميكرولتر من الماء المعقم في كل بئر من الآبار المختلفة لصفيحة ميكروتيتر معقمة من 96 بئرا.
  2. اختر كمية صغيرة من التلقيح من كل مستعمرة من المستعمرات المختلفة التي تم الحصول عليها بعد تحويل مكتبة cDNA على اللوحة التي تحتوي على 4-NQO باستخدام مسواك معقم أو طرف ماصة ميكروماصة 20-200 ميكرولتر. أضف اللقاح من كل مستعمرة من المستعمرات المختلفة إلى آبار مستقلة منفصلة من صفيحة microtiter تحتوي على 100-200 ميكرولتر من الماء المعقم. اخلطي جيدا.
  3. بقعة 3 ميكرولتر من تعليق الخلية من كل بئر على ألواح أجار EMM2 التي تحتوي على الأدينين (225 ميكروغرام / مل) والوراسيل (225 ميكروغرام / مل) ولكنها تفتقر إلى الليوسين (علامة التغذية المساعدة القابلة للاختيار الموجودة على متجه البلازميد المستخدم في بناء المكتبة المستخدمة في هذا العمل). أضف تركيزات مناسبة من 4-NQO إلى الألواح حسب الحاجة.
  4. احتضن الألواح عند 32 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام للسماح للخلايا بالنمو. تحديد المستعمرات التي تظهر نموا في وجود تركيزات مختلفة من 4-NQO كمثبطات مفترضة.
  5. لمزيد من التحقق من صحة المثبطات ، قم بزراعة المثبطات المختارة جنبا إلى جنب مع سلالات التحكم المناسبة بين عشية وضحاها عند 32 درجة مئوية مع اهتزاز (200-250 دورة في الدقيقة) في وسط EMM2 يحتوي على 225 ميكروغرام / مل لكل من الأدينين واليوراسيل ولكن يفتقر إلى الليوسين.
  6. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الخلايا إلى OD 600 نانومتر من 0.3 في وسط EMM2 الطازج وقم بتنميتها عند 32 درجة مئوية مع الاهتزاز حتى مرحلة منتصف السجل (حواليOD 600 نانومتر من 0.6-0.8).
  7. حدد التخفيفات التسلسلية المناسبة (1:10 أو 1:5) للثقافات على لوحات EMM2 مع المكملات المطلوبة التي تحتوي إما على 0.4 ميكرومتر 4-NQO أو 0.01٪ MMS. للتحكم ، حدد السلالات على لوحة EMM2 مع المكملات الغذائية المطلوبة ولكن تفتقر إلى أي عامل ضار بالحمض النووي.
  8. احتضان الألواح عند 32 درجة مئوية لمدة 3-5 أيام لمراقبة النمو.
    ملاحظة: يجب استخدام المقايسات المناسبة استنادا إلى النمط الظاهري المرتبط بسلالة الاستعلام المتحولة لاختبار إنقاذ النمط الظاهري أو قمعه. على سبيل المثال، إذا كانت هناك حاجة إلى تحديد مثبطات النمط الظاهري الحساس للبرد لسلالة متحورة استعلامية، فإن اختبار اختبار المستنسخات المثبطة والتحقق من صحتها سيتضمن محولات متنامية في درجة حرارة منخفضة.
  9. حدد السلالات الطافرة المتحولة باستخدام جين كامل الطول ذي أهمية (Spell1 في هذه الحالة) أو متجه فارغ كعناصر تحكم إيجابية وسلبية ، على التوالي ، إلى جانب محولات المكتبة.

3. عزل البلازميد عن استنساخ مثبط S. pombe

ملاحظة: تم إجراء عزل البلازميد من S. pombe باتباع البروتوكول الموصوف في الخميرة الانشطارية: دليل المختبر28 مع بعض التعديلات.

  1. قم بتلقيح مستعمرة خميرة واحدة في وسط EMM2 يحتوي على 225 ميكروغرام / مل من الأدينين واليوراسيل وتنمو الخلايا بين عشية وضحاها عند 32 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200-250 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، قم بحصاد 5 خلايا O.D. (أي 10 مل من O.D. 0.5) عن طريق الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة عند 4000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بإزالة المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبة الخلية في 0.2 مل من المخزن المؤقت للتحلل (2٪ Triton X-100 و 1٪ SDS و 100 mM NaCl و 10 mM Tris HCl (الرقم الهيدروجيني 8.0) و 1 mM Na2EDTA).
  3. أضف 0.2 مل من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل (25:24:1) و 0.3 جم من الخرز الزجاجي المغسول بالأحماض إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. دوامة أنبوب الطرد المركزي الدقيق لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية واحتضن على الجليد لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة 6x.
  4. قم بطرد الأنبوب مركزيا عند 10000 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. انقل الطبقة المائية العليا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق طازج وأضف 200 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل (25: 24: 1).
  5. جهاز طرد مركزي للأنبوب على ارتفاع 10000 × غرام لمدة 10 دقائق. انقل الطبقة المائية العليا إلى أنبوب جديد وأضف مجلدين من الإيثانول بنسبة 100٪ (~ 400 ميكرولتر) وحجم 1/10 من خلات الصوديوم (3 م ، درجة الحموضة 5.8) (~ 20 ميكرولتر) إلى الأنبوب. احتضان أنبوب الطرد المركزي الدقيق -70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  6. عجل الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي في 10000 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant. اغسل حبيبات الحمض النووي بالإيثانول بنسبة 70٪ (~ 500 ميكرولتر) واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة حتى تجف في الهواء.
  7. أعد تعليق الحمض النووي في 20 ميكرولتر من الماء المعقم. استخدم 2-5 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد لتحويل خلايا الإشريكية القولونية المختصة.
    ملاحظة: يمكن أيضا عزل البلازميد من خلايا الخميرة باستخدام أي من مجموعات عزل بلازميد الخميرة المتاحة تجاريا.

4. تحديد الجين المشفر بواسطة استنساخ المثبط

  1. تحويل بلازميدات الخميرة المعزولة إلى سلالة E. coli Top10 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] باستخدام البروتوكول القياسي29 ونشر الخلايا على ألواح LB (مرق لوريا) مع المضادات الحيوية المطلوبة.
  2. اعزل البلازميد (البلازميدات) عن محولات الإشريكية القولونية باستخدام بروتوكول التحلل القلوي القياسي29 ، واتبع المجموعات المناسبة من إنزيمات التقييد للتحقق من إطلاق جزء الحمض النووي المدرج عن طريق هضم التقييد.
    ملاحظة: تم هضم البلازميد المثبط 84 باستخدام إنزيم تقييد Bam HI ، وتم هضم البلازميد المثبط 104 باستخدام إنزيمات تقييد PstI / BamHI.
  3. أعد تحويل البلازميدات التي تظهر إطلاق الإدراج بعد تقييد الهضم في سلالة ell1 Δ للتحقق من قدرتها على إنقاذ النمط الظاهري الحساس للإجهاد السام الوراثي لسلالة ell1Δ.
  4. حدد المستنسخات البلازميدية التي تظهر قمع حساسية الإجهاد السام الجيني وتسلسل جزء الحمض النووي المدرج الموجود في هذه المستنسخات البلازميدية باستخدام الاشعال الأمامي والعكسي الخاص بالمتجهات.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام التمهيدي الأمامي العالمي الخاص ب adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30.
  5. لتحديد الجين المسؤول عن القمع، قم بمحاذاة التسلسل الذي تم الحصول عليه باستخدام انفجار نيوكليوتيدات NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) أو أداة محاذاة تسلسل Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). حدد التسلسل الذي يظهر أقصى محاذاة وحدده على أنه الجين الخاص بالبلازميد الكابت متعدد النسخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

فحص المثبطات متعددة النسخ لحساسية الإجهاد السام الجيني المرتبطة بالحذف ell1 في S. pombe
أجرينا الفحص الجيني باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه لتحديد المثبطات متعددة النسخ للنمط الظاهري لفقدان الوظيفة للسلالة الطافرة لحذف الاستعلام ell1. تم اعتماد الحساسية المرتبطة بالنمو لسلالة حذف ell1 التي لوحظت في وجود العامل السام للوراثة 4-NQO كنمط ظاهري لفقدان الوظيفة لاختيار مثبطات متعددة النسخ. ويبين الشكل 1 تمثيلا تخطيطيا للشاشة الجينية. لبدء الشاشة ، تم تأكيد حساسية الإجهاد السام الوراثي لمتحور حذف ell1 (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1Δ :: kanMX6) لأول مرة فيما يتعلق بسلالته البرية من النوع البري متساوي المنشأ (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1) في وجود 4-NQO (الشكل 2A). في وقت لاحق ، تم تحويل الاستعلام S. pombe ell1 null mutant مع مكتبة S. pombe cDNA ذات رقم نسخ مرتفع لاختيار تلك المستنسخات البلازميدية التي يمكن أن تقمع / تنقذ الحساسية المرتبطة بالنمو 4-NQO للمتحور الفارغ ell1. تحتوي هذه المكتبة على ~ 6 × 105 S. pombe cDNA شظايا مستنسخة في ناقل التعبير الزائد pLEV3 S. pombe تحت سيطرة المروج adh1 30. كعنصر تحكم ، تم أيضا طلاء 1/10عشر من خليط التحويل على لوحات EMM2 تفتقر إلى 4-NQO لحساب العدد الإجمالي للمستنسخات المؤتلفة التي تم الحصول عليها بعد تحويل المكتبة ، وهو مؤشر على تغطية المكتبة ، وتم فحصها لعزل المستنسخات المثبطة. هذا أمر بالغ الأهمية ، لأن فحص عدد أقل من الحيوانات المستنسخة سيقلل من إمكانية تحديد المستنسخات المثبطة. 

ويبين الشكل 2 باء صورا تمثيلية للوحة التحكم والألواح المحتوية على 4-NQO. كما هو موضح في الشكل ، يتم الحصول على عدد كبير من المستعمرات على لوحة التحكم التي تفتقر إلى 4-NQO مما يدل على تغطية جيدة للمكتبة. كما هو متوقع ، تم الحصول على عدد أقل من المحولات على لوحة 4-NQO حيث من المحتمل أن تمثل هذه المحولات المثبطات المفترضة لحساسية 4-NQO للمتحور الفارغ ell1 . بعد ذلك ، تم تخطيط أو رصد المستعمرات المحولة المختلفة التي تم الحصول عليها على لوحات EMM2 التي تحتوي على 0.2 μM 4-NQO على ألواح EMM2 التي تحتوي على 0.2 μM 4-NQO لتأكيد قدرة هذه المحولات على النمو في وجود 4-NQO. لوحظ أن 620 مستعمرة تحويلية كانت قادرة على النمو على لوحات EMM2 المحتوية على 0.2 ميكرومتر 4-NQO.

التحقق من قدرة المستنسخات المثبطة المفترضة على استعادة نمو متحور حذف ell1 في ظل ظروف الإجهاد السام للوراثة
لتأكيد المثبطات المفترضة ، من المهم اختبار إنقاذ النمط الظاهري المطلوب في ظل ظروف صرامة أعلى كما هو موضح في التمثيل التخطيطي (الشكل 3A). لذلك ، تم رصد 620 محولا مدرجا في القائمة المختصرة على لوحات EMM2 مع 0.4 μM 4-NQO. وكما يتضح من الشكل 3 باء، أظهر 74 محولا فقط نموا عند 0.4 ميكرومتر 4-NQO. وفي وقت لاحق، رصدت هذه المحولات ال 74 على صفائح EMM2 التي تحتوي على 0.8 ميكرومتر 4-NQO، ولوحظ أن 16 منها فقط أظهرت نموا في وجود 0.8 ميكرومتر 4-NQO (الشكل 3C). ولمزيد من تأكيد هذه الملاحظات، تم رصد هذه المحولات ال 16 على صفائح EMM2 مع المكملات المطلوبة، التي تحتوي إما على 0.8 ميكرومتر 4-NQO أو لا تحتوي على 4-NQO (التحكم)، جنبا إلى جنب مع متحور حذف ell1 الذي تم تحويله مع متجه فارغ. كشفت نتائج اختبارات الاكتشاف هذه أنه ، كما هو متوقع ، أظهرت سلالة حذف ell1 التي تحولت مع متجه فارغ ، وكذلك جميع المحولات ال 16 ، نموا على اللوحة التي تفتقر إلى 4-NQO. وبالمقارنة، في حين أن متحور حذف ell1 الذي يحتوي فقط على المتجه الفارغ لم يظهر أي نمو عند 0.8 ميكرومتر 4-NQO، أظهرت ستة محولات نموا عند 0.8 ميكرومتر 4-NQO (الشكل 3D)، مما يشير إلى أن استنساخ (نسخ) المكتبة الموجودة فيها لديها القدرة على قمع النمط الظاهري للإجهاد الوراثي للمتحور الفارغ ell1.

تحديد الجين المشفر بواسطة استنساخ المثبط
اخترنا بعد ذلك 02 مثبطات جينية لسلالة حذف ell1 ، sup 84 و sup 104 ، مما يدل على قمع كامل لحساسية النمو المرتبطة ب ell1 في وجود 4-NQO. تم عزل استنساخ (نسخ) البلازميد المكتبية من هذين المثبطين للخميرة وتحويلها إلى خلايا E. coli المختصة. في وقت لاحق ، تم عزل البلازميد من خلايا E. coli باستخدام البروتوكولات القياسية31. وخضع البلازميدان المعزولان، الموسومان باسم 84 و104، لعملية هضم مقيدة، مما كشف عن وجود ما يقرب من 1000 برميل و800 برميل من شظايا الحمض النووي، على التوالي (الشكل 4A، B). لمزيد من التحقق من صحة نتائج هذه الشاشة المثبطة ، تم إعادة تحويل هذه البلازميدات إلى متحور حذف ell1 والتحقق مما إذا كان بإمكانها استعادة نمو المتحور الفارغ ell1 في وجود 4-NQO. كشفت فحوصات بقعة الإجهاد أن استنساخ البلازميد المثبط أدى إلى قمع حساسية النمو المرتبطة ب 4-NQO عند إعادة إدخالها في المتحور الفارغ ell1 ، مما يشير إلى أن القمع كان يعتمد على البلازميد (الشكل 4C). علاوة على ذلك ، قررنا تحديد ما إذا كانت هذه المستنسخات المثبطة يمكن أن تقمع أيضا الحساسية المرتبطة بالنمو لسلالة حذف ell1 في وجود مركب آخر يسبب تلف الحمض النووي ، MMS. أظهرت الفحوصات الفورية أن تحول مستنسخات البلازميد المثبطة إلى متحور فارغ ell1 أدى إلى نمو أكبر على الوسط المحتوي على MMS من تحول متحور حذف ell1 مع ناقل فارغ ، مما يشير إلى أن هذه المستنسخات البلازميدية يمكن أن تقمع حساسية الإجهاد السام الجيني لمتحور حذف ell1 في وجود كل من العوامل السامة وراثيا ، أي 4-NQO و MMS (الشكل 4D).

بعد ذلك ، لتحديد الجين الموجود في هذه المستنسخات البلازميدية المثبطة ، تم إجراء تسلسل لجزء الحمض النووي المدرج باستخدام التمهيدي الأمامي العالمي30 الخاص ب adh1 المروج. تم البحث في تسلسل النيوكليوتيدات الذي تم الحصول عليه باستخدام أداة "BLAST at Ensembl" المتاحة على موقع PomBase (https://www.pombase.org) ، والتي كشفت أن المستنسخين البلازميد 84 و 104 يحتويان على جينات rax2+ و osh6 + ، على التوالي ، مما يوفر دليلا على أن Rax2 و Osh6 كانا مسؤولين عن قمع النمط الظاهري الحساس للإجهاد السام الوراثي المرتبط بغياب ell1+ في S. pombe . المعرفة حول وظائف كل من هذه البروتينات في S. pombe محدودة. وقد ثبت أن Rax2 ينظم توطين For3p للتحكم في قطبية الخلية أثناء النمو الخضري في S. pombe32. Osh6 هو بروتين نقل الدهون الذي ينتمي إلى عائلة البروتين المرتبطة بالبروتين المرتبط بالأوكسيستيرول. وتشارك في نقل الفوسفاتيديل سيرين من الشبكة الإندوبلازمية إلى غشاء البلازما33.

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لشاشة المثبط الجيني متعدد النسخ. يحتوي هذا البروتوكول على أربع خطوات رئيسية: تحويل المكتبة إلى سلالة متحولة للاستعلام ، واختيار مستنسخات البلازميد التي تقمع النمط الظاهري المطلوب لسلالة الاستعلام المتحولة ، واسترداد البلازميد (البلازميدات) من هذه المستنسخات المثبطة ، وتحديد الجين المسؤول عن قمع النمط الظاهري. اختصار: 4-NQO = 4-نيتروكينولين 1-أكسيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: فحص مثبط (مثبطات) متعدد النسخ لحساسية الإجهاد السام الجيني المرتبطة بالحذف ell1 في S. pombe. (أ) فحص بقعة الإجهاد الذي يظهر حساسية 4-NQO لسلالة S. pombe المحذوفة من ell1 مقارنة بسلالتها البرية من النوع البري متساوي المنشأ. تم رصد التخفيفات التسلسلية (1:10) للسلالات المناسبة على وسط EMM2 الذي يحتوي على 225 ميكروغرام / مل لكل من الأدينين والليوسين واليوراسيل مع أو بدون (تحكم) 0.4 ميكرومتر 4-NQO. ثم تم احتضان الصفائح لمدة 3-5 أيام عند 32 درجة مئوية. (B) تم تحويل مكتبة cDNA ذات رقم نسخ مرتفع إلى سلالة S. pombe المحذوفة ell1 ، وتم طلاء المستعمرات المحولة على وسط EMM2 يفتقر إلى الليوسين ولكنه يحتوي على 0.2 ميكرومتر 4-NQO. كما تم طلاء أليكوت صغير من خليط التحويل على لوحات EMM2 التي تفتقر إلى 4-NQO ، كعنصر تحكم. تم تحضين اللوحات عند 32 درجة مئوية لمدة 5-6 أيام وتصويرها. تعرض اللوحة B صورة تمثيلية لهذه اللوحات. اختصار: 4-NQO = 4-نيتروكينولين 1-أكسيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التحقق من قدرة المستنسخات المثبطة المفترضة على قمع حساسية الإجهاد السام الوراثي لمتحور حذف ell1 . (أ) تمثيل تخطيطي لفحص محولات المكتبة عن طريق اختبار قمع النمط الظاهري المطلوب. تم اختبار نمو 620 محولا على تركيزات متزايدة من 4-NQO عن طريق اكتشاف محولات مختلفة على ألواح EMM2 تفتقر إلى الليوسين وتحتوي إما على (B) 0.4 μM 4-NQO أو (C) 0.8 μM 4-NQO. تم تحضين اللوحات عند 32 درجة مئوية لمدة 5-6 أيام وتصويرها. تم عرض صور تمثيلية للوحات. (د) تم رصد ستة عشر محولا كانت تظهر نموا على 0.8 ميكرومتر 4-NQO على صفائح EMM2 تفتقر إلى الليوسين ولكنها تحتوي إما على 0.8 ميكرومتر 4-NQO أو لا تحتوي على 4-NQO (التحكم)، إلى جانب سلالة الحذف ell1 المحولة مع متجه فارغ. تم تحضين اللوحات عند 32 درجة مئوية لمدة 5-6 أيام وتصويرها. أظهرت ست مستعمرات فقط القدرة على إنقاذ حساسية الإجهاد السمية الجينية المرتبطة بالحذف ell1 . اختصار: 4-NQO = 4-نيتروكينولين 1-أكسيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحديد استنساخ البلازميد الكابت. صور هلام Agarose من (A) تقييد هضم البلازميد المثبط 84 مع إنزيم تقييد BamHI صدر إدراج ~ 1 كيلو بايت. (ب) تم رصد البلازميد المثبط 104 المهضوم باستخدام إنزيمات تقييد PstI / BamHI إدراج ~ 800 bp. (C) 1:10 مخفف متسلسلا ell1 متحور فارغ تم تحويله مع البلازميدات ، sup 84 أو sup 104 ، تم رصده على لوحات EMM2 التي تفتقر إلى الليوسين وتحتوي إما على 0.4 μM 4-NQO أو (D) 0.01٪ MMS. في لوحات التحكم ، لم تتم إضافة أي عامل ضار بالحمض النووي. تم تحضين اللوحات عند 32 درجة مئوية لمدة 4-5 أيام وتصويرها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تكوين الوسائط لنمو S. pombe. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم استخدام الخمائر على نطاق واسع للتحقيق في العمليات والمسارات البيولوجية الأساسية التي يتم حفظها تطوريا عبر الكائنات حقيقية النواة. إن توافر الأدوات الجينية والجينومية إلى جانب قابليتها للتكيف مع مختلف الإجراءات الكيميائية الحيوية والوراثية والجزيئية يجعل الخمائر كائنا نموذجيا ممتازا للبحوث الجينية34،35،36. على مر السنين ، تم تصميم العديد من الشاشات الجينية من قبل باحثي الخميرة لتحديد التفاعلات الجينية التي من شأنها إلقاء الضوء على وظائف الجينات الفردية ، وكذلك المسارات والعمليات البيولوجية التي قد تشارك فيها 10،11،17،37. تعرف إحدى الشاشات الشائعة والمفيدة لتحديد التفاعلات الجينية باسم "قمع النسخ المتعددة أو عدد النسخ المرتفع".

تتطلب هذه الشاشة سلالة (سلالات) متحولة للاستعلام تظهر نمطا ظاهريا لفقدان الوظيفة، متبوعة بتحويل سلالة (سلالات) الاستعلام المتحور هذه باستخدام مكتبة جينومية أو cDNA عالية النسخ. بعد ذلك ، يتم فحص المحولات التي تم الحصول عليها لتحديد تلك الجينات ، والتي عندما يتم التعبير عنها بشكل مفرط ، تقمع النمط الظاهري المرتبط بسلالة (سلالات) متحولة الاستعلام. هذا النوع من التفاعل الجيني بين السلالة الطافرة المحددة والجينات (الجينات) الموجودة في استنساخ مكتبة البلازميد يؤدي إلى عزل وتحديد المنتجات الجينية التي من المحتمل أن تعمل في نفس المسار أو تؤثر على نفس العملية البيولوجية4. وبالتالي ، توفر هذه الشاشة نظرة ثاقبة على وظائف الجين (الجينات) ذات الأهمية وتنظيمها الوظيفي في المسارات والعمليات البيولوجية في الجسم الحي. تقليديا ، تم استخدام هذه الشاشة على نطاق واسع في S. cerevisiae 38,39,40,41,42.

الهدف من هذا العمل هو وصف بروتوكول بسيط ومباشر لتنفيذ فحص جيني متعدد النسخ في S. pombe. قمنا بتنفيذ الشاشة باستخدام سلالة S. pombe التي تحمل حذف عامل استطالة النسخ ell1. ELL هي عائلة من عوامل استطالة النسخ ، والتي توجد في مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، من الخميرة الانشطارية إلى البشر. وظائف Ell1 بدأت فقط في الفهم في S. pombe. وقد سلطت أعمال سابقة الضوء على دور Ell1 في النمو الأمثل خلال ظروف النمو الطبيعية وفي البقاء على قيد الحياة خلال ظروف الإجهاد السام للوراثة26. لقد استخدمنا فحص المثبطات متعددة النسخ كأحد الأساليب للكشف عن الآلية الجزيئية الكامنة وراء دور Ell1 في حساسية الإجهاد السام الوراثي في S. pombe26. تم تحويل مكتبة S. pombe cDNA المشفرة بالبلازميد متعدد النسخ إلى متحور S. pombe ell1 فارغ يظهر حساسية ل 4-NQO. في وقت لاحق ، تم اختيار تلك المحولات التي يمكن أن تنمو في وجود 4-NQO.

أدى عزل البلازميدات عن هذه المحولات وتسلسل الإدخالات الموجودة في هذه البلازميدات إلى تحديد اثنين من المفاعلات الجينية الجديدة ل ell1+ في S. pombe و rax2+ و osh6 +. كما حددت دراسة سابقة باستخدام شاشة جينية مماثلة في S. pombe البروتين المضاد لإسكات الصوت ، epe1 + ، كمثبط متعدد النسخ للأنماط الظاهرية المرتبطة بحذف ell1 43. لقد استخدمنا أيضا هذه الطريقة في تحديد المثبطات متعددة النسخ للوحدة الفرعية Rpb9 غير الأساسية ل S. pombe RNA polymerase II (ملاحظات غير منشورة). بشكل جماعي ، تؤكد هذه النتائج فائدة نهج الفحص الجيني متعدد النسخ المثبط كوسيلة لتحديد الجينات / البروتينات المفترضة التي تظهر تفاعلا جينيا مع جين مرغوب فيه ذي أهمية ، مما يوضح الوظيفة والمسارات والعمليات التي قد يشارك فيها الجين محل الاهتمام.

لاستخدام الشاشة الموضحة في هذا العمل ، من المهم أولا أن يكون لديك سلالة متحولة للاستعلام تظهر نمطا ظاهريا واضحا مرتبطا بالطفرة ، والتي يمكن استخدامها لعزل المثبط (المثبطات) متعدد النسخ. علاوة على ذلك ، سيعتمد نجاح هذه الشاشة على توفر مكتبة تمثيلية عالية الجودة وجيدة تحتوي على نسخ مستنسخة تمثل أكبر عدد ممكن من الجينات من النوع البري أو cDNAs المقابلة لها. تقليديا ، تم استخدام كل من مكتبات الجينوم و cDNA في هذه الشاشات ، ولكن مكتبات cDNA تتمتع بميزة كونها مصنوعة من mRNAs المعبر عنها في الخلية / الكائن الحي. علاوة على ذلك ، فإن الكفاءة العالية في تحويلها إلى خلايا الخميرة أمر حتمي لنجاح الشاشة لأنه من المهم فحص عدد كبير من المحولات ، مما يزيد من احتمال تحديد المثبطات. إذا تم الحصول على عدد أقل من المحولات على لوحة التحكم بعد تحويل المكتبة إلى سلالة متحورة للاستعلام باستخدام بروتوكول خلات الليثيوم ، فيمكن استخدام الكهربية لتحويل المكتبة.

من المستحسن أيضا توحيد بروتوكول التحويل أولا باستخدام بلازميد آخر قبل تحويل المكتبة. خلاف ذلك ، سيؤدي ذلك دون داع إلى فقدان المكتبة. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا حساسية 4-NQO كنمط ظاهري متحور ، ولكن يجب تصميم طرق / فحوصات فحص مناسبة لاختيار المثبطات بناء على النمط الظاهري المتحور المحدد للاهتمام. إذا لم يتم الحصول على أي محولات أو عدد قليل جدا من المحولات على اللوحة لاختيار المثبطات بعد تحويل المكتبة إلى سلالة متحورة الاستعلام ، فعندئذ إذا أمكن ، يجب استخدام شروط / مقايسات أقل صرامة عند طلاء المكتبة لاختيار المثبطات من أجل اكتشاف أكبر عدد ممكن من المثبطات الجينية قبل تأكيدها في ظل ظروف عالية الصرامة. بالإضافة إلى استخدام الهضم التقييدي لاختبار وجود الإدراج في استنساخ البلازميد المثبط المحدد ، يمكن استخدام PCR باستخدام الاشعال الخاصة بالمتجه لتضخيم جزء الحمض النووي المطلوب للإدراج. بدلا من ذلك ، يمكن إعطاء استنساخ البلازميد المثبط مباشرة للتسلسل ، وتجنب الحاجة إلى تقييد الهضم أو PCR.

يمكن أيضا اعتماد هذه الشاشة للخمائر الأخرى غير S. cerevisiae و S . pombe إذا كانت هناك مجموعة أدوات وراثية فيما يتعلق بالسلالات المتحولة المناسبة والبلازميدات وبنى المروج التي من شأنها تسهيل التعبير المفرط عن الجينات ، مما يسمح بإنقاذ النمط الظاهري المتحور الموجود في خلية الخميرة المضيفة. علاوة على ذلك، مع توفر الموارد على نطاق الجينوم، بما في ذلك جمع طفرات الحذف على نطاق الجينوم44 ومكتبات التعبير الزائد37، يمكن أيضا إجراء هذه الشاشة عن طريق تحويل بلازميدات استعلام واحدة أو بضع بلازميدات استعلام إلى مجموعة منهجية من مجموعة سلالات الخميرة المتحولة أو عن طريق تحويل مجموعة منهجية من جمع البلازميد المفرط في التعبير إلى واحد أو عدد قليل من سلالات الاستعلام المتحورة45 . في الختام ، يمكن تعميم هذا النهج بوضوح على مجموعة واسعة من الأسئلة التجريبية في الكائنات الحية المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة بحثية مقدمة من إدارة التكنولوجيا الأحيائية بحكومة الهند (المنحة رقم BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) إلى نيميشا شارما. يشكر المؤلفون البروفيسور تشارلز هوفمان (كلية بوسطن ، الولايات المتحدة الأمريكية) على هدية مكتبة S. pombe cDNA والبروفيسور سوزان فورسبورغ على بلازميدات الخميرة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-NQO Sigma N8141
Acetic Acid, glacial Sigma 1371301000
Adenine Sulphate Himedia GRM033
Agar Himedia GRM026
Agarose Lonza 50004L
Ammonium Chloride Himedia MB054
BamHI Fermentas ER0051
Biotin Himedia RM095
Boric Acid Himedia MB007
Calcium Chloride  Sigma C4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma C0549
Citric Acid Himedia RM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrous Himedia GRM3960
single stranded DNA from Salmon testes Sigma D7656
EDTA disodium Sigma 324503
Ferric Chloride Hexahydrate Himedia RM6353
Glucose Amresco 188
Ionositol Himedia GRM102
Isopropanol Qualigen Q26897
Leucine Himedia GRM054
Lithium Acetatae Sigma 517992
Magnesium Chloride Hexahydrate Himedia MB040
Molybdic Acid Himedia RM690
Nicotinic Acid Himedia CMS177
PEG, MW 4000 Sigma 81240
Pentothinic Acid Himedia TC159
Phenol Himedia MB082
Plasmid Extraction Kit Qiagen 27104
Potassium Chloride Sigma P9541
Potassium hydrogen Pthallate Merc DDD7D670815
Potassium iodide Himedia RM1086
RNAse Fermentas EN0531
SDS Himedia GRM205
Sodium Hydroxide Himedia GRM1183
Sodium Sulphate Himedia RM1037
Tris free Base Himedia MB209
Uracil Himedia GRM264
Yeast Extract Powder Himedia RM668
Zinc Sulphate Heptahydrate Merc DJ9D692580

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
  2. Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
  3. Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712 (2015).
  4. Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).
  6. Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).
  7. Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
  8. Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
  9. Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840 (2018).
  10. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  11. Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
  12. Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
  13. Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  14. Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
  15. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  16. Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
  17. Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
  18. Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
  19. Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
  20. Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
  21. Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
  22. Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
  23. Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
  24. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  25. Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
  26. Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).
  27. Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969 (2016).
  28. Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. Fission yeast: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932 (2006).
  30. Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090 (2006).
  32. Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
  33. Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601 (2021).
  34. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).
  35. Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
  36. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  37. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  38. Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
  39. Melnykov, A. V., Elson, E. L. MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444 (2019).
  40. Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
  41. Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
  42. Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
  43. Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
  44. Kim, D. -U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
  45. Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).

Tags

علم الأحياء، العدد 187، الشاشة الوراثية، مثبطات النسخ المتعددة، Schizosaccharomyces pombe، Ell1، تنظيم الجينات، استطالة النسخ
الفحص الجيني لتحديد مثبطات النسخ المتعددة في <em>Schizosaccharomyces pombe</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D.,… More

Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D., Sharma, N. Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe. J. Vis. Exp. (187), e63967, doi:10.3791/63967 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter