Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Screening genetico per l'identificazione di soppressori multicopia in Schizosaccharomyces pombe

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/63967
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1University School of Biotechnology, G.G.S. Indraprastha University
* These authors contributed equally

Summary

Questo lavoro descrive un protocollo per uno screening genetico multicopia soppressore in Schizosaccharomyces pombe. Questa schermata utilizza una libreria plasmidica dell'intero genoma per identificare cloni soppressori di un fenotipo con perdita di funzione associato a un ceppo mutante di query. Nuovi soppressori genetici del mutante nullo ell1 sono stati identificati utilizzando questa schermata.

Abstract

L'identificazione delle interazioni genetiche è un potente strumento per decifrare le funzioni dei geni fornendo approfondimenti sulle loro relazioni funzionali con altri geni e sull'organizzazione in percorsi e processi biologici. Sebbene la maggior parte degli screening genetici siano stati inizialmente sviluppati in Saccharomyces cerevisiae, una piattaforma complementare per l'esecuzione di questi screening genetici è stata fornita da Schizosaccharomyces pombe. Uno degli approcci comuni utilizzati per identificare le interazioni genetiche è la sovraespressione di cloni da una libreria di plasmidi ad alto numero di copie del genoma in un mutante con perdita di funzione, seguita dalla selezione di cloni che sopprimono il fenotipo mutante.

Questo articolo descrive un protocollo per eseguire questo screening genetico basato sulla "soppressione multicopia" in S. pombe. Questo screening ha contribuito a identificare i soppressori multicopia del fenotipo genotossico sensibile allo stress associato all'assenza del fattore di allungamento della trascrizione Ell1 in S. pombe. Lo screening è stato avviato dalla trasformazione del ceppo mutante nullo ell1 con una libreria di plasmidi di cDNA S. pombe ad alto numero di copie e selezionando i soppressori su piastre EMM2 contenenti 4-nitrochinolina 1-ossido (4-NQO), un composto genotossico che induce stress. Successivamente, il plasmide è stato isolato da due colonie soppressori selezionate e digerito da enzimi di restrizione per rilasciare il DNA inserito. I plasmidi che rilasciano un frammento di DNA inserto sono stati ritrasformati nel ceppo di delezione ell1 per confermare la capacità di questi cloni plasmidi soppressori di ripristinare la crescita del mutante di delezione ell1 in presenza di 4-NQO e altri composti genotossici. I plasmidi che mostrano un salvataggio del fenotipo di delezione sono stati sequenziati per identificare i geni responsabili della soppressione del fenotipo genotossico sensibile allo stress associato alla delezione ell1.

Introduction

Le reti di interazioni genetiche forniscono informazioni funzionali sui geni e delineano percorsi e processi biologici in cui questi geni possono essere coinvolti in vivo. Inoltre, possono anche fornire informazioni su come diversi geni interagiscono tra loro, risultando in uno specifico fenotipo 1,2,3. Nel corso degli anni, una varietà di schermi genetici sono stati progettati dai ricercatori per rispondere a domande biologiche fondamentali e studiare le malattie umane. Gli screening per l'identificazione delle interazioni genetiche possono essere eseguiti in diversi modi. Le interazioni genetiche identificate in diversi schermi genetici possono rappresentare relazioni meccanicistiche distinte tra geni. Inoltre, gli studi hanno rivelato che un insieme comune di interazioni genetiche sono condivise da geni che codificano proteine appartenenti allo stesso percorso o complesso 4,5. Pertanto, le reti di interazione genetica possono essere utilizzate per stabilire l'organizzazione funzionale in una cellula, in cui i geni che condividono i profili più simili appartengono allo stesso complesso o percorso, quei geni che condividono profili un po 'meno simili appartengono allo stesso processo biologico e quei geni che mostrano profili sovrapposti ma più diversi riflettono membri appartenenti allo stesso compartimento cellulare6.

Gli schermi di interazione genetica basati sulla soppressione del dosaggio ("soppressione ad alta copia o multicopia") sono uno degli approcci comunemente usati. Questi screening possono essere eseguiti trasformando un ceppo mutante interrogativo con una libreria genomica o di cDNA ad alto numero di copie, seguita da adeguate tecniche di analisi/selezione per identificare la soppressione o il miglioramento delle interazioni genetiche 7,8,9. Per garantire una copertura completa dell'intero genoma, questi screening sono stati effettuati anche sovraesprimendo un gene specifico di interesse in una raccolta di mutanti con perdita di funzione a livello di genoma o sovraesprimendo una libreria genomica o cDNA codificata da plasmidi ad alto numero di copie in una query con perdita di funzione mutante 9,10,11,12,13,14,15 . La strategia multicopia potrebbe anche funzionare utilizzando un approccio dominante/sovraespressione utilizzando un promotore regolabile.

