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Biology

Triagem Genética para Identificação de Supressores Multicópia em Schizosaccharomyces pombe

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/63967
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1University School of Biotechnology, G.G.S. Indraprastha University
* These authors contributed equally

Summary

Este trabalho descreve um protocolo para uma triagem genética supressora de múltiplas cópias em Schizosaccharomyces pombe. Esta tela usa uma biblioteca de plasmídeos em todo o genoma para identificar clones supressores de um fenótipo de perda de função associado a uma cepa mutante de consulta. Novos supressores genéticos do mutante nulo ell1 foram identificados usando esta tela.

Abstract

A identificação de interações genéticas é uma ferramenta poderosa para decifrar as funções do(s) gene(s), fornecendo insights sobre suas relações funcionais com outros genes e organização em vias e processos biológicos. Embora a maioria das telas genéticas tenha sido inicialmente desenvolvida em Saccharomyces cerevisiae, uma plataforma complementar para a realização dessas telas genéticas foi fornecida pela Schizosaccharomyces pombe. Uma das abordagens comuns usadas para identificar interações genéticas é a superexpressão de clones de uma biblioteca de plasmídeos de alto número de cópias em todo o genoma em um mutante de perda de função, seguida pela seleção de clones que suprimem o fenótipo mutante.

Este artigo descreve um protocolo para a realização desta triagem genética baseada em "supressão multicópia" em S. pombe. Esta triagem ajudou a identificar o(s) supressor(es) de múltiplas cópias do fenótipo genotóxico sensível ao estresse associado à ausência do fator de alongamento de transcrição Ell1 em S. pombe. A triagem foi iniciada pela transformação da cepa mutante nula ell1 com uma biblioteca plasmídica de cDNA de alto número de cópias e seleção dos supressores em placas EMM2 contendo 4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO), um composto genotóxico indutor de estresse. Posteriormente, o plasmídeo foi isolado de duas colônias supressoras pré-selecionadas e digerido por enzimas de restrição para liberar o DNA inserido. Os plasmídeos que liberam um fragmento de DNA de inserção foram retransformados na cepa de deleção ell1 para confirmar a capacidade desses clones plasmídeos supressores de restaurar o crescimento do mutante de deleção ell1 na presença de 4-NQO e outros compostos genotóxicos. Os plasmídeos que apresentaram resgate do fenótipo de deleção foram sequenciados para identificar o(s) gene(s) responsável(is) pela supressão do fenótipo sensível ao estresse genotóxico associado à deleção ell1.

Introduction

Redes de interações genéticas fornecem informações funcionais sobre genes e delineiam caminhos e processos biológicos em que esses genes podem estar envolvidos in vivo. Além disso, eles também podem fornecer insights sobre como diferentes genes interagem uns com os outros, resultando em um fenótipo específico 1,2,3. Ao longo dos anos, uma variedade de telas genéticas foram projetadas por pesquisadores para responder a questões biológicas fundamentais e estudar doenças humanas. Telas para a identificação de interações genéticas podem ser realizadas de várias maneiras. Interações genéticas identificadas em diferentes telas genéticas podem representar relações mecanicistas distintas entre genes. Além disso, estudos têm revelado que um conjunto comum de interações genéticas é compartilhado por genes que codificam proteínas pertencentes à mesma via ou complexo 4,5. Assim, redes de interação genética podem ser usadas para estabelecer a organização funcional em uma célula, em que genes que compartilham os perfis mais semelhantes pertencem ao mesmo complexo ou via, esses genes que compartilham perfis um pouco menos semelhantes pertencem ao mesmo processo biológico e os genes que exibem perfis sobrepostos, mas mais diversos, refletem membros pertencentes ao mesmo compartimento celular6.

As telas de interação genética baseadas na supressão da dosagem ('supressão de cópia alta ou multicópia') são uma das abordagens comumente usadas. Essas telas podem ser realizadas por meio da transformação de uma cepa mutante de consulta com uma biblioteca genômica ou cDNA de alto número de cópias, seguida de ensaios/técnicas de seleção adequadas para identificar a supressão ou o aumento das interações genéticas 7,8,9. Para garantir uma cobertura abrangente de todo o genoma, essas telas também foram realizadas superexpressando um gene específico de interesse em uma coleção de mutantes de perda de função em todo o genoma ou superexpressando uma biblioteca genômica ou cDNA codificada por plasmídeo de alto número de cópias em um mutante de consulta de perda de função 9,10,11,12,13,14,15 . A estratégia de multicópia também poderia funcionar usando uma abordagem dominante/superexpressão usando um promotor regulável.

As principais vantagens do uso de telas baseadas em supressores são que a supressão de um fenótipo preexistente em uma cepa mutante por outro gene estabelece uma relação genética entre esses dois produtos genéticos que pode não ter sido demonstrada usando outras abordagens. Em segundo lugar, observou-se que a presença de uma mutação preexistente sensibiliza uma via particular, permitindo que componentes adicionais dessa via sejam identificados pelo isolamento de supressores, que podem não ter sido identificados por seleções genéticas mais diretas. Além disso, essa tela pode ser utilizada para identificar supressores que possuem diferentes mecanismos de supressão16. As interações supressoras geralmente ocorrem entre genes que estão funcionalmente relacionados e podem ser usados para elucidar hierarquias em vias. O mecanismo exato subjacente de supressão pode diferir com base em vários fatores, incluindo o tipo de mutação de consulta usada na tela, condições experimentais e o nível de expressão gênica. Um dos mecanismos comuns de supressão de dosagem envolve genes que codificam produtos que funcionam juntos no mesmo complexo ou em paralelo no mesmo processo celular / biológico. Os resultados de tais telas em organismos modelo mais simples, como a levedura, podem ser estendidos a organismos eucarióticos superiores, uma vez que a maioria das vias e processos biológicos fundamentais são conservados ao longo da evolução.

Essas telas genéticas também podem ser modificadas de várias maneiras para responder a diferentes questões biológicas. Por exemplo, genes ortólogos de diferentes organismos que podem suprimir o fenótipo da cepa mutante de consulta podem ser identificados. Também tem sido usado para delinear potenciais mecanismos de resistência e determinar alvos proteicos de novos compostos antibacterianos 17,18, antifúngicos 19,20, antiparasitários 21 e anticancerígenos22. Esta tela também tem sido explorada para identificar supressores da atividade de drogas farmacêuticas cujo mecanismo de ação não é conhecido. Assim, em princípio, essas telas supressoras de multicópia podem ser otimizadas e usadas em uma variedade de aplicações em diferentes organismos. Embora a maioria das telas genéticas empregadas por pesquisadores de leveduras tenha sido inicialmente desenvolvida em S. cerevisiae, S. pombe emergiu como um sistema modelo complementar para a realização de várias telas e ensaios genéticos23. Além disso, a organização genômica e os processos biológicos em S. pombe, como a ocorrência de íntrons em mais genes, a complexidade das origens da replicação do DNA, a estrutura dos centrômeros, a organização do ciclo celular e a presença da maquinaria de RNAi, mostram maior semelhança entre S. pombe e eucariotas superiores23,24, ressaltando a importância do desenho e uso de ferramentas genéticas em S. pombe.

Este artigo descreve um protocolo para identificar interatores genéticos com base na "supressão da dosagem" de um fenótipo mutante de perda de função em S. pombe. A base deste protocolo é que é um método rápido e eficiente para rastrear uma biblioteca de cDNA superexpressando genes do tipo selvagem em um plasmídeo multicópia e / ou de um promotor forte. Este protocolo tem quatro etapas principais: transformação da biblioteca em uma cepa mutante de consulta, seleção de clones plasmídicos que suprimem o fenótipo desejado da cepa mutante de consulta, recuperação do(s) plasmídeo(s) desses clones supressores e identificação do gene responsável pela supressão do fenótipo. Como é verdade para qualquer método baseado na seleção e identificação de cDNAs de uma biblioteca, o sucesso da tela depende do uso de uma biblioteca de alta qualidade e alta complexidade, pois a tela pode recuperar apenas os clones de cDNA que estão presentes na biblioteca.

Usando este protocolo, identificamos com sucesso dois novos supressores do fenótipo genotóxico sensível ao estresse do mutante nulo S. pombe ell1. A família ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) de fatores de alongamento de transcrição suprime a pausa transitória da RNA polimerase II em moldes de DNA em ensaios bioquímicos in vitro e são conservados em vários organismos, desde leveduras de fissão até humanos25. Trabalhos anteriores forneceram evidências de que um mutante nulo de S. pombe ell1 mostra sensibilidade ao estresse genotóxico na presença de óxido de 4-nitroquinolina 1 (4-NQO) e metanossulfonato de metila (MMS)26. Portanto, transformamos uma biblioteca de cDNA multicópia codificada por plasmídeo de S. pombe na consulta S. pombe ell1 mutante nulo e identificamos dois supostos clones que exibiam a capacidade de suprimir a sensibilidade ao estresse genotóxico do mutante nulo de S. pombe ell1 na presença de 4-NQO, um composto que induz lesões de DNA. O sequenciamento subsequente da inserção presente nos clones plasmídicos identificou que os genes que codificam rax2+ e osh6+ foram responsáveis por suprimir a sensibilidade ao estresse genotóxico do mutante nulo ell1 quando superexpresso no mutante nulo ell1.

