Summary
이 연구는 Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 유전자 스크리닝을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스크린은 게놈 전체 플라스미드 라이브러리를 사용하여 질의 돌연변이 균주와 관련된 기능 상실 표현형의 억제인자 클론(들)을 식별합니다. ell1 null 돌연변이체의 신규한 유전자 억제인자를 이 스크린을 사용하여 확인하였다.
Abstract
유전적 상호작용의 식별은 다른 유전자와의 기능적 관계 및 생물학적 경로 및 과정에 대한 조직에 대한 통찰력을 제공함으로써 유전자의 기능을 해독하는 강력한 도구입니다. 대부분의 유전자 스크리닝은 처음에 사카로마이세스 세레비시아에에서 개발되었지만, 이러한 유전자 스크리닝을 수행하기 위한 보완적인 플랫폼은 Schizosaccharomyces pombe에 의해 제공되었다. 유전적 상호작용을 확인하는 데 사용되는 일반적인 접근법 중 하나는 기능 상실 돌연변이에서 게놈 전체의 높은 복제 수 플라스미드 라이브러리에서 클론을 과발현한 다음 돌연변이 표현형을 억제하는 클론을 선택하는 것입니다.
이 논문은 S. pombe에서 이 '다중 복제 억제' 기반 유전자 스크리닝을 수행하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스크린은 S. pombe 에서 Ell1 전사 신장 인자의 부재와 관련된 유전 독성 스트레스 민감성 표현형의 다중 복제 억제 인자를 식별하는 데 도움이되었습니다. 스크리닝은 질의 ell1 널 돌연변이 균주를 높은 카피 수 S. 폼베 cDNA 플라스미드 라이브러리로 형질전환하고, 유전독성 스트레스 유도 화합물인 4-니트로퀴놀린 1-옥사이드(4-NQO)를 함유하는 EMM2 플레이트 상에서 억제인자를 선택함으로써 시작되었다. 이어서, 플라스미드를 2개의 후보 억제 콜로니로부터 분리하고, 제한 효소에 의해 분해하여 삽입 DNA를 방출하였다. 삽입 DNA 단편을 방출하는 플라스미드를 ell1 결실 균주로 재변형시켜 4-NQO 및 기타 유전독성 화합물의 존재 하에 ell1 결실 돌연변이체의 성장을 회복시키는 이들 억제 플라스미드 클론의 능력을 확인하였다. 결실 표현형의 구조를 보여주는 플라스미드는 ell1 결실 관련 유전독성 스트레스 민감성 표현형의 억제를 담당하는 유전자(들)를 확인하기 위해 시퀀싱되었습니다.
Introduction
유전적 상호작용의 네트워크는 유전자에 대한 기능적 정보를 제공하고 이러한 유전자가 생체 내에서 관여할 수 있는 경로와 생물학적 과정을 설명합니다. 또한 서로 다른 유전자가 서로 상호 작용하는 방식에 대한 통찰력을 제공하여 특정 표현형 1,2,3을 생성 할 수도 있습니다. 수년에 걸쳐 연구자들은 근본적인 생물학적 질문에 답하고 인간의 질병을 연구하기 위해 다양한 유전자 검사를 설계했습니다. 유전적 상호작용의 확인을 위한 스크리닝은 여러 가지 방법으로 수행될 수 있다. 서로 다른 유전자 스크리닝에서 확인된 유전적 상호작용은 유전자 간의 뚜렷한 기계론적 관계를 나타낼 수 있다. 또한 연구에 따르면 공통된 유전 적 상호 작용 세트는 동일한 경로 또는 복합체 4,5에 속하는 단백질을 암호화하는 유전자에 의해 공유됩니다. 따라서, 유전적 상호작용 네트워크는 세포에서 기능적 조직을 확립하는데 사용될 수 있으며, 여기서 가장 유사한 프로파일을 공유하는 유전자는 동일한 복합체 또는 경로에 속하고, 다소 덜 유사한 프로파일을 공유하는 유전자는 동일한 생물학적 과정에 속하며, 중복되지만 더 다양한 프로파일을 나타내는 유전자는 동일한 세포 구획에 속하는 구성원을 반영한다(6).
용량 억제('고복제 또는 다중 복제 억제')에 기반한 유전적 상호 작용 스크리닝은 일반적으로 사용되는 접근 방식 중 하나입니다. 이러한 스크리닝은 질의 돌연변이 균주를 높은 복제 수 게놈 또는 cDNA 라이브러리로 형질전환한 다음, 유전적 상호작용을 억제하거나 향상시키는 것을 식별하기 위한 적절한 분석/선택 기술을 수행함으로써 수행될 수 있다7,8,9. 포괄적인 게놈 전체 커버리지를 보장하기 위해, 이러한 스크리닝은 또한 게놈 전체 기능 상실 돌연변이체 모음에서 관심 있는 특정 유전자를 과발현하거나 기능 손실 쿼리 돌연변이체에서 높은 카피 수의 플라스미드로 인코딩된 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 과발현함으로써 수행되었습니다. 9,10,11,12,13,14,15 . 다중 복제 전략은 조절 가능한 프로모터를 사용하는 우성/과발현 접근 방식을 사용하여 작동할 수도 있습니다.