I principali vantaggi dell'utilizzo di screening basati su soppressori sono che la soppressione di un fenotipo preesistente in un ceppo mutante da parte di un altro gene stabilisce una relazione genetica tra questi due prodotti genici che potrebbe non essere stata dimostrata utilizzando altri approcci. In secondo luogo, è stato osservato che la presenza di una mutazione preesistente sensibilizza una particolare via, consentendo di identificare ulteriori componenti di quella via mediante l'isolamento di soppressori, che potrebbero non essere stati identificati da selezioni genetiche più dirette. Inoltre, questa schermata può essere utilizzata per identificare i soppressori che hanno diversi meccanismi di soppressione16. Le interazioni soppressori di solito si verificano tra geni che sono funzionalmente correlati e possono essere utilizzati per chiarire le gerarchie nei percorsi. L'esatto meccanismo sottostante alla soppressione può differire in base a diversi fattori, tra cui il tipo di query mutante utilizzato nello schermo, le condizioni sperimentali e il livello di espressione genica. Uno dei comuni meccanismi di soppressione del dosaggio coinvolge geni che codificano prodotti che funzionano insieme nello stesso complesso o in parallelo nello stesso processo cellulare / biologico. I risultati di tali screening in organismi modello più semplici come il lievito possono essere estesi agli organismi eucarioti superiori poiché la maggior parte dei percorsi e dei processi biologici fondamentali sono conservati attraverso l'evoluzione.

Questi schermi genetici possono anche essere modificati in diversi modi per rispondere a diverse domande biologiche. Ad esempio, è possibile identificare geni ortologhi di diversi organismi che possono sopprimere il fenotipo del ceppo mutante di query. È stato anche usato per delineare potenziali meccanismi di resistenza e determinare bersagli proteici di nuovi composti antibatterici17,18, antifungini19,20, antiparassitari 21 e antitumorali 22. Questo schermo è stato sfruttato anche per identificare i soppressori dell'attività dei farmaci il cui meccanismo d'azione non è noto. Pertanto, in linea di principio, questi schermi soppressori multicopia possono essere ottimizzati e utilizzati in una varietà di applicazioni in diversi organismi. Sebbene la maggior parte degli screening genetici impiegati dai ricercatori sul lievito siano stati inizialmente sviluppati in S. cerevisiae, S. pombe è emerso come un sistema modello complementare per l'esecuzione di vari screening genetici e saggi23. Inoltre, l'organizzazione genomica e i processi biologici in S. pombe, come la presenza di introni in più geni, la complessità delle origini della replicazione del DNA, la struttura del centromero, l'organizzazione del ciclo cellulare e la presenza del macchinario RNAi, mostrano una maggiore somiglianza tra S. pombe e gli eucarioti superiori23,24, sottolineando l'importanza di progettare e utilizzare strumenti genetici in S. pombe.

Questo articolo descrive un protocollo per identificare gli interattori genetici basati sulla "soppressione del dosaggio" di un fenotipo mutante con perdita di funzione in S. pombe. La base di questo protocollo è che si tratta di un metodo rapido ed efficiente per lo screening di una libreria di cDNA che sovraesprime geni wild-type su un plasmide multicopia e/o da un forte promotore. Questo protocollo ha quattro fasi principali: trasformazione della libreria in un ceppo mutante di query, selezione di cloni plasmidi che sopprimono il fenotipo desiderato del ceppo mutante di query, recupero del plasmide da questi cloni soppressori e identificazione del gene responsabile della soppressione del fenotipo. Come è vero per qualsiasi metodo basato sulla selezione e l'identificazione di cDNA da una libreria, il successo dello schermo dipende dall'utilizzo di una libreria di alta qualità e alta complessità in quanto lo schermo può recuperare solo quei cloni di cDNA presenti nella libreria.

Utilizzando questo protocollo, abbiamo identificato con successo due nuovi soppressori del fenotipo genotossico sensibile allo stress del mutante nullo S. pombe ell1. La famiglia ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) di fattori di allungamento della trascrizione sopprime la pausa transitoria della RNA polimerasi II su modelli di DNA in saggi biochimici in vitro e sono conservati in vari organismi, dal lievito di fissione all'uomo25. Lavori precedenti hanno fornito prove che un mutante nullo di S. pombe ell1 mostra sensibilità genotossica allo stress in presenza di 4-nitrochinolina 1-ossido (4-NQO) e metil metansolfonato (MMS)26. Pertanto, abbiamo trasformato una libreria di cDNA multicopia codificata da plasmide S. pombe nella query S. pombe ell1 null mutant e identificato due cloni putativi che mostravano la capacità di sopprimere la sensibilità genotossica allo stress del mutante nullo S. pombe ell1 in presenza di 4-NQO, un composto che induce lesioni del DNA. Il successivo sequenziamento dell'inserto presente nei cloni plasmidi ha identificato che i geni che codificano rax2+ e osh6+ erano responsabili della soppressione della sensibilità genotossica allo stress del mutante nullo ell1 quando sovraespresso nel mutante nullo ell1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Trasformazione della libreria cDNA nella query S. pombe mutante ceppo per lo screening di soppressori multicopia

NOTA: Il metodo standard di litio-acetato27 è stato seguito per trasformare la libreria di cDNA di S. pombe nella query S. pombe ell1Δ ceppo con alcune modifiche:

  1. Coltivare il ceppo S. pombe ell1Δ a 32 °C su una piastra di mezzo YE (Tabella 1) integrata con 225 μg/ml ciascuno di adenina, leucina e uracile. Inoculare un ciclo pieno di inoculo di ceppo ell1Δ dalla piastra sopra in 15-20 mL di terreno YE integrato con 225 μg/ml ciascuno di adenina, leucina e uracile. Incubarlo per una notte a 32 °C agitando (200-250 giri/min).
  2. Il giorno successivo, diluire la coltura per una notte in 100 ml di terreno YE fresco con gli integratori desiderati a un OD 600 nm (densità ottica a 600 nm) di 0,3 e incubarlo a 32 °C agitando a 200-250 rpm fino a quando l'OD600 nm raggiunge la fase intermedia.
  3. Dividere la coltura da 100 mL in due provette da centrifuga da 50 ml, seguita da centrifugazione a temperatura ambiente per 10 minuti a 4.000 × g.
  4. Scartare il surnatante e lavare il pellet cellulare con 1 mL di acqua sterile, cioè risospendere le cellule in 1 mL di acqua sterile e centrifugare a 4.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Eliminare il surnatante e lavare ogni pellet cellulare con 1 mL di soluzione 1x LiAc-TE (100 mM di acetato di litio, 10 mM di Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) come descritto al punto 1.4.
  6. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet cellulare in 250 μL di 1x LiAc-TE. Utilizzare queste cellule competenti di S. pombe (500 μL) per la trasformazione con il DNA di interesse. Trasferire 125 μL delle cellule competenti in quattro diverse provette sterili per microcentrifuga per le successive fasi di trasformazione.
  7. Far bollire il DNA del vettore dai testicoli di salmone o dallo sperma di aringa per 1 minuto e immediatamente mettere sul ghiaccio. Per ogni trasformazione, aggiungere 10 μL di DNA vettore denaturato a singolo filamento da 10 mg/mL alla provetta della microcentrifuga contenente 125 μL delle cellule competenti, seguita da una delicata miscelazione utilizzando una punta di micropipetta. Successivamente, aggiungere 50 μg della libreria di cDNA di S. pombe alla provetta di microcentrifuga contenente miscela di DNA contenente cellule portatrici.
  8. Incubare le provette della microcentrifuga a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi aggiungere 260 μL di soluzione di polietilenglicole-acetato di litio (40% [p/v] PEG 4.000, 100 mM di acetato di litio, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) ai tubi e mescolare delicatamente con l'aiuto di una punta di micropipetta.
  9. Incubare le provette di microcentrifuga contenenti la miscela di trasformazione a 32 °C per 2 ore senza agitare. Aggiungere 43 μL di dimetilsolfossido (DMSO) preriscaldato al tubo della microcentrifuga e mescolare delicatamente. Successivamente, esporre i tubi a shock termico a 42 °C per 5 min.
  10. Pellettare le celle a 4.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e rimuovere la soluzione residua di PEG-LiAc-TE con l'aiuto di una punta di micropipetta.
  11. Risospendere le cellule in 100 μL di acqua sterile e placcare su una piastra EMM2 (Tabella 1) (150 mm) con supplementi necessari e 0,2 μg/ml di 4-NQO.
  12. Incubare le piastre a 32 °C per 5-6 giorni per consentire la comparsa di colonie sulle piastre. Strisciare le colonie ottenute sulla stessa piastra di mezzo in presenza di 0,2 μg/mL di 4-NQO e utilizzarle per ulteriori screening.
  13. Per un esperimento di trasformazione in libreria, utilizzare 500 μL di cellule competenti (125 μL di cellule competenti x 4 provette di microcentrifuga) per la trasformazione come descritto nei passaggi da 1.8 a 1.14 sopra.
  14. Come controllo, piastra 1/10della miscela di trasformazione su una piastra EMM2 (150 mm) con supplementi necessari, ma priva di 4-NQO, per calcolare il numero totale di cloni della libreria ottenuti dopo la trasformazione della libreria e schermo per l'isolamento dei cloni soppressori.

2. Testare e validare il salvataggio/soppressione del fenotipo associato al ceppo mutante interrogato dal putativo suppressor

NOTA: Sono stati effettuati saggi a campione di stress come descritto di seguito per testare e convalidare il salvataggio/soppressione della sensibilità allo stress 4-NQO associata alla delezione ell1 da parte del presunto soppressore.

  1. Aggiungere 100-200 μL di acqua sterile in ciascuno dei diversi pozzetti di una piastra sterile da 96 pozzetti.
  2. Prelevare una piccola quantità di inoculo da ciascuna delle diverse colonie ottenute dopo la trasformazione della libreria di cDNA sulla piastra contenente 4-NQO utilizzando uno stuzzicadenti sterile o una punta di micropipetta da 20-200 μL. Aggiungere l'inoculo di ciascuna delle diverse colonie in pozzetti indipendenti separati della piastra di microtitolazione contenenti 100-200 μL di acqua sterile. Mescolare accuratamente.
  3. Spot 3 μL della sospensione cellulare da ciascun pozzetto su piastre di agar EMM2 contenenti adenina (225 μg/mL) e uracile (225 μg/mL) ma prive di leucina (il marcatore auxotrofico selezionabile presente sul vettore plasmidico utilizzato per la costruzione della libreria utilizzata in questo lavoro). Aggiungere le concentrazioni appropriate di 4-NQO alle piastre secondo necessità.
  4. Incubare le piastre a 32 °C per 3-4 giorni per consentire alle cellule di crescere. Identificare le colonie che mostrano crescita in presenza di diverse concentrazioni di 4-NQO come soppressori putativi.
  5. Per convalidare ulteriormente i soppressori, far crescere i soppressori selezionati insieme a ceppi di controllo appropriati durante la notte a 32 °C con agitazione (200-250 giri/min) in mezzo EMM2 contenente 225 μg/ml ciascuno di adenina e uracile ma privo di leucina.
  6. Il giorno successivo, diluire le cellule a un OD 600 nm di 0,3 in terreno EMM2 fresco e farle crescere a 32 °C agitando fino alla fase intermedia (circa OD600 nm di 0,6-0,8).
  7. Individuare le diluizioni seriali appropriate (1:10 o 1:5) delle colture su piastre EMM2 con supplementi necessari contenenti 0,4 μM 4-NQO o 0,01% MMS. Per il controllo, individuare i ceppi su una piastra EMM2 con integratori necessari ma privi di qualsiasi agente dannoso per il DNA.
  8. Incubare le piastre a 32 °C per 3-5 giorni per monitorare la crescita.
    NOTA: Saggi appropriati basati sul fenotipo associato al ceppo mutante interrogato devono essere utilizzati per testare il salvataggio o la soppressione del fenotipo. Ad esempio, se è necessario identificare i soppressori di un fenotipo sensibile al freddo di un ceppo mutante interrogante, il test per testare e convalidare i cloni soppressori comporterebbe la crescita di trasformanti a bassa temperatura.
  9. Individua i ceppi mutanti trasformati con il gene di interesse a lunghezza intera (Spell1 in questo caso) o il vettore vuoto come controlli positivi e negativi, rispettivamente, insieme ai trasformanti della libreria.

3. Isolamento del plasmide dai cloni soppressori di S. pombe

NOTA: L'isolamento plasmidico da S. pombe è stato effettuato seguendo il protocollo descritto in Lievito di fissione: un manuale di laboratorio28 con alcune modifiche.

  1. Inoculare una singola colonia di lievito in mezzo EMM2 contenente 225 μg/ml di adenina e uracile e far crescere le cellule durante la notte a 32 °C agitando a 200-250 giri/min. Il giorno successivo, raccogliere 5 cellule O.D. (cioè 10 mL di coltura di O.D. 0,5) centrifugando per 2 minuti a 4.000 × g a temperatura ambiente.
  2. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 0,2 mL di tampone di lisi (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) e 1 mM Na2EDTA).
  3. Aggiungere 0,2 mL di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (25:24:1) e 0,3 g di perle di vetro lavate con acido alla provetta della microcentrifuga. Vortice la provetta della microcentrifuga per 2 min a 4 °C e incubare su ghiaccio per 1 min. Ripetere questo passaggio 6x.
  4. Centrifugare il tubo a 10.000 × g per 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire lo strato acquoso superiore in una provetta da microcentrifuga fresca e aggiungere 200 μL di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (25:24:1).
  5. Centrifugare il tubo a 10.000 × g per 10 minuti. Trasferire lo strato acquoso superiore in un tubo fresco e aggiungere due volumi di etanolo al 100% (~400 μL) e 1/10 di volume di acetato di sodio (3 M, pH 5,8) (~20 μL) al tubo. Incubare la provetta della microcentrifuga -70 °C per 1 ora.
  6. Precipitare il DNA mediante centrifugazione a 10.000 × g per 15 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Lavare il pellet di DNA con etanolo al 70% (~500 μL) e tenerlo a temperatura ambiente per asciugare all'aria.
  7. Risospendere il DNA in 20 μL di acqua sterile. Utilizzare 2-5 μL di DNA plasmidico per la trasformazione di cellule E. coli competenti.
    NOTA: Il plasmide può anche essere isolato dalle cellule di lievito utilizzando uno qualsiasi dei kit di isolamento del plasmide di lievito disponibili in commercio.

4. Identificazione del gene codificato dal clone soppressore

  1. Trasformare i plasmidi di lievito isolati in E. coli Top10 ceppo [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] utilizzando il protocollo standard29 e diffondere le cellule su piastre LB (Luria Broth) con gli antibiotici necessari.
  2. Isolare il/i plasmide dai trasformanti di E. coli utilizzando il protocollo standard di lisi alcalina29 e seguire le combinazioni appropriate di enzimi di restrizione per verificare il rilascio del frammento di DNA dell'inserto mediante digestione di restrizione.
    NOTA: Il plasmide soppressore 84 è stato digerito con l'enzima di restrizione Bam HI e il plasmide soppressore 104 è stato digerito con enzimi di restrizione PstI / BamHI.
  3. Ritrasformare i plasmidi che mostrano il rilascio dell'inserto dopo la digestione di restrizione nel ceppo ell1 Δ per verificare la loro capacità di salvare il fenotipo genotossico sensibile allo stress del ceppo ell1Δ.
  4. Selezionare i cloni plasmidi che mostrano la soppressione della sensibilità genotossica allo stress e sequenziare il frammento di DNA presente in questi cloni plasmidi utilizzando primer avanti e inverso vettoriali specifici.
    NOTA: In questo studio, è stato utilizzato il primer universale in avanti specifico del promotore adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30.
  5. Per identificare il gene responsabile della soppressione, allineare la sequenza ottenuta utilizzando NCBI nucleotide blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) o Pombase sequence alignment tool (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Selezionare la sequenza che mostra il massimo allineamento e identificarla come il gene per il plasmide soppressore multicopia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Screening per soppressori multicopia della sensibilità genotossica associata alla delezione ell1 in S. pombe
Abbiamo eseguito lo screening genetico utilizzando il protocollo sopra descritto per identificare i soppressori multicopia del fenotipo con perdita di funzione del ceppo mutante di delezione ell1. La sensibilità correlata alla crescita del ceppo di delezione ell1 osservata in presenza dell'agente genotossico 4-NQO è stata adottata come fenotipo di perdita di funzione da selezionare per i soppressori multicopia. La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica dello schermo genetico. Per iniziare lo screening, la sensibilità genotossica allo stress del mutante di delezione ell1 (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1 Δ :: kanMX6) è stata confermata per la prima volta rispetto al suo ceppo isogeno wild-type (h- ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1) in presenza di 4-NQO (Figura 2A). Successivamente, la query S. pombe ell1 null mutant è stata trasformata con una libreria di cDNA S. pombe ad alto numero di copie per selezionare quei cloni plasmidi che potrebbero sopprimere/salvare la sensibilità correlata alla crescita 4-NQO del mutante nullo ell1. Questa libreria contiene ~6 × 105 frammenti di cDNA di S. pombe clonati nel vettore di sovraespressione pLEV3 S. pombe sotto il controllo del promotore adh1 30. Come controllo, 1/10della miscela di trasformazione è stato anche placcato su piastre EMM2 prive di 4-NQO per calcolare il numero totale di cloni ricombinanti ottenuti dopo la trasformazione della libreria, un'indicazione della copertura della libreria, e schermati per l'isolamento dei cloni soppressori. Questo è fondamentale, poiché lo screening di un minor numero di cloni ridurrà la possibilità di identificare i cloni soppressori. 

La figura 2B mostra immagini rappresentative del controllo e piastre contenenti 4-NQO. Come mostrato in figura, un gran numero di colonie sono ottenute sulla piastra di controllo priva di 4-NQO mostrando una buona copertura della libreria. Come previsto, sono stati ottenuti meno trasformanti sulla piastra 4-NQO poiché questi trasformanti rappresentano probabilmente i presunti soppressori della sensibilità 4-NQO del mutante nullo ell1 . Successivamente, le diverse colonie di trasformanti ottenute su piastre EMM2 contenenti 0,2 μM 4-NQO sono state ulteriormente striate o individuate su piastre EMM2 contenenti 0,2 μM 4-NQO per confermare la capacità di questi trasformanti di crescere in presenza di 4-NQO. È stato osservato che 620 colonie di trasformanti sono state in grado di crescere su piastre EMM2 contenenti 4-NQO da 0,2 μM.

Validazione della capacità dei cloni soppressori putativi di ripristinare la crescita del mutante di delezione ell1 in condizioni di stress genotossico
Per confermare i presunti soppressori, è importante testare il salvataggio del fenotipo desiderato in condizioni di maggiore rigore, come mostrato nella rappresentazione schematica (Figura 3A). Pertanto, i 620 trasformanti selezionati sono stati individuati su piastre EMM2 con 0,4 μM 4-NQO. Come si può vedere nella Figura 3B, solo 74 trasformanti hanno mostrato una crescita a 0,4 μM 4-NQO. Successivamente, questi 74 trasformanti sono stati individuati su piastre EMM2 contenenti 0,8 μM 4-NQO, ed è stato osservato che solo 16 hanno mostrato una crescita in presenza di 0,8 μM 4-NQO (Figura 3C). Per confermare ulteriormente queste osservazioni, questi 16 trasformanti sono stati individuati su piastre EMM2 con supplementi richiesti, contenenti 0,8 μM 4-NQO o nessun 4-NQO (controllo), insieme al mutante di delezione ell1 trasformato con vettore vuoto. I risultati di questi test di spotting hanno rivelato che, come previsto, il ceppo di delezione ell1 trasformato con vettore vuoto, così come tutti i 16 trasformanti, hanno mostrato una crescita sulla piastra priva di 4-NQO. In confronto, mentre il mutante di delezione ell1 contenente solo il vettore vuoto non mostrava crescita a 0,8 μM 4-NQO, sei trasformanti mostravano una crescita a 0,8 μM 4-NQO (Figura 3D), suggerendo che i cloni della libreria presenti in essi avevano la capacità di sopprimere il fenotipo genotossico dello stress del mutante nullo ell1.