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Protocol

1. Transformação da biblioteca cDNA na cepa mutante de consulta S. pombe para triagem de supressores de multicópia

NOTA: O método padrão de acetato de lítio27 foi seguido para transformar a biblioteca de cDNA de S. pombe na cepa de consulta S. pombe ell1Δ com algumas modificações:

  1. Cultivar a cepa de S. pombe ell1Δ a 32 °C em uma placa de meio YE (Tabela 1) suplementada com 225 μg/mL de adenina, leucina e uracilo cada. Inocular uma alça cheia de inóculo da cepa ell1Δ da placa acima em 15-20 mL de meio YE suplementado com 225 μg/mL cada de adenina, leucina e uracila. Incubá-lo durante a noite a 32 °C com agitação (200-250 rpm).
  2. No dia seguinte, diluir a cultura noturna em 100 mL de meio YE fresco com os suplementos desejados a uma OD de 600 nm (densidade óptica a600 nm) de 0,3 e incubá-la a 32 °C com agitação a 200-250 rpm até que a OD600 nm atinja a fase intermediária.
  3. Divida a cultura de 100 mL em dois tubos de centrífuga de 50 mL, seguidos de centrifugação à temperatura ambiente por 10 min a 4.000 × g.
  4. Descarte o sobrenadante e lave o pellet celular com 1 mL de água estéril, ou seja, ressuspenda as células em 1 mL de água estéril e centrifugar a 4.000 × g por 5 min à temperatura ambiente.
  5. Rejeitar o sobrenadante e lavar cada pellet celular com 1 ml de solução de 1x LiAc-TE (acetato de lítio 100 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5), conforme descrito no passo 1.4.
  6. Remova o sobrenadante e ressuspenda cada pellet celular em 250 μL de 1x LiAc-TE. Use estas células competentes de S. pombe (500 μL) para transformação com o DNA de interesse. Transferir 125 μL das células competentes para quatro tubos de microcentrífuga estéreis diferentes para as etapas de transformação subsequentes.
  7. Ferva o DNA transportador de testículos de salmão ou esperma de arenque por 1 min e coloque imediatamente no gelo. Para cada transformação, adicionar 10 μL de 10 mg/mL de DNA transportador desnaturado de fita simples ao tubo de microcentrífuga contendo 125 μL das células competentes, seguido de uma mistura suave usando uma ponta de micropipeta. Subsequentemente, adicionar 50 μg da biblioteca de cDNA de S. pombe ao tubo de microcentrífuga contendo mistura de DNA portador de células competente.
  8. Incubar os tubos de microcentrífuga à temperatura ambiente durante 10 min e, em seguida, adicionar 260 μL de solução de acetato de polietilenoglicol-lítio (40% [p/v] PEG 4.000, acetato de lítio 100 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) aos tubos e misturar suavemente com a ajuda de uma ponta de micropipeta.
  9. Incubar os tubos de microcentrífuga que contêm a mistura de transformação a 32 °C durante 2 h sem agitar. Adicione 43 μL de sulfóxido de dimetilo pré-aquecido (DMSO) ao tubo de microcentrífuga e misture suavemente. Subsequentemente, expor os tubos a choques térmicos a 42 °C durante 5 min.
  10. Pellet as células a 4.000 × g durante 5 min à temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e remover a solução residual de PEG-LiAc-TE com a ajuda de uma ponta de micropipeta.
  11. Ressuspender as células em 100 μL de água estéril e placa em uma placa EMM2 (Tabela 1) (150 mm) com os suplementos necessários e 0,2 μg/mL de 4-NQO.
  12. Incubar as placas a 32 °C durante 5-6 dias para permitir que as colónias apareçam nas placas. Estrie as colônias obtidas na mesma placa média na presença de 0,2 μg/mL de 4-NQO e use para triagem adicional.
  13. Para um experimento de transformação de biblioteca, use 500 μL de células competentes (125 μL de células competentes x 4 tubos de microcentrífuga) para transformação, conforme descrito nas etapas 1.8 a 1.14 acima.
  14. Como controle, placa 1/10 da mistura de transformação em uma placa EMM2 (150 mm) com suplementos necessários, mas sem 4-NQO, para calcular o número total de clones de biblioteca obtidos após a transformaçãoda biblioteca e triagem para isolamento dos clones supressores.

2. Testar e validar o resgate/supressão do fenótipo associado à cepa mutante de consulta pelo supressor putativo

NOTA: Ensaios de ponto de estresse foram realizados conforme descrito abaixo para testar e validar o resgate/supressão da sensibilidade ao estresse 4-NQO associada à deleção ell1 pelo(s) supressor(es) putativo(s).

  1. Adicione 100-200 μL de água estéril em cada um dos diferentes poços de uma placa de microtitulação estéril de 96 poços.
  2. Pegue uma pequena quantidade de inóculo de cada uma das diferentes colônias obtidas após a transformação da biblioteca de cDNA na placa contendo 4-NQO usando um palito de dente estéril ou uma ponta de micropipeta de 20-200 μL. Adicionar o inóculo de cada uma das diferentes colónias em poços independentes separados da placa de microtitulação contendo 100-200 μL de água estéril. Homogeneizar.
  3. Spot 3 μL da suspensão celular de cada poço em placas de ágar EMM2 contendo adenina (225 μg/mL) e uracilo (225 μg/mL), mas sem leucina (o marcador auxotrófico selecionável presente no vetor plasmidial utilizado para a construção da biblioteca utilizada neste trabalho). Adicione concentrações apropriadas de 4-NQO às placas, conforme necessário.
  4. Incubar as placas a 32 °C durante 3-4 dias para permitir que as células cresçam. Identifique as colônias que mostram crescimento na presença de diferentes concentrações de 4-NQO como supressores putativos.
  5. Para validar ainda mais os supressores, cultive os supressores selecionados juntamente com cepas de controle apropriadas durante a noite a 32 °C com agitação (200-250 rpm) em meio EMM2 contendo 225 μg/mL cada de adenina e uracilo mas sem leucina.
  6. No dia seguinte, diluir as células para uma OD de 600 nm de 0,3 em meio EMM2 fresco e cultivá-las a 32 °C com agitação até a fase intermediária (aproximadamente OD600 nm de 0,6-0,8).
  7. Detectar diluições seriadas apropriadas (1:10 ou 1:5) de culturas em placas EMM2 com suplementos necessários contendo 0,4 μM 4-NQO ou 0,01% MMS. Para controle, identifique as cepas em uma placa EMM2 com os suplementos necessários, mas sem qualquer agente prejudicial ao DNA.
  8. Incubar as placas a 32 °C durante 3-5 dias para monitorizar o crescimento.
    NOTA: Ensaios adequados com base no fenótipo associado à cepa mutante de consulta devem ser usados para testar o resgate ou supressão do fenótipo. Por exemplo, se os supressores de um fenótipo sensível ao frio de uma cepa mutante de consulta precisarem ser identificados, o ensaio para teste e validação dos clones supressores envolveria o crescimento de transformadores a baixa temperatura.
  9. Observe as cepas mutantes transformadas com o gene de interesse de comprimento total (Spell1 neste caso) ou vetor vazio como controles positivos e negativos, respectivamente, juntamente com os transformadores da biblioteca.

3. Isolamento do plasmídeo dos clones supressores de S. pombe

NOTA: O isolamento plasmídico de S. pombe foi realizado seguindo o protocolo descrito em Fissão levedura: um manual de laboratório28 com algumas modificações.

  1. Inocular uma única colónia de levedura em meio EMM2 contendo 225 μg/ml de adenina e uracilo e cultivar as células durante a noite a 32 °C com agitação a 200-250 rpm. No dia seguinte, colha 5 células O.D. (ou seja, 10 mL de cultura de O.D. 0,5) por centrifugação por 2 min a 4.000 × g à temperatura ambiente.
  2. Remova o sobrenadante e ressuspenda a pastilha celular em 0,2 mL de tampão de lise (Triton X-100 a 2%, SDS a 1%, NaCl 100 mM, Tris HCl 10 mM (pH 8,0) e EDTA 1 mM Na2).
  3. Adicionar 0,2 ml de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e 0,3 g de grânulos de vidro lavados com ácido ao tubo de microcentrífuga. Vórtice do tubo de microcentrífuga durante 2 min a 4 °C e incubar no gelo durante 1 min. Repita esta etapa 6x.
  4. Centrifugar o tubo a 10.000 × g durante 15 min à temperatura ambiente. Transferir a camada aquosa superior para um tubo de microcentrífuga fresco e adicionar 200 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1).
  5. Centrifugar o tubo a 10.000 × g durante 10 min. Transfira a camada aquosa superior para um tubo fresco e adicione dois volumes de etanol a 100% (~400 μL) e 1/10 volume de acetato de sódio (3 M, pH 5,8) (~20 μL) ao tubo. Incubar o tubo de microcentrífuga -70 °C durante 1 h.
  6. Precipitar o ADN por centrifugação a 10 000 × g durante 15 minutos a 4 °C e remover o sobrenadante. Lave o pellet de DNA com etanol a 70% (~500 μL) e mantenha-o à temperatura ambiente para secar ao ar.
  7. Ressuspender o DNA em 20 μL de água estéril. Use 2-5 μL de DNA plasmídico para a transformação de células competentes de E. coli.
    NOTA: O plasmídeo também pode ser isolado de células de levedura usando qualquer um dos kits de isolamento de plasmídeos de levedura comercialmente disponíveis.

4. Identificação do gene codificado pelo clone supressor

  1. Transformar os plasmídeos de levedura isolados em cepas E. coli Top10 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] usando o protocolo padrão29 e espalhar as células em placas LB (Caldo de Luria) com antibióticos necessários.
  2. Isolar o(s) plasmídeo(s) dos transformadores de E. coli utilizando o protocolo padrão de lise alcalina29 e seguir as combinações apropriadas de enzimas de restrição para verificar a liberação do fragmento de DNA da inserção por digestão de restrição.
    NOTA: O plasmídeo supressor 84 foi digerido com a enzima de restrição Bam HI e o plasmídeo supressor 104 foi digerido com as enzimas de restrição PstI/BamHI.
  3. Retransforme os plasmídeos mostrando liberação de inserção após digestão de restrição na cepa ell1 Δ para verificar sua capacidade de resgatar o fenótipo genotóxico sensível ao estresse da cepa ell1Δ.
  4. Selecione os clones plasmídicos que apresentam supressão da sensibilidade ao estresse genotóxico e sequencie o fragmento de DNA de inserção presente nesses clones plasmídicos usando primers para frente e para trás específicos do vetor.
    NOTA: Neste estudo, foi utilizado o primer universal forward específico do promotor adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30.
  5. Para identificar o gene responsável pela supressão, alinhe a sequência obtida usando o blasto de nucleotídeos NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) ou a ferramenta de alinhamento de sequência Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Selecione a sequência que mostra o alinhamento máximo e identifique-a como o gene para o plasmídeo supressor de multicópia.

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Representative Results

Triagem para sugador(es) de múltiplas cópias de sensibilidade ao estresse genotóxico associado à deleção ell1 em S. pombe
Realizamos a triagem genética utilizando o protocolo descrito acima para identificar supressores multicópia do fenótipo de perda de função da cepa mutante de deleção de consulta ell1. A sensibilidade relacionada ao crescimento da cepa de deleção ell1 observada na presença do agente genotóxico 4-NQO foi adotada como fenótipo de perda de função para seleção de supressores de multicópia. A Figura 1 mostra uma representação esquemática da tela genética. Para iniciar a triagem, a sensibilidade ao estresse genotóxico do mutante de deleção ell1 (h-ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1Δ :: kanMX6) foi confirmada pela primeira vez em relação à sua cepa isogênica do tipo selvagem (h-ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1) na presença de 4-NQO (Figura 2A). Posteriormente, o mutante nulo de consulta S. pombe ell1 foi transformado com uma biblioteca de cDNA de S. pombe de alto número de cópias para selecionar os clones plasmídicos que poderiam suprimir/resgatar a sensibilidade relacionada ao crescimento 4-NQO do mutante nulo ell1. Esta biblioteca contém ~6 × 105 fragmentos de cDNA de S. pombe clonados no vetor de superexpressão pLEV3 S. pombe sob o controle do promotor adh1 30. Como controle, 1/10 da mistura de transformação também foi banhado em placas EMM2 sem 4-NQO para calcular o número total de clones recombinantes obtidos após a transformação da biblioteca, uma indicação da coberturada biblioteca, e rastreado para isolamento dos clones supressores. Isso é fundamental, pois a triagem de menos clones reduzirá a possibilidade de identificar os clones supressores. 

A Figura 2B mostra imagens representativas das placas de controle e de 4 NQO. Como mostrado na figura, um grande número de colônias é obtido na placa de controle sem 4-NQO mostrando uma boa cobertura da biblioteca. Como esperado, menos transformadores foram obtidos na placa 4-NQO, pois esses transformadores provavelmente representam os supressores putativos da sensibilidade 4-NQO do mutante nulo ell1 . Em seguida, as diferentes colônias transformadoras obtidas em placas EMM2 contendo 0,2 μM 4-NQO foram ainda mais estriadas ou manchadas em placas EMM2 contendo 0,2 μM 4-NQO para confirmar a capacidade desses transformadores de crescer na presença de 4-NQO. Observou-se que 620 colônias transformadoras foram capazes de crescer em placas EMM2 contendo 4-NQO de 0,2 μM.

Validação da capacidade dos supostos clones supressores de restaurar o crescimento do mutante de deleção ell1 sob condições de estresse genotóxico
Para confirmar os supressores putativos, é importante testar o resgate do fenótipo desejado em condições de maior rigor, como mostra a representação esquemática (Figura 3A). Portanto, os 620 transformadores pré-selecionados foram detectados em placas EMM2 com 0,4 μM 4-NQO. Como pode ser observado na Figura 3B, apenas 74 transformadores apresentaram crescimento a 0,4 μM 4-NQO. Posteriormente, esses 74 transformadores foram detectados em placas EMM2 contendo 0,8 μM 4-NQO, e observou-se que apenas 16 apresentaram crescimento na presença de 0,8 μM 4-NQO (Figura 3C). Para confirmar ainda mais essas observações, esses 16 transformadores foram vistos em placas EMM2 com suplementos necessários, contendo 0,8 μM 4-NQO ou nenhum 4-NQO (controle), juntamente com o mutante de deleção ell1 transformado com vetor vazio. Os resultados desses ensaios de spotting revelaram que, como esperado, a cepa de deleção ell1 transformada com vetor vazio, bem como todos os 16 transformadores, apresentaram crescimento na placa sem 4-NQO. Em comparação, enquanto o mutante de deleção ell1 contendo apenas o vetor vazio não apresentou crescimento a 0,8 μM 4-NQO, seis transformadores apresentaram crescimento a 0,8 μM 4-NQO (Figura 3D), sugerindo que o(s) clone(s) de biblioteca presente(s) neles tinham a capacidade de suprimir o fenótipo de estresse genotóxico do mutante nulo ell1.

Identificação do gene codificado pelo clone supressor
Em seguida, selecionamos 02 supressores genéticos da cepa de deleção ell1, sup 84 e sup 104, mostrando supressão completa da sensibilidade ao crescimento associada a ell1 na presença de 4-NQO. O(s) clone(s) plasmídeo(s) da biblioteca foi isolado desses dois supressores de levedura e transformado em células competentes de E. coli. Posteriormente, o plasmídeo foi isolado de células de E. coli utilizando protocolos padrão31. Os dois plasmídeos isolados, marcados como 84 e 104, foram submetidos à digestão de restrição, que revelou a presença de aproximadamente 1.000 pb e 800 pb inserir fragmentos de DNA, respectivamente (Figura 4A,B). Para validar ainda mais os resultados dessa tela supressora, esses plasmídeos foram retransformados no mutante de deleção ell1 e verificados se poderiam restaurar o crescimento do mutante nulo ell1 na presença de 4-NQO. Os ensaios de ponto de estresse revelaram que os clones plasmídeos supressores resultaram na supressão da sensibilidade ao crescimento associada ao 4-NQO quando reintroduzidos no mutante nulo ell1, sugerindo que a supressão era dependente do plasmídeo (Figura 4C). Além disso, decidimos determinar se esses clones supressores também poderiam suprimir a sensibilidade relacionada ao crescimento da cepa de deleção ell1 na presença de outro composto indutor de danos ao DNA, o MMS. Os ensaios pontuais demonstraram que a transformação dos clones plasmídeos supressores no mutante nulo ell1 resultou em mais crescimento em meio contendo MMS do que a transformação do mutante de deleção ell1 com vetor vazio, indicando que esses clones plasmídicos poderiam suprimir a sensibilidade ao estresse genotóxico do mutante de deleção ell1 na presença de ambos os agentes genotóxicos, ou seja, 4-NQO e MMS (Figura 4D).

Em seguida, para identificar o gene presente nesses clones plasmídeos supressores, o sequenciamento do fragmento de DNA inserido foi realizado utilizando o primer universal forward específico do promotor adh1 30. A sequência de nucleotídeos obtida foi pesquisada por meio da ferramenta 'BLAST at Ensembl' disponível no site PomBase (https://www.pombase.org), que revelou que os dois clones plasmídicos 84 e 104 continham genes rax2+ e osh6+, respectivamente, fornecendo evidências de que Rax2 e Osh6 foram responsáveis por suprimir o fenótipo genotóxico sensível ao estresse associado à ausência de ell1+ em S. pombe . O conhecimento sobre as funções de ambas as proteínas em S. pombe é limitado. Rax2 demonstrou regular a localização de For3p para controlar a polaridade celular durante o crescimento vegetativo em S. pombe32. Osh6 é uma proteína de transporte lipídico que pertence à família de proteínas relacionadas à proteína de ligação ao oxisterol. Está envolvida no transporte da fosfatidilserina do retículo endoplasmático para a membrana plasmática33.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática da tela supressora de multicópia genética. Este protocolo tem quatro etapas principais: transformação da biblioteca em uma cepa mutante de consulta, seleção de clones plasmídicos que suprimem o fenótipo desejado da cepa mutante de consulta, recuperação do(s) plasmídeo(s) desses clones supressores e identificação do gene responsável pela supressão do fenótipo. Abreviação: 4-NQO = 4-nitroquinolina 1-óxido. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Triagem para sugador(es) multicópia da sensibilidade ao estresse genotóxico associado à deleção ell1 em S. pombe. (A) Ensaio de ponto de tensão mostrando sensibilidade de 4-NQO da cepa de S. pombe excluída de ell1 em comparação com sua cepa isogênica do tipo selvagem. Diluições seriadas (1:10) de cepas apropriadas foram detectadas em meio EMM2 contendo 225 μg/mL cada de adenina, leucina e uracilo com ou sem (controle) 0,4 μM 4-NQO. As placas foram então incubadas por 3-5 dias a 32 °C. (B) Uma biblioteca de cDNA de alto número de cópias foi transformada em cepa de S. pombe excluída de ell1, e colônias transformadas foram banhadas em meio EMM2 sem leucina, mas contendo 0,2 μM 4-NQO. Uma pequena alíquota da mistura de transformação também foi banhada em placas EMM2 sem 4-NQO, como controle. As placas foram incubadas a 32 °C por 5-6 dias e fotografadas. O painel B mostra uma imagem representativa dessas placas. Abreviação: 4-NQO = 4-nitroquinolina 1-óxido. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Validação da capacidade de clones supressores putativos de suprimir a sensibilidade ao estresse genotóxico do mutante de deleção ell1 . (A) Uma representação esquemática da triagem dos transformadores da biblioteca testando a supressão do fenótipo desejado. O crescimento de 620 transformadores foi testado em concentrações crescentes de 4-NQO detectando diferentes transformadores em placas EMM2 sem leucina e contendo (B) 0,4 μM 4-NQO ou (C) 0,8 μM 4-NQO. As placas foram incubadas a 32 °C por 5-6 dias e fotografadas. Imagens representativas de placas foram mostradas. (D) Dezesseis transformadores que estavam mostrando crescimento em 0,8 μM 4-NQO foram detectados em placas EMM2 sem leucina, mas contendo 0,8 μM 4-NQO ou não contendo 4-NQO (controle), juntamente com a cepa de deleção ell1 transformada com vetor vazio. As placas foram incubadas a 32 °C por 5-6 dias e fotografadas. Apenas seis colônias exibiram a capacidade de resgatar a sensibilidade ao estresse genotóxico associado à deleção de ell1 . Abreviação: 4-NQO = 4-nitroquinolina 1-óxido. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Identificação dos clones plasmídeos supressores. Imagens em gel de agarose de (A) digestão de restrição do plasmídeo supressor 84 com a enzima de restrição BamHI liberaram uma inserção de ~1 kb. (B) O plasmídeo supressor 104 digerido com enzimas de restrição PstI/BamHI liberou uma inserção de ~800 pb. (C) 1:10 diluído em série ell1 mutante nulo transformado com plasmídeos, sup 84 ou sup 104, foram manchados em placas EMM2 sem leucina e contendo 0,4 μM 4-NQO ou (D) 0,01% MMS. Nas placas de controle, nenhum agente prejudicial ao DNA foi adicionado. As placas foram incubadas a 32 °C por 4-5 dias e fotografadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composição do meio para o crescimento de S. pombe. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

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Discussion

As leveduras têm sido amplamente utilizadas para investigar os processos biológicos básicos e as vias que são conservadas evolutivamente em organismos eucarióticos. A disponibilidade de ferramentas genéticas e genômicas, juntamente com sua amenidade a vários procedimentos bioquímicos, genéticos e moleculares, tornam as leveduras um excelente organismo modelo para a pesquisa genética34,35,36. Ao longo dos anos, várias telas genéticas foram projetadas por pesquisadores de leveduras para identificar interações genéticas que lançassem luz sobre as funções de gene(s) individual(is), bem como as vias e processos biológicos em que eles podem estar envolvidos10,11,17,37. Uma das telas comuns e úteis para identificar interações genéticas é conhecida como "multicópia ou supressão de alto número de cópias".

Esta tela requer uma cepa mutante de consulta exibindo um fenótipo de perda de função, seguida pela transformação dessa cepa de consulta mutante com uma biblioteca genômica ou cDNA de alto número de cópia. Posteriormente, os transformadores obtidos são rastreados para identificar esses genes, que quando superexpressos, suprimem o fenótipo associado à(s) cepa(s) mutante(s) de consulta. Esse tipo de interação genética entre a cepa mutante específica e o(s) gene(s) presente(s) nos clones da biblioteca de plasmídeos resulta no isolamento e identificação de produtos genéticos que provavelmente atuarão na mesma via ou afetarão o mesmo processo biológico4. Assim, esta tela fornece insights sobre as funções do(s) gene(s) de interesse e sua organização funcional em caminhos e processos biológicos in vivo. Tradicionalmente, esta tela tem sido amplamente utilizada em S. cerevisiae 38,39,40,41,42.

O objetivo do presente trabalho é descrever um protocolo simples e direto para a realização de uma triagem genética de supressão multicópia em S. pombe. Realizamos a tela utilizando uma cepa de S. pombe com exclusão do fator de alongamento de transcrição ell1. ELL é uma família de fatores de alongamento de transcrição, que estão presentes em uma ampla gama de organismos, desde leveduras de fissão até humanos. As funções de Ell1 estão apenas começando a ser compreendidas em S. pombe. Trabalhos anteriores destacaram o papel do Ell1 no crescimento ótimo durante condições normais de crescimento e na sobrevida durante condições de estresse genotóxico26. Empregamos a triagem supressora de múltiplas cópias como uma das abordagens para descobrir o mecanismo molecular subjacente ao papel da Ell1 na sensibilidade ao estresse genotóxico em S. pombe26. Uma biblioteca de cDNA de S. pombe codificada por plasmídeo multicópia foi transformada no mutante nulo S. pombe ell1 que exibe sensibilidade ao 4-NQO. Posteriormente, foram selecionados os transformadores que poderiam crescer na presença do 4-NQO.

O isolamento de plasmídeos desses transformadores e o sequenciamento de inserções presentes nesses plasmídeos levaram à identificação de dois novos interatores genéticos de ell1+ em S. pombe, rax2+ e osh6+. Um estudo anterior utilizando uma triagem genética semelhante em S. pombe também identificou a proteína anti-silenciadora, epe1+, como um supressor de multicópia dos fenótipos associados à deleção ell1 43. Também utilizamos este método na identificação dos supressores de múltiplas cópias da subunidade não essencial Rpb9 da RNA polimerase II de S. pombe (observações não publicadas). Coletivamente, esses resultados validam a utilidade da abordagem de triagem supressora de multicópia genética como um método para identificar supostos genes/proteínas que exibem interação genética com um gene desejado de interesse, elucidando a função, as vias e os processos nos quais o gene de interesse pode estar envolvido.

Para usar a tela descrita neste trabalho, é importante primeiro ter uma cepa mutante de consulta que exiba um fenótipo claro associado à mutação, que pode ser usado para isolar o(s) supressor(es) de multicópia. Além disso, o sucesso desta tela dependerá da disponibilidade de uma biblioteca representativa de alta qualidade e boa contendo clones que representam o número máximo de genes do tipo selvagem ou seus cDNAs correspondentes. Tradicionalmente, as bibliotecas genômicas e de cDNA têm sido usadas nessas telas, mas as bibliotecas de cDNA têm a vantagem de serem feitas de mRNAs expressos na célula/organismo. Além disso, uma alta eficiência de sua transformação em células de levedura é imprescindível para o sucesso da tela, pois é importante rastrear um grande número de transformadores, aumentando a probabilidade de identificação de supressores. Se menos transformadores forem obtidos na placa de controle após a transformação da biblioteca na cepa mutante de consulta usando o protocolo de acetato de lítio, a eletroporação pode ser usada para transformar a biblioteca.

Também é aconselhável primeiro padronizar o protocolo de transformação com outro plasmídeo antes de transformar a biblioteca. Caso contrário, isso resultará desnecessariamente na perda da biblioteca. O protocolo descrito aqui usa a sensibilidade 4-NQO como fenótipo mutante, mas métodos/ensaios de triagem adequados devem ser projetados para seleção de supressores com base no fenótipo mutante específico de interesse. Se nenhum ou muito poucos transformadores forem obtidos na placa para selecionar supressores após a transformação da biblioteca na cepa mutante de consulta, então, se possível, condições/ensaios menos rigorosos devem ser usados ao chapear a biblioteca para selecionar supressores de modo a detectar o maior número possível de supressores genéticos antes de confirmá-los sob condições de alta rigor. Além de usar a digestão de restrição para testar a presença da inserção nos clones plasmídeos supressores identificados, a PCR usando primers específicos do vetor pode ser usada para amplificar o fragmento de DNA de inserção desejado. Alternativamente, os clones plasmídeos supressores podem ser administrados diretamente para sequenciamento, evitando a necessidade de digestão de restrição ou PCR.

Esta tela também pode ser adotada para leveduras que não sejam S. cerevisiae e S . pombe se um kit de ferramentas genéticas com relação a cepas mutantes apropriadas, plasmídeos e construções promotoras estiver disponível que facilite a superexpressão de genes, permitindo o resgate do fenótipo mutante presente na célula de levedura hospedeira. Além disso, com a disponibilidade de recursos genômicos amplos, incluindo a coleta de mutantes de deleção em todo o genoma44 e bibliotecas de superexpressão37, essa triagem também pode ser realizada pela transformação de um ou alguns plasmídeos de consulta em uma matriz sistemática de coleção de cepas mutantes de levedura ou pela transformação de uma matriz sistemática de coleção de plasmídeos de superexpressão em uma ou algumas cepas de consulta mutantes45 . Em conclusão, esta abordagem pode ser claramente generalizada para uma ampla variedade de questões experimentais em diferentes organismos.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por uma bolsa de pesquisa do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia (Grant No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) a Nimisha Sharma. Os autores agradecem ao Prof. Charles Hoffman (Boston College, EUA) pelo presente da biblioteca de cDNA de S. pombe e à Profª Susan Forsburg pelos plasmídeos de levedura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-NQO Sigma N8141
Acetic Acid, glacial Sigma 1371301000
Adenine Sulphate Himedia GRM033
Agar Himedia GRM026
Agarose Lonza 50004L
Ammonium Chloride Himedia MB054
BamHI Fermentas ER0051
Biotin Himedia RM095
Boric Acid Himedia MB007
Calcium Chloride  Sigma C4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma C0549
Citric Acid Himedia RM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrous Himedia GRM3960
single stranded DNA from Salmon testes Sigma D7656
EDTA disodium Sigma 324503
Ferric Chloride Hexahydrate Himedia RM6353
Glucose Amresco 188
Ionositol Himedia GRM102
Isopropanol Qualigen Q26897
Leucine Himedia GRM054
Lithium Acetatae Sigma 517992
Magnesium Chloride Hexahydrate Himedia MB040
Molybdic Acid Himedia RM690
Nicotinic Acid Himedia CMS177
PEG, MW 4000 Sigma 81240
Pentothinic Acid Himedia TC159
Phenol Himedia MB082
Plasmid Extraction Kit Qiagen 27104
Potassium Chloride Sigma P9541
Potassium hydrogen Pthallate Merc DDD7D670815
Potassium iodide Himedia RM1086
RNAse Fermentas EN0531
SDS Himedia GRM205
Sodium Hydroxide Himedia GRM1183
Sodium Sulphate Himedia RM1037
Tris free Base Himedia MB209
Uracil Himedia GRM264
Yeast Extract Powder Himedia RM668
Zinc Sulphate Heptahydrate Merc DJ9D692580

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia Edição 187 Tela genética Supressores de multicópia Schizosaccharomyces pombe Ell1 Regulação gênica Alongamento de transcrição
Triagem Genética para Identificação de Supressores Multicópia em <em>Schizosaccharomyces pombe</em>
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Bhardwaj, V., Sweta, K., Gyala, D., Sharma, N. Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe. J. Vis. Exp. (187), e63967, doi:10.3791/63967 (2022).

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