억제기 기반 스크린을 사용하는 주요 이점은 다른 유전자에 의한 돌연변이 균주에서 기존 표현형의 억제가 다른 접근법을 사용하여 입증되지 않았을 수 있는 이 두 유전자 산물 간의 유전적 관계를 설정한다는 것입니다. 둘째, 기존 돌연변이의 존재는 특정 경로를 민감하게 하여 보다 직접적인 유전적 선택에 의해 확인되지 않았을 수 있는 억제인자의 분리에 의해 해당 경로의 추가 구성 요소를 식별할 수 있도록 하는 것으로 관찰되었습니다. 더욱이, 이 스크린은 상이한 억제 메커니즘(16)을 갖는 억제인자를 식별하는데 사용될 수 있다. 억제 자 상호 작용은 일반적으로 기능적으로 관련되고 경로의 계층 구조를 설명하는 데 사용할 수있는 유전자 사이에서 발생합니다. 억제의 정확한 기본 메커니즘은 스크린에 사용된 질의 돌연변이의 유형, 실험 조건 및 유전자 발현 수준을 포함한 여러 요인에 따라 다를 수 있습니다. 일반적인 투여 억제 메커니즘 중 하나는 동일한 복합체에서 또는 동일한 세포 / 생물학적 과정에서 병렬로 기능하는 제품을 암호화하는 유전자를 포함합니다. 효모와 같은 더 단순한 모델 유기체에서 이러한 스크리닝의 결과는 대부분의 기본적인 생물학적 경로와 과정이 진화를 통해 보존되기 때문에 고등 진핵 생물로 확장 될 수 있습니다.
이러한 유전자 스크리닝은 다양한 생물학적 질문에 답하기 위해 여러 가지 방법으로 수정할 수도 있습니다. 예를 들어, 질의 돌연변이 균주의 표현형을 억제할 수 있는 상이한 유기체로부터의 동종 유전자가 확인될 수 있다. 또한 잠재적인 내성 메커니즘을 설명하고 새로운 항균17,18, 항진균제19,20, 구충제 21 및 항암 22 화합물의 단백질 표적을 결정하는 데 사용되었습니다. 이 스크린은 또한 작용 메커니즘이 알려지지 않은 의약품의 활성 억제 인자를 식별하기 위해 악용되었습니다. 따라서, 원칙적으로, 이들 멀티카피 서프레서 스크린은 상이한 유기체에서의 다양한 어플리케이션에서 최적화되고 사용될 수 있다. 효모 연구자들에 의해 사용되는 대부분의 유전자 스크리닝은 초기에 S. cerevisiae에서 개발되었지만, S. pombe는 다양한 유전자 스크리닝 및 분석을 수행하기 위한 보완적인 모델 시스템으로 등장했다(23). 더욱이, 더 많은 유전자에서 인트론의 발생, DNA 복제 기원의 복잡성, 중심체 구조, 세포주기의 조직 및 RNAi 기계의 존재와 같은 S. pombe의 게놈 조직 및 생물학적 과정은 S. pombe와 고등 진핵 생물23,24 사이의 더 큰 유사성을 보여 주며, S. pombe에서 유전 도구를 설계하고 사용하는 것의 중요성을 강조합니다.
이 논문은 S. pombe에서 기능 상실 돌연변이 표현형의 '용량 억제'를 기반으로 유전 적 상호 작용을 식별하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 기본은 멀티카피 플라스미드 및/또는 강력한 프로모터로부터 야생형 유전자를 과발현하는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것이 빠르고 효율적인 방법이라는 것입니다. 이 프로토콜에는 4가지 주요 단계가 있습니다: 라이브러리를 쿼리 돌연변이 균주로 형질전환, 쿼리 돌연변이 균주의 원하는 표현형을 억제하는 플라스미드 클론 선택, 이러한 억제 클론에서 플라스미드 검색, 표현형 억제를 담당하는 유전자 식별. 라이브러리로부터 cDNA의 선택 및 식별에 기초한 임의의 방법에 대해 사실인 것처럼, 스크린의 성공은 스크린이 라이브러리에 존재하는 이들 cDNA 클론만을 검색할 수 있기 때문에 고품질 및 고복잡성 라이브러리를 사용하는 것에 의존한다.
이 프로토콜을 사용하여, 우리는 질의 S. pombe ell1 널 돌연변이체의 유전독성 스트레스 민감성 표현형의 2개의 신규한 억제인자를 성공적으로 확인하였다. 전사 신장 인자의 ELL (11 Nineteen Lysine Rich Leukemia) 계열은 시험관 내 생화학 분석에서 DNA 주형에서 RNA 중합 효소 II의 일시적인 일시 중지를 억제하고 핵분열 효모에서 인간25에 이르기까지 다양한 유기체에 걸쳐 보존됩니다. 이전 연구는 S. pombe ell1 null 돌연변이가 4- 니트로 퀴놀린 1- 옥사이드 (4-NQO) 및 메틸 메탄 설포 네이트 (MMS) 26의 존재하에 유전 독성 스트레스 민감도를 나타낸다는 증거를 제공했습니다. 따라서, S. pombe 플라스미드로 암호화된 멀티카피 cDNA 라이브러리를 질의 S. pombe ell1 null 돌연변이체로 변환하고, DNA 병변을 유도하는 화합물인 4-NQO의 존재 하에서 S. pombe ell1 null 돌연변이체의 유전독성 스트레스 민감도를 억제하는 능력을 나타내는 2개의 추정 클론을 확인하였다. 플라스미드 클론에 존재하는 삽입물의 후속 시퀀싱은 rax2+ 및 osh6+를 코딩하는 유전자가 ell1 null 돌연변이체에서 과발현될 때 ell1 null 돌연변이체의 유전 독성 스트레스 민감도를 억제하는 역할을 한다는 것을 확인했습니다.
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Protocol
1. cDNA 라이브러리를 질의 S. pombe 돌연변이 균주로 형질전환하여 멀티카피 억제인자를 스크리닝하는 방법
참고: 표준 리튬-아세테이트 방법27을 따라 S. pombe cDNA 라이브러리를 몇 가지 수정을 통해 질의 S. pombe ell1Δ 균주로 변환했습니다.
- S. pombe ell1 Δ균주를 아데닌, 류신 및 우라실의 각각 225μg/mL가 보충된 YE 배지(표 1) 플레이트에서 32°C에서 성장시킨다. 위의 플레이트에서 ell1Δ 균주의 접종물로 가득 찬 루프를 아데닌, 류신 및 우라실이 각각 225μg/mL가 보충된 15-20mL의 YE 배지에 접종합니다. 이를 진탕(200-250 rpm)하면서 32°C에서 밤새 배양한다.
- 다음날, 원하는 보충제와 함께 100mL의 새로운 YE 배지에서 밤새 배양물을 0.3의 OD 600nm(600nm에서의 광학 밀도)로 희석하고, OD600nm가 중간 로그 상에 도달할 때까지 200-250rpm에서 진탕하면서 32°C에서 배양한다.
- 100mL 배양액을 2개의 50mL 원심분리 튜브로 나눈 다음 실온에서 4,000× g에서 10분 동안 원심분리합니다.
- 상청액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 멸균수로 세척하고, 즉, 세포를 1mL의 멸균수에 재현탁시키고, 실온에서 5분 동안 4,000× g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 버리고 단계 1.4에 기재된 바와 같이 각 세포 펠릿을 1mL의 1x LiAc-TE(100mM 리튬 아세테이트, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5) 용액으로 세척한다.
- 상청액을 제거하고 각 세포 펠렛을 250μL의 1x LiAc-TE에 재현탁시킨다. 관심 DNA로 형질전환하기 위해 이러한 S. pombe 적격 세포(500μL)를 사용하십시오. 후속 변형 단계를 위해 125μL의 적격 세포를 4개의 서로 다른 멸균 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 연어 고환이나 청어 정자의 운반체 DNA를 1 분 동안 끓여서 즉시 얼음 위에 놓습니다. 각 형질전환에 대해 10μL의 10mg/mL 변성 단일 가닥 담체 DNA를 125μL의 적격 세포가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브에 추가한 다음 마이크로피펫 팁을 사용하여 부드럽게 혼합합니다. 이어서, 50 μg의 S. pombe cDNA 라이브러리를 유능한 세포-담체 DNA 혼합물-함유 미세원심분리 튜브에 첨가한다.
- 마이크로 원심 분리 튜브를 실온에서 10 분 동안 배양 한 다음 260μL의 폴리에틸렌 글리콜-리튬 아세테이트 용액 (40 % [w / v] PEG 4,000, 100mM 리튬 아세테이트, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5)을 튜브에 넣고 마이크로 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 혼합합니다.
- 변형 혼합물이 포함된 미세원심분리 튜브를 흔들지 않고 32°C에서 2시간 동안 인큐베이션합니다. 예열된 디메틸설폭사이드(DMSO) 43μL를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 부드럽게 혼합합니다. 그 후, 튜브를 42°C에서 5분 동안 열 충격에 노출시킵니다.
- 실온에서 5분 동안 4,000× g 의 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 버리고 마이크로피펫 팁을 사용하여 잔류 PEG-LiAc-TE 용액을 제거합니다.
- 세포를 100μL의 멸균수에 재현탁하고 필요한 보충제와 0.2μg/mL의 4-NQO를 사용하여 하나의 EMM2(표 1) 플레이트(150mm)에 플레이트합니다.
- 플레이트를 32°C에서 5-6일 동안 배양하여 플레이트에 콜로니가 나타나도록 합니다. 0.2 μg/mL의 4-NQO가 있는 상태에서 동일한 배지 플레이트에 획득한 콜로니를 줄무늬로 만들고 추가 스크리닝에 사용합니다.
- 하나의 라이브러리 형질전환 실험의 경우, 상기 단계 1.8 내지 1.14에 설명된 바와 같이 형질전환에 500μL의 적격 세포(125μL의 적격 세포 x 4개의 마이크로원심분리 튜브)를 사용한다.
- 대조군으로서, 하나의 EMM2 플레이트(150mm)에 형질전환 혼합물의 1/10을 플레이트하고, 필요한 보충제를 포함하되 4-NQO가 결여된 상태에서, 라이브러리의 형질전환 후 수득된 라이브러리 클론의 총 수를 계산하고, 억제자클론의 단 리를 스크리닝한다.
2. 추정 억제기에 의한 질의 돌연변이 균주와 관련된 표현형의 구조/억제를 테스트하고 검증합니다.
참고: 스트레스 스팟 분석은 추정 억제기에 의한 ell1 결실 관련 4-NQO 응력 민감도의 구조/억제를 테스트하고 검증하기 위해 아래에 설명된 대로 수행되었습니다.
- 멸균 96웰 마이크로타이터 플레이트의 서로 다른 웰 각각에 100-200μL의 멸균수를 추가합니다.
- 멸균 이쑤시개 또는 20-200 μL 마이크로피펫 팁을 사용하여 4-NQO를 함유하는 플레이트 상에서 cDNA 라이브러리 형질전환 후 수득된 각각의 상이한 콜로니로부터 소량의 접종물을 선택한다. 각각의 다른 콜로니로부터의 접종물을 100-200 μL의 멸균수를 함유하는 마이크로타이터 플레이트의 분리된 독립적인 웰에 첨가한다. 철저히 섞는다.
- 각 웰에서 세포 현탁액 3μL를 아데닌(225μg/mL) 및 우라실(225μg/mL)을 포함하지만 류신(이 작업에 사용된 라이브러리 구성에 사용되는 플라스미드 벡터에 존재하는 선택 가능한 영양 요구성 마커)이 부족한 EMM2 한천 플레이트에 스팟합니다. 필요에 따라 플레이트에 적절한 농도의 4-NQO를 추가합니다.
- 플레이트를 32°C에서 3-4일 동안 배양하여 세포가 성장할 수 있도록 합니다. 추정 억제 인자로서 다양한 농도의 4-NQO가있는 상태에서 성장을 보이는 콜로니를 식별하십시오.
- 억제인자를 추가로 검증하려면 선택된 억제 균주와 함께 적절한 대조 균주를 32°C에서 밤새 진탕(200-250rpm)하여 각각 225μg/mL의 아데닌과 우라실을 포함하지만 류신이 부족한 EMM2 배지에서 성장시킵니다.
- 다음날, 세포를 신선한 EMM2 배지에서 0.3의 OD 600 nm로 희석하고, 중간 로그 단계(0.6-0.8의 대략 OD600 nm)까지 진탕하면서 32°C에서 성장시킨다.
- 0.4μM 4-NQO 또는 0.01% MMS를 함유한 필수 보충제를 사용하여 EMM2 플레이트에서 배양물의 적절한 연속 희석액(1:10 또는 1:5)을 찾아냅니다. 통제를 위해 EMM2 플레이트에서 필요한 보충제가 있지만 DNA 손상 물질이 없는 균주를 발견하십시오.
- 플레이트를 32°C에서 3-5일 동안 배양하여 성장을 모니터링합니다.
참고: 질의 돌연변이 균주와 관련된 표현형에 기초한 적합한 분석은 표현형의 구조 또는 억제를 시험하기 위해 사용되어야 한다. 예를 들어, 질의 돌연변이 균주의 감기에 민감한 표현형의 억제자가 확인될 필요가 있는 경우, 억제자 클론의 시험 및 검증을 위한 분석은 저온에서 형질전환체를 성장시키는 것을 포함할 것이다. - 관심 유전자(이 경우 Spell1 ) 또는 빈 벡터로 형질전환된 돌연변이 균주를 라이브러리 형질전환체와 함께 각각 양성 및 음성 대조군으로 스팟합니다.
3. S. pombe 서프레서 클론으로부터 플라스미드의 분리
참고: S. pombe 로부터의 플라스미드 분리는 핵분열 효모: 실험실 매뉴얼28 에 설명된 프로토콜에 따라 수행되었으며 몇 가지 수정이 있었습니다.
- 225μg/mL의 아데닌과 우라실을 포함하는 EMM2 배지에 단일 효모 콜로니를 접종하고 200-250rpm에서 흔들면서 32°C에서 밤새 세포를 성장시킵니다. 다음날, 실온에서 4,000 × g 에서 2분 동안 원심분리하여 5개의 O.D. 세포(즉, O.D. 0.5의 10mL 배양물)를 수확한다.
- 상청액을 제거하고, 세포 펠렛을 0.2 mL의 용해 완충액 (2% 트리톤 X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 및 1 mMNa2EDTA)에 재현탁시킨다.
- 0.2mL의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1)과 0.3g의 산 세척 유리 비드를 미세 원심분리 튜브에 추가합니다. 마이크로 원심 분리 튜브를 4 ° C에서 2 분 동안 와동시키고 얼음 위에서 1 분 동안 배양합니다. 이 단계를 6x 반복합니다.
- 튜브를 10,000×g에서 실온에서 15 분 동안 원 심분리합니다. 상부 수성 층을 새로운 미세 원심분리 튜브로 옮기고 200μL의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1)을 추가합니다.
- 튜브를 10,000×g에서 10 분 동안 원 심분리합니다. 상부 수성 층을 새로운 튜브로 옮기고 2 부피의 100 % 에탄올 (~ 400 μL)과 1/10 부피의 아세트산 나트륨 (3 M, pH 5.8) (~ 20 μL)을 튜브에 추가합니다. 마이크로 원심분리 튜브를 -70°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 4°C에서 15 분 동안 10,000×g에서 원심분리하여 DNA를 침전시키고 상층액을 제거한다. DNA 펠릿을 70% 에탄올(~500μL)로 세척하고 실온에서 공기 건조시킵니다.
- 20 μL의 멸균수에 DNA를 재현탁시킨다. 유능한 대장균 세포의 형질전환을 위해 2-5μL의 플라스미드 DNA를 사용하십시오.
참고: 플라스미드는 또한 상업적으로 입수가능한 임의의 효모 플라스미드 분리 키트를 사용하여 효모 세포로부터 분리될 수 있다.
4. 서프레서 클론에 의해 코딩되는 유전자의 동정
- 분리된 효모 플라스미드를 표준 프로토콜29를 사용하여 대장균 Top10 균주[F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG]로 형질전환시키고 필요한 항생제가 있는 LB(루리아 브로스) 플레이트에 세포를 퍼뜨립니다.
- 표준 알칼리 용해 프로토콜29를 사용하여 대장균 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하고, 제한 효소의 적절한 조합을 따라 제한 분해에 의한 삽입된 DNA 단편의 방출을 확인합니다.
참고: 억제기 플라스미드 84는 Bam HI 제한 효소로 소화되었고, 억제기 플라스미드 104는 PstI/BamHI 제한 효소로 소화되었습니다. - ell1Δ균주에서 제한 소화 후 삽입 방출을 나타내는 플라스미드를 재변환하여 ell1Δ 균주의 유전독성 스트레스 민감성 표현형을 구출하는 능력을 확인하였다.
- 유전독성 스트레스 민감도의 억제를 나타내는 플라스미드 클론을 선택하고, 벡터 특이적 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 이들 플라스미드 클론에 존재하는 삽입된 DNA 단편을 서열분석한다.
참고: 본 연구에서, adh1 프로모터 특이적 유니버셜 포워드 프라이머 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')를30 번 사용하였다. - 억제를 담당하는 유전자를 확인하기 위해, NCBI 뉴클레오티드 블라스트 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) 또는 Pombase 서열 정렬 도구 (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core)를 사용하여 수득한 서열을 정렬한다. 최대 정렬을 나타내는 서열을 선택하고 다중 복제 억제 플라스미드에 대한 유전자로 식별합니다.
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Representative Results
S. pombe에서 ell1 결실 관련 유전독성 스트레스 민감도의 다중 복제 억제인자에 대한 스크리닝
질의 ell1 결실 돌연변이 균주의 기능 상실 표현형의 멀티카피 억제인자를 확인하기 위해 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 유전자 스크리닝을 수행하였다. 4-NQO 유전독성제의 존재 하에서 관찰된 ell1 결실 균주의 성장 관련 민감도를 멀티카피 억제인자를 선택하기 위해 기능 상실 표현형으로서 채택하였다. 도 1은 유전자 스크린의 개략적인 표현을 나타낸다. 스크린을 시작하기 위해, 4-NQO의 존재 하에 그의 이소제닉 야생형 균주 (h-ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1Δ::kanMX6)의 유전독성 스트레스 민감도를 그의 이소제닉 야생형 균주 (h-ura4-D18 leu1-32ade6-M210can1-1)에 대하여 먼저 확인하였다(도 2A). 이어서, 질의 S. pombe ell1 널 돌연변이체를 고-카피 번호 S. pombe cDNA 라이브러리로 형질전환시켜 ell1 널 돌연변이체의 4-NQO 성장 관련 민감도를 억제/구제할 수 있는 플라스미드 클론을 선택하였다. 이 라이브러리는 adh1 프로모터 30의 제어하에 s. pombe 과발현 벡터인 pLEV3에 클로닝된 ~6 ×10개의 5개의 S. pombe cDNA 단편을 함유한다. 대조군으로서, 형질전환 혼합물의 1/10을 또한 4-NQO가 결여된 EMM2 플레이트에 도말하여 라이브러리의 형질전환 후 수득된 재조합 클론의 총 수를 계산하고, 라이브러리의 커버리지를 표시하고, 억제자클론의 단리를 위해 스크리닝하였다. 더 적은 수의 클론을 스크리닝하면 억제 클론을 식별할 가능성이 줄어들기 때문에 이는 매우 중요합니다.
도 2B 는 대조군 및 4-NQO 함유 플레이트의 대표적인 이미지를 나타낸다. 그림에서 볼 수 있듯이 4-NQO가 부족한 대조군 플레이트에서 많은 수의 콜로니가 얻어져 라이브러리의 양호한 커버리지를 보여줍니다. 예상된 바와 같이, 이들 형질전환체가 ell1 널 돌연변이체의 4-NQO 민감도의 추정 억제인자를 나타낼 가능성이 높기 때문에 4-NQO 플레이트 상에서 더 적은 형질전환체가 수득되었다. 다음으로, 0.2μM 4-NQO를 함유하는 EMM2 플레이트 상에서 수득된 상이한 형질전환체 콜로니를 0.2μM 4-NQO를 함유하는 EMM2 플레이트 상에 추가로 줄무늬 또는 점포하여 이들 형질전환체가 4-NQO의 존재 하에서 성장할 수 있는 능력을 확인하였다. 620개의 형질전환체 콜로니가 0.2μM 4-NQO-함유 EMM2 플레이트 상에서 성장할 수 있는 것으로 관찰되었다.
유전독성 스트레스 조건에서 ell1 결실 돌연변이체의 성장을 회복시키는 추정 억제 클론의 능력 검증
추정 억제 인자를 확인하려면 개략적 표현에 표시된 것처럼 더 엄격한 조건에서 원하는 표현형의 구조를 테스트하는 것이 중요합니다 (그림 3A). 따라서, 620개의 후보 형질전환체는 0.4 μM 4-NQO를 갖는 EMM2 플레이트에서 발견되었다. 도 3B에서 알 수 있는 바와 같이, 단지 74개의 형질전환체만이 0.4μM 4-NQO에서 성장을 보였다. 이어서, 이들 74개의 형질전환체는 0.8μM 4-NQO를 함유하는 EMM2 플레이트 상에서 발견되었고, 16개만이 0.8μM 4-NQO의 존재 하에서 성장을 보인 것으로 관찰되었다(도 3C). 이러한 관찰을 추가로 확인하기 위해, 이 16개의 형질전환체는 빈 벡터로 형질전환된 ell1 결실 돌연변이체와 함께 0.8μM 4-NQO 또는 4-NQO(대조군)를 함유하지 않는 필수 보충제가 있는 EMM2 플레이트에서 발견되었습니다. 이러한 스포팅 분석의 결과는 예상대로 빈 벡터로 형질전환된 ell1 결실 균주와 16개의 형질전환체 모두가 4-NQO가 결여된 플레이트에서 성장을 나타냄을 보여주었습니다. 이에 비해, 빈 벡터만을 함유하는 ell1 결실 돌연변이체는 0.8μM 4-NQO에서 성장을 나타내지 않은 반면, 6개의 형질전환체는 0.8μM 4-NQO에서 성장을 나타내었으며(도 3D), 이는 이들 안에 존재하는 라이브러리 클론(들)이 ell1 널 돌연변이체의 유전독성 스트레스 표현형을 억제하는 능력을 가지고 있음을 시사한다.
서프레서 클론에 의해 코딩되는 유전자의 동정
다음으로 ell1 결실 균주의 02 유전자 억제인자인 sup 84 및 sup 104를 선택하여 4-NQO의 존재 하에 ell1 관련 성장 민감도의 완전한 억제를 보여주었습니다. 라이브러리 플라스미드 클론(들)은 이 두 효모 억제제로부터 분리되고 유능한 대장균 세포로 형질전환되었습니다. 이어서, 플라스미드를 표준 프로토콜31을 사용하여 대장균 세포로부터 단리하였다. 84 및 104로 표지된 2개의 분리된 플라스미드는 제한 소화를 거쳐 각각 약 1,000bp 및 800bp 삽입 DNA 단편의 존재를 밝혀냈다(그림 4A,B). 이 억제인자 스크린의 결과를 추가로 검증하기 위해, 이들 플라스미드를 ell1 결실 돌연변이체로 재변형시키고, 4-NQO의 존재 하에서 ell1 널 돌연변이 체의 성장을 회복시킬 수 있는지 확인하였다. 스트레스 스팟 분석은 억제 플라스미드 클론이 ell1 null 돌연변이에 재도입될 때 4-NQO 관련 성장 민감도의 억제를 초래한다는 것을 밝혀냈으며, 이는 억제가 플라스미드 의존적임을 시사합니다(그림 4C). 또한, 우리는 이러한 억제 클론이 다른 DNA 손상 유도 화합물 인 MMS의 존재하에 ell1 결실 균주의 성장 관련 민감도를 억제 할 수 있는지 여부를 결정하기로 결정했습니다. 스팟 분석은 억제 플라스미드 클론을 ell1 null 돌연변이체로 형질전환한 것이 빈 벡터로 ell1 결실 돌연변이체를 형질전환한 것보다 MMS 함유 배지에서 더 많은 성장을 가져온다는 것을 입증했으며, 이는 이들 플라스미드 클론이 두 유전독성제의 존재 하에 ell1 결실 돌연변이 체의 유전독성 스트레스 민감도를 억제할 수 있음을 시사하며, 즉, 4-NQO 및 MMS (그림 4D).
다음으로, 이들 서프레서 플라스미드 클론에 존재하는 유전자를 확인하기 위해, 삽입된 DNA 단편의 시퀀싱은 adh1 프로모터 특이적 유니버셜 포워드 프라이머30을 이용하여 수행하였다. 얻은 뉴클레오티드 서열은 PomBase 웹 사이트 (https://www.pombase.org)에서 구할 수있는 'BLAST at Ensembl'도구를 사용하여 검색되었으며, 두 플라스미드 클론 84 및 104가 각각 rax2+ 및 osh6+ 유전자를 함유하고 있음을 밝혀 Rax2 및 Osh6이 S. pombe에서 ell1+의 부재와 관련된 유전 독성 스트레스 민감 표현형을 억제하는 역할을한다는 증거를 제공했습니다. . S. pombe에서이 두 단백질의 기능에 대한 지식은 제한적입니다. Rax2는 S. pombe32에서 식물 성장 동안 세포 극성을 조절하기 위해 For3p의 국소화를 조절하는 것으로 나타났다. Osh6는 옥시스테롤 결합 단백질 관련 단백질 계열에 속하는 지질 수송 단백질입니다. 그것은 소포체로부터 원형질막(33)으로의 포스파티딜세린의 수송에 관여한다.
그림 1: 유전자 다중 복제 억제기 화면의 개략적 표현. 이 프로토콜에는 4가지 주요 단계가 있습니다: 라이브러리를 쿼리 돌연변이 균주로 형질전환, 쿼리 돌연변이 균주의 원하는 표현형을 억제하는 플라스미드 클론 선택, 이러한 억제 클론에서 플라스미드 검색, 표현형 억제를 담당하는 유전자 식별. 약어 : 4-NQO = 4- 니트로 퀴놀린 1- 옥사이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: S. pombe에서 ell1 결실 관련 유전독성 스트레스 민감도의 다중 복제 억제인자에 대한 스크리닝. (A) 이소제닉 야생형 균주와 비교하여 ell1-결실된 S. pombe 균주의 4-NQO 민감도를 나타내는 스트레스 스팟 분석. 적절한 균주의 연속 희석(1:10)이 0.4μM 4-NQO의 유무에 관계없이 아데닌, 류신 및 우라실을 각각 225μg/mL 함유하는 EMM4 배지에서 발견되었습니다. 이어서, 플레이트를 32°C에서 3-5일 동안 인큐베이션하였다. (B) 높은 카피-수 cDNA 라이브러리를 ell1-결실된 S. pombe 균주에서 형질전환시키고, 형질전환된 콜로니를 류신이 결여되지만 0.2μM 4-NQO를 함유하는 EMM2 배지에 도말하였다. 변형 혼합물의 작은 부분 표본을 또한 대조군으로서 4-NQO가 결여된 EMM2 플레이트 상에 도말하였다. 플레이트를 32°C에서 5-6일 동안 인큐베이션하고 사진을 찍었다. 패널 B는 이들 플레이트의 대표 이미지를 나타낸다. 약어 : 4-NQO = 4- 니트로 퀴놀린 1- 옥사이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: ell1 결실 돌연변이체의 유전독성 스트레스 민감도를 억제하는 것으로 추정되는 억제인자 클론의 능력 검증. (A) 원하는 표현형의 억제를 시험함으로써 라이브러리 형질전환체의 스크리닝의 개략적인 표현. 620개의 형질전환체의 성장은 류신이 결여되고 (B) 0.4μM 4-NQO 또는 (C) 0.8μM 4-NQO를 함유하는 EMM2 플레이트 상의 상이한 형질전환체를 발견함으로써 4-NQO의 농도 증가에 대해 시험하였다. 플레이트를 32°C에서 5-6일 동안 인큐베이션하고 사진을 찍었다. 플레이트의 대표 이미지가 표시되었습니다. (D) 0.8μM 4-NQO에서 성장을 보이는 16개의 형질전환체가 류신이 부족하지만 0.8μM 4-NQO를 함유하거나 4-NQO(대조군)를 함유하지 않는 EMM2 플레이트에서 빈 벡터로 형질전환된 ell1 결실 균주와 함께 발견되었습니다. 플레이트를 32°C에서 5-6일 동안 인큐베이션하고 사진을 찍었다. 단지 6개의 콜로니만이 ell1 결실 관련 유전독성 스트레스 민감성을 구제하는 능력을 나타냈다. 약어 : 4-NQO = 4- 니트로 퀴놀린 1- 옥사이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 서프레서 플라스미드 클론의 식별. BamHI 제한 효소를 사용한 서프레서 플라스미드 84의 (A) 제한 소화의 아가로스 겔 이미지는 ~1 kb의 삽입물을 방출하였다. (B) PstI/BamHI 제한 효소로 소화된 억제 플라스미드 104는 ~800bp의 삽입물을 방출했습니다. (C) 플라스미드, sup 84 또는 sup 104로 형질전환된 1:10 연속 희석된 ell1 null 돌연변이체는 류신이 부족하고 0.4μM 4-NQO 또는 (D) 0.01% MMS를 함유하는 EMM2 플레이트에서 발견되었습니다. 대조군 플레이트에서는 DNA 손상 물질이 첨가되지 않았습니다. 플레이트를 32°C에서 4-5일 동안 인큐베이션하고 사진을 찍었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : S. pombe의 성장을위한 배지의 구성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
효모는 진핵 생물에 걸쳐 진화 적으로 보존되는 기본적인 생물학적 과정과 경로를 조사하는 데 널리 사용되었습니다. 다양한 생화학적, 유전적 및 분자적 절차에 대한 순응성과 함께 유전 및 게놈 도구의 가용성은 효모를 유전 연구를 위한 훌륭한 모델 유기체로 만듭니다34,35,36. 수년에 걸쳐, 효모 연구자들은 개별 유전자의 기능뿐만 아니라 이들이 관여 할 수있는 경로 및 생물학적 과정을 밝힐 수있는 유전 적 상호 작용을 식별하기 위해 다양한 유전자 스크리닝을 설계했습니다10,11,17,37. 유전적 상호작용을 식별하는 일반적이고 유용한 스크린 중 하나는 '다중 복제 또는 높은 복제 수 억제'로 알려져 있습니다.
이 스크린에는 기능 상실 표현형을 나타내는 쿼리 돌연변이 균주가 필요하며, 이어서 이 돌연변이 쿼리 균주를 높은 복제 수 게놈 또는 cDNA 라이브러리로 변환해야 합니다. 이어서, 수득된 형질전환체를 스크리닝하여 이들 유전자를 확인하고, 유전자는 과발현될 때, 질의 돌연변이 균주(들)와 연관된 표현형을 억제한다. 특정 돌연변이 균주와 플라스미드 라이브러리 클론에 존재하는 유전자 (들) 사이의 이러한 유형의 유전 적 상호 작용은 동일한 경로에서 작용하거나 동일한 생물학적 과정에 영향을 미칠 가능성이있는 유전자 산물의 분리 및 식별을 초래합니다4. 따라서 이 화면은 관심 유전자(들)의 기능과 생체 내 경로 및 생물학적 과정으로의 기능적 조직에 대한 통찰력을 제공합니다. 전통적으로이 스크린은 S. cerevisiae 38,39,40,41,42에서 광범위하게 사용되었습니다.
본 연구의 목표는 S. pombe 에서 다중 복제 억제 유전자 스크리닝을 수행하기 위한 간단하고 간단한 프로토콜을 설명하는 것이다. ell1 전사 신장 인자의 결실을 운반하는 S. pombe 균주를 사용하여 스크린을 수행하였다. ELL은 핵분열 효모에서 인간에 이르기까지 광범위한 유기체에 존재하는 전사 신장 인자 계열입니다. Ell1의 기능은 S. pombe에서 이해되기 시작했습니다. 이전 연구는 정상적인 성장 조건에서 최적의 성장과 유전 독성 스트레스 조건26 동안의 생존에서 Ell1의 역할을 강조했습니다. 우리는 S. pombe26에서 유전 독성 스트레스 민감도에서 Ell1의 역할의 기초가되는 분자 메커니즘을 밝히기위한 접근법 중 하나로 다중 복제 억제 인자 스크리닝을 사용했습니다. 멀티카피 플라스미드-코딩된 S. pombe cDNA 라이브러리를 4-NQO에 대한 민감성을 나타내는 S. pombe ell1 널 돌연변이체로 형질전환시켰다. 이어서, 4-NQO의 존재 하에서 성장할 수있는 형질 전환체를 선택했다.
이러한 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하고 이러한 플라스미드에 존재하는 삽입물의 시퀀싱을 통해 S. pombe, rax2+ 및 osh6+에서 ell1+의 두 가지 새로운 유전적 상호작용자를 식별했습니다. S. pombe에서 유사한 유전자 스크리닝을 사용한 이전 연구에서도 항침묵 단백질인 epe1+를 ell1 결실 관련 표현형43의 다중 복제 억제자로 확인했습니다. 우리는 또한 S. pombe RNA 중합효소 II의 비필수 Rpb9 서브유닛의 다중 복제 억제인자를 식별하는 데 이 방법을 사용했습니다(미공개 관찰). 종합적으로, 이러한 결과는 원하는 관심 유전자와 유전적 상호작용을 나타내는 추정 유전자/단백질을 식별하고 관심 유전자가 관여할 수 있는 기능, 경로 및 프로세스를 설명하는 방법으로서 유전자 다중 복제 억제 스크리닝 접근법의 유용성을 검증합니다.
이 작업에 설명된 스크린을 사용하려면 먼저 돌연변이와 관련된 명확한 표현형을 나타내는 쿼리 돌연변이 균주를 갖는 것이 중요하며, 이는 다중 복제 억제기(들)를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 이러한 스크린의 성공은 야생형 유전자 또는 그의 상응하는 cDNA의 최대 수를 나타내는 클론을 함유하는 고품질의 우수한 대표 라이브러리의 이용가능성에 의존할 것이다. 전통적으로, 게놈 및 cDNA 라이브러리가 이들 스크리닝에 사용되었지만, cDNA 라이브러리는 세포/유기체에서 발현되는 mRNA로부터 만들어진다는 이점이 있다. 더욱이, 효모 세포로의 그의 형질전환의 높은 효율은 많은 수의 형질전환체를 스크리닝하는 것이 중요하기 때문에, 억제인자를 식별할 확률을 증가시키는 스크린의 성공에 필수적이다. 라이브러리를 리튬 아세테이트 프로토콜을 사용하여 질의 돌연변이 균주로 형질전환한 후 대조군 플레이트에서 더 적은 형질전환체가 얻어지면, 전기천공을 사용하여 라이브러리를 형질전환할 수 있다.
또한 라이브러리를 형질전환하기 전에 먼저 다른 플라스미드로 형질전환 프로토콜을 표준화하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 불필요하게 라이브러리가 손실됩니다. 여기에 설명된 프로토콜은 돌연변이 표현형으로서 4-NQO 감도를 사용하지만, 관심있는 특정 돌연변이 표현형에 기초한 억제인자의 선택을 위해 적절한 스크리닝 방법/분석이 설계되어야 한다. 라이브러리를 질의 돌연변이 균주로 형질전환한 후 억제인자를 선택하기 위해 플레이트에서 형질전환체를 얻지 못하거나 매우 적은 경우, 가능하다면 라이브러리를 플레이팅할 때 덜 엄격한 조건/분석을 사용하여 억제인자를 선택하여 높은 엄격 조건에서 유전자 억제인자를 확인하기 전에 가능한 한 많은 유전자 억제자를 검출해야 합니다. 확인된 서프레서 플라스미드 클론에서 삽입물의 존재에 대해 테스트하기 위해 제한 소화를 사용하는 것 외에도, 벡터-특이적 프라이머를 사용하는 PCR을 사용하여 원하는 삽입 DNA 단편을 증폭할 수 있다. 대안적으로, 서프레서 플라스미드 클론은 시퀀싱을 위해 직접 투여될 수 있어, 제한 소화 또는 PCR의 필요성을 피한다.
이러한 스크린은 또한 S. cerevisiae 및 S . pombe 이외의 효모에 대해 채택될 수 있으며, 유전자의 과발현을 촉진할 수 있는 적절한 돌연변이 균주, 플라스미드 및 프로모터 구축물에 관한 유전 도구 키트가 이용가능하여, 숙주 효모 세포에 존재하는 돌연변이 표현형의 구제를 허용한다. 더욱이, 게놈 전체 결실 돌연변이체(44 ) 및 과발현 라이브러리(37)의 수집을 포함하는 게놈 전체 자원의 이용가능성과 함께, 이 스크린은 또한 하나 또는 몇 개의 질의 플라스미드를 효모 돌연변이체 균주 수집의 체계적인 어레이로 형질전환시킴으로써 또는 과발현 플라스미드 수집의 체계적인 어레이를 하나 또는 소수의 돌연변이 질의 균주(45)로 형질전환시킴으로써 수행될 수 있다. . 결론적으로,이 접근법은 다른 유기체의 다양한 실험 질문으로 명확하게 일반화 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 인도 정부 생명공학부의 연구 보조금(보조금 번호. BT / PR12568 / BRB / 10 / 1369 / 2015)를 Nimisha Sharma로. 저자는 S. pombe cDNA 라이브러리를 선물한 Charles Hoffman 교수(미국 보스턴 칼리지)와 효모 플라스미드에 대해 Susan Forsburg 교수에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-NQO | Sigma | N8141 | |
| Acetic Acid, glacial | Sigma | 1371301000 | |
| Adenine Sulphate | Himedia | GRM033 | |
| Agar | Himedia | GRM026 | |
| Agarose | Lonza | 50004L | |
| Ammonium Chloride | Himedia | MB054 | |
| BamHI | Fermentas | ER0051 | |
| Biotin | Himedia | RM095 | |
| Boric Acid | Himedia | MB007 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C4901 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma | C0549 | |
| Citric Acid | Himedia | RM1023 | |
| Disodium hydrogen phospahte anhydrous | Himedia | GRM3960 | |
| single stranded DNA from Salmon testes | Sigma | D7656 | |
| EDTA disodium | Sigma | 324503 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Himedia | RM6353 | |
| Glucose | Amresco | 188 | |
| Ionositol | Himedia | GRM102 | |
| Isopropanol | Qualigen | Q26897 | |
| Leucine | Himedia | GRM054 | |
| Lithium Acetatae | Sigma | 517992 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Himedia | MB040 | |
| Molybdic Acid | Himedia | RM690 | |
| Nicotinic Acid | Himedia | CMS177 | |
| PEG, MW 4000 | Sigma | 81240 | |
| Pentothinic Acid | Himedia | TC159 | |
| Phenol | Himedia | MB082 | |
| Plasmid Extraction Kit | Qiagen | 27104 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Potassium hydrogen Pthallate | Merc | DDD7D670815 | |
| Potassium iodide | Himedia | RM1086 | |
| RNAse | Fermentas | EN0531 | |
| SDS | Himedia | GRM205 | |
| Sodium Hydroxide | Himedia | GRM1183 | |
| Sodium Sulphate | Himedia | RM1037 | |
| Tris free Base | Himedia | MB209 | |
| Uracil | Himedia | GRM264 | |
| Yeast Extract Powder | Himedia | RM668 | |
| Zinc Sulphate Heptahydrate | Merc | DJ9D692580 |
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