Identificazione del gene codificato dal clone soppressore
Abbiamo poi selezionato 02 soppressori genetici del ceppo di delezione ell1, sup 84 e sup 104, mostrando la completa soppressione della sensibilità alla crescita associata a ell1 in presenza di 4-NQO. I cloni plasmidi della libreria sono stati isolati da questi due soppressori di lievito e trasformati in cellule competenti di E. coli. Successivamente, il plasmide è stato isolato dalle cellule di E. coli utilizzando i protocolli standard31. I due plasmidi isolati, etichettati come 84 e 104, sono stati sottoposti a digestione di restrizione, che ha rivelato la presenza di circa 1.000 bp e 800 bp inserire frammenti di DNA, rispettivamente (Figura 4A, B). Per convalidare ulteriormente i risultati di questo screening soppressore, questi plasmidi sono stati ritrasformati nel mutante di delezione ell1 e controllati se potevano ripristinare la crescita del mutante nullo ell1 in presenza di 4-NQO. I saggi dello stress spot hanno rivelato che i cloni plasmidi soppressori hanno provocato la soppressione della sensibilità alla crescita associata a 4-NQO quando reintrodotti nel mutante nullo ell1, suggerendo che la soppressione era plasmidico-dipendente (Figura 4C). Inoltre, abbiamo deciso di determinare se questi cloni soppressori potessero anche sopprimere la sensibilità correlata alla crescita del ceppo di delezione ell1 in presenza di un altro composto che induce danni al DNA, MMS. I saggi a campione hanno dimostrato che la trasformazione dei cloni plasmidi soppressori nel mutante nullo ell1 ha determinato una maggiore crescita sul mezzo contenente MMS rispetto alla trasformazione del mutante di delezione ell1 con vettore vuoto, indicando che questi cloni plasmidi potrebbero sopprimere la sensibilità genotossica allo stress del mutante di delezione ell1 in presenza di entrambi gli agenti genotossici, cioè 4-NQO e MMS (Figura 4D).

Successivamente, per identificare il gene presente in questi cloni plasmidi soppressori, è stato effettuato il sequenziamento del frammento di DNA dell'inserto utilizzando il primer universale30 specifico del promotore adh1. La sequenza nucleotidica ottenuta è stata ricercata utilizzando lo strumento "BLAST at Ensembl" disponibile sul sito web PomBase (https://www.pombase.org), che ha rivelato che i due cloni plasmidi 84 e 104 contenevano rispettivamente i geni rax2+ e osh6+, fornendo prove che Rax2 e Osh6 erano responsabili della soppressione del fenotipo genotossico sensibile allo stress associato all'assenza di ell1+ in S. pombe . La conoscenza delle funzioni di entrambe queste proteine in S. pombe è limitata. Rax2 ha dimostrato di regolare la localizzazione di For3p per controllare la polarità cellulare durante la crescita vegetativa in S. pombe32. Osh6 è una proteina di trasporto lipidico che appartiene alla famiglia delle proteine correlate alla proteina legante l'ossisterolo. È coinvolto nel trasporto della fosfatidilserina dal reticolo endoplasmatico alla membrana plasmatica33.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica dello schermo genetico del soppressore multicopia. Questo protocollo ha quattro fasi principali: trasformazione della libreria in un ceppo mutante di query, selezione di cloni plasmidi che sopprimono il fenotipo desiderato del ceppo mutante di query, recupero del plasmide da questi cloni soppressori e identificazione del gene responsabile della soppressione del fenotipo. Abbreviazione: 4-NQO = 4-nitrochinolina 1-ossido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Screening per soppressori multicopia della sensibilità genotossica associata alla delezione ell1 in S. pombe. (A) Saggio del punto di stress che mostra la sensibilità 4-NQO del ceppo di S. pombe ell1-cancellato rispetto al suo ceppo isogeno wild-type. Diluizioni seriali (1:10) di ceppi appropriati sono state individuate su terreno EMM2 contenente 225 μg/ml ciascuno di adenina, leucina e uracile con o senza (controllo) 0,4 μM 4-NQO. Le piastre sono state poi incubate per 3-5 giorni a 32 °C. (B) Una libreria di cDNA ad alto numero di copie è stata trasformata in ceppo di S. pombe ell1-cancellato, e le colonie trasformate sono state placcate su terreno EMM2 privo di leucina ma contenente 0,2 μM 4-NQO. Una piccola aliquota della miscela di trasformazione è stata anche placcata su piastre EMM2 prive di 4-NQO, come controllo. Le lastre sono state incubate a 32 °C per 5-6 giorni e fotografate. Il pannello B mostra un'immagine rappresentativa di queste tavole. Abbreviazione: 4-NQO = 4-nitrochinolina 1-ossido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Validazione della capacità dei cloni soppressori putativi di sopprimere la sensibilità genotossica allo stress del mutante di delezione ell1 . (A) Una rappresentazione schematica dello screening dei trasformanti della libreria testando la soppressione del fenotipo desiderato. La crescita di 620 trasformanti è stata testata su concentrazioni crescenti di 4-NQO individuando diversi trasformanti su piastre EMM2 prive di leucina e contenenti (B) 0,4 μM 4-NQO o (C) 0,8 μM 4-NQO. Le lastre sono state incubate a 32 °C per 5-6 giorni e fotografate. Sono state mostrate immagini rappresentative di targhe. (D) Sedici trasformanti che mostravano una crescita su 0,8 μM 4-NQO sono stati individuati su piastre EMM2 prive di leucina ma contenenti 0,8 μM 4-NQO o non contenenti 4-NQO (controllo), insieme al ceppo di delezione ell1 trasformato con vettore vuoto. Le lastre sono state incubate a 32 °C per 5-6 giorni e fotografate. Solo sei colonie hanno mostrato la capacità di salvare ell1 delezione associata genotossica sensibilità allo stress. Abbreviazione: 4-NQO = 4-nitrochinolina 1-ossido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Identificazione dei cloni plasmidi soppressori. Le immagini in gel di agarosio della digestione di restrizione (A) del plasmide soppressore 84 con l'enzima di restrizione BamHI hanno rilasciato un inserto di ~ 1 kb. (B) Il plasmide soppressore 104 digerito con gli enzimi di restrizione PstI/BamHI ha rilasciato un inserto di ~800 bp. (C) 1:10 mutante nullo ell1 diluito serialmente trasformato con plasmidi, SUP 84 o SUP 104, sono stati individuati su piastre EMM2 prive di leucina e contenenti 0,4 μM 4-NQO o (D) 0,01% MMS. Nelle piastre di controllo, non è stato aggiunto alcun agente dannoso per il DNA. Le lastre sono state incubate a 32 °C per 4-5 giorni e fotografate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Composizione dei mezzi per la crescita di S. pombe. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I lieviti sono stati ampiamente utilizzati per studiare i processi biologici di base e i percorsi che sono evolutivamente conservati attraverso gli organismi eucarioti. La disponibilità di strumenti genetici e genomici insieme alla loro amenabilità a varie procedure biochimiche, genetiche e molecolari rendono i lieviti un eccellente organismo modello per la ricerca genetica34,35,36. Nel corso degli anni, vari screening genetici sono stati progettati dai ricercatori del lievito per identificare le interazioni genetiche che farebbero luce sulle funzioni dei singoli geni, nonché sui percorsi e sui processi biologici in cui possono essere coinvolti10,11,17,37. Uno degli schermi comuni e utili per identificare le interazioni genetiche è noto come "soppressione multicopia o ad alto numero di copie".

Questa schermata richiede uno o più ceppi mutanti di query che presentano un fenotipo con perdita di funzione, seguito dalla trasformazione di questo ceppo di query mutante con una libreria genomica o di cDNA ad alto numero di copie. Successivamente, i trasformanti ottenuti vengono sottoposti a screening per identificare quei geni che, se sovraespressi, sopprimono il fenotipo associato al ceppo mutante interrogato. Questo tipo di interazione genetica tra il ceppo mutante specifico e i geni presenti nei cloni della libreria plasmidica porta all'isolamento e all'identificazione di prodotti genici che possono agire nello stesso percorso o influenzare lo stesso processo biologico4. Pertanto, questa schermata fornisce approfondimenti sulle funzioni dei geni di interesse e sulla loro organizzazione funzionale in percorsi e processi biologici in vivo. Tradizionalmente, questo schermo è stato ampiamente utilizzato in S. cerevisiae 38,39,40,41,42.

L'obiettivo del presente lavoro è quello di descrivere un protocollo semplice e diretto per effettuare uno screening genetico di soppressione multicopia in S. pombe. Abbiamo effettuato lo screening utilizzando un ceppo di S. pombe che trasportava una delezione del fattore di allungamento della trascrizione ell1. ELL è una famiglia di fattori di allungamento della trascrizione, che sono presenti in una vasta gamma di organismi, dal lievito di fissione all'uomo. Le funzioni di Ell1 stanno solo cominciando ad essere comprese in S. pombe. Lavori precedenti avevano evidenziato il ruolo di Ell1 nella crescita ottimale durante le normali condizioni di crescita e nella sopravvivenza durante le condizioni di stress genotossico26. Abbiamo utilizzato lo screening multicopy suppressor come uno degli approcci per scoprire il meccanismo molecolare alla base del ruolo di Ell1 nella sensibilità genotossica allo stress in S. pombe26. Una libreria di cDNA di S. pombe codificata con plasmide multicopia è stata trasformata nel mutante nullo S. pombe ell1 che mostra sensibilità al 4-NQO. Successivamente, sono stati selezionati quei trasformanti che potrebbero crescere in presenza di 4-NQO.

L'isolamento dei plasmidi da questi trasformanti e il sequenziamento degli inserti presenti in questi plasmidi hanno portato all'identificazione di due nuovi interattori genetici di ell1+ in S. pombe, rax2+ e osh6+. Uno studio precedente che utilizzava uno screening genetico simile in S. pombe ha anche identificato la proteina anti-silenziamento, epe1+, come un soppressore multicopia dei fenotipi associati alla delezione ell1 43. Abbiamo anche usato questo metodo per identificare i soppressori multicopia della subunità Rpb9 non essenziale di S. pombe RNA polimerasi II (osservazioni non pubblicate). Collettivamente, questi risultati convalidano l'utilità dell'approccio di screening genetico multicopia come metodo per identificare geni / proteine putativi che mostrano interazione genetica con un gene desiderato di interesse, chiarendo la funzione, i percorsi e i processi in cui il gene di interesse può essere coinvolto.

Per utilizzare lo schermo descritto in questo lavoro, è importante avere prima un ceppo mutante di query che mostri un chiaro fenotipo associato alla mutazione, che può essere utilizzato per isolare i soppressori multicopia. Inoltre, il successo di questo screening dipenderà dalla disponibilità di una libreria rappresentativa di alta qualità e buona contenente cloni che rappresentano il numero massimo di geni wild-type o i loro corrispondenti cDNA. Tradizionalmente, in questi schermi sono state utilizzate sia librerie genomiche che cDNA, ma le librerie di cDNA hanno il vantaggio di essere costituite da mRNA espressi nella cellula / organismo. Inoltre, un'elevata efficienza della sua trasformazione nelle cellule di lievito è indispensabile per il successo dello screening perché è importante eseguire lo screening di un gran numero di trasformanti, aumentando la probabilità di identificare i soppressori. Se si ottengono meno trasformanti sulla piastra di controllo dopo la trasformazione della libreria nel ceppo mutante di query utilizzando il protocollo dell'acetato di litio, è possibile utilizzare l'elettroporazione per trasformare la libreria.

È inoltre consigliabile standardizzare prima il protocollo di trasformazione con un altro plasmide prima di trasformare la libreria. In caso contrario, comporterà inutilmente la perdita della libreria. Il protocollo qui descritto utilizza la sensibilità 4-NQO come fenotipo mutante, ma dovrebbero essere progettati metodi/saggi di screening adeguati per la selezione dei soppressori in base allo specifico fenotipo mutante di interesse. Se sulla piastra non si ottengono trasformanti o si ottengono pochissimi trasformatori da selezionare per i soppressori dopo la trasformazione della libreria nel ceppo mutante di query, allora, se possibile, condizioni / saggi meno rigorosi dovrebbero essere utilizzati quando si placca la libreria per selezionare i soppressori in modo da rilevare il maggior numero possibile di soppressori genetici prima di confermare quelli in condizioni di elevata rigore. Oltre a utilizzare la digestione di restrizione per verificare la presenza dell'inserto nei cloni plasmidi soppressori identificati, la PCR utilizzando primer vettori-specifici può essere utilizzata per amplificare il frammento di DNA dell'inserto desiderato. In alternativa, i cloni plasmidi soppressori possono essere somministrati direttamente per il sequenziamento, evitando la necessità di digestione di restrizione o PCR.

Questo screening può essere adottato anche per lieviti diversi da S. cerevisiae e S. pombe se è disponibile un kit di strumenti genetici rispetto a ceppi mutanti, plasmidi e costrutti promotori appropriati che faciliterebbero la sovraespressione dei geni, consentendo il salvataggio del fenotipo mutante presente nella cellula di lievito ospite. Inoltre, con la disponibilità di risorse a livello di genoma, compresa la raccolta di mutanti di delezione a livello di genoma44 e le librerie di sovraespressione37, questo screening può anche essere eseguito trasformando uno o più plasmidi di query in una serie sistematica di raccolta di ceppi mutanti di lievito o trasformando una serie sistematica di raccolta di plasmidi di sovraespressione in uno o pochi ceppi di query mutanti45 . In conclusione, questo approccio può essere chiaramente generalizzato a un'ampia varietà di domande sperimentali in diversi organismi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di ricerca del Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India (Grant No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) a Nimisha Sharma. Gli autori ringraziano il Prof. Charles Hoffman (Boston College, USA) per il dono della libreria di cDNA di S. pombe e la Prof.ssa Susan Forsburg per i plasmidi di lievito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-NQO Sigma N8141
Acetic Acid, glacial Sigma 1371301000
Adenine Sulphate Himedia GRM033
Agar Himedia GRM026
Agarose Lonza 50004L
Ammonium Chloride Himedia MB054
BamHI Fermentas ER0051
Biotin Himedia RM095
Boric Acid Himedia MB007
Calcium Chloride  Sigma C4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma C0549
Citric Acid Himedia RM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrous Himedia GRM3960
single stranded DNA from Salmon testes Sigma D7656
EDTA disodium Sigma 324503
Ferric Chloride Hexahydrate Himedia RM6353
Glucose Amresco 188
Ionositol Himedia GRM102
Isopropanol Qualigen Q26897
Leucine Himedia GRM054
Lithium Acetatae Sigma 517992
Magnesium Chloride Hexahydrate Himedia MB040
Molybdic Acid Himedia RM690
Nicotinic Acid Himedia CMS177
PEG, MW 4000 Sigma 81240
Pentothinic Acid Himedia TC159
Phenol Himedia MB082
Plasmid Extraction Kit Qiagen 27104
Potassium Chloride Sigma P9541
Potassium hydrogen Pthallate Merc DDD7D670815
Potassium iodide Himedia RM1086
RNAse Fermentas EN0531
SDS Himedia GRM205
Sodium Hydroxide Himedia GRM1183
Sodium Sulphate Himedia RM1037
Tris free Base Himedia MB209
Uracil Himedia GRM264
Yeast Extract Powder Himedia RM668
Zinc Sulphate Heptahydrate Merc DJ9D692580

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
  2. Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
  3. Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712 (2015).
  4. Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).
  6. Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).
  7. Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
  8. Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
  9. Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840 (2018).
  10. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  11. Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
  12. Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
  13. Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  14. Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
  15. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  16. Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
  17. Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
  18. Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
  19. Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
  20. Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
  21. Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
  22. Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
  23. Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
  24. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  25. Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
  26. Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).
  27. Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969 (2016).
  28. Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. Fission yeast: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932 (2006).
  30. Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090 (2006).
  32. Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
  33. Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601 (2021).
  34. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).
  35. Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
  36. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  37. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  38. Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
  39. Melnykov, A. V., Elson, E. L. MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444 (2019).
  40. Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
  41. Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
  42. Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
  43. Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
  44. Kim, D. -U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
  45. Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).

Tags

Biologia Numero 187 Screening genetico Soppressori multicopia Schizosaccharomyces pombe Ell1 Regolazione genica Allungamento della trascrizione
Screening genetico per l'identificazione di soppressori multicopia in <em>Schizosaccharomyces pombe</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D.,… More

Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D., Sharma, N. Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe. J. Vis. Exp. (187), e63967, doi:10.3791/63967 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter