O desenvolvimento farmacêutico de pó seco requer testes in vivo confiáveis, muitas vezes usando um modelo murino. A tecnologia do dispositivo para fornecer aerossóis de pó seco com precisão e reprodutibilidade para camundongos é restrita. Este estudo apresenta dosadores descartáveis para liberação de drogas pulmonares em doses relevantes para camundongos, auxiliando na pesquisa inicial de prova de conceito.
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Artigo de método
Dosadores descartáveis destinados à entrega de pó seco a ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os inaladores de pó seco oferecem inúmeras vantagens para a entrega de medicamentos aos pulmões, incluindo formulações estáveis de medicamentos em estado sólido, portabilidade do dispositivo, dosagem e dosagem em bolus e um mecanismo de dispersão livre de propelentes. Para desenvolver produtos farmacêuticos de aerossol em pó seco, testes robustos in vivo são essenciais. Normalmente, os estudos iniciais envolvem o uso de um modelo murino para avaliação preliminar antes da realização de estudos formais em espécies animais maiores. No entanto, uma limitação significativa nessa abordagem é a falta de tecnologia adequada para fornecer pós secos de forma precisa e reprodutível a pequenos animais, dificultando a utilidade desses modelos. Para enfrentar esses desafios, dosadores de seringas descartáveis foram desenvolvidos especificamente para administração intrapulmonar de pós secos em doses apropriadas para camundongos. Estes dosadores carregam e fornecem uma quantidade pré-determinada de pó obtido a partir de um leito de pó de densidade aparente uniforme. Esse controle discreto é obtido inserindo-se uma agulha romba a uma profundidade fixa (tamping) no leito de pó, retirando-se uma quantidade fixa a cada vez. Notavelmente, este padrão de dosagem provou ser eficaz para uma gama de pós secos por pulverização. Em experimentos envolvendo quatro diferentes modelos de pós secos por pulverização, os dosadores demonstraram a capacidade de atingir doses dentro da faixa de 30 a 1100 μg. A dose atingida foi influenciada por fatores como o número de tamponamentos, o tamanho da agulha dosadora e a formulação específica utilizada. Um dos principais benefícios desses dosadores é sua facilidade de fabricação, tornando-os acessíveis e econômicos para a entrega de pós secos a camundongos durante estudos iniciais de prova de conceito. A natureza descartável dos dosadores facilita o uso em salas de procedimentos de animais, onde a limpeza e recarga de sistemas reutilizáveis e materiais de pesagem é inconveniente. Assim, o desenvolvimento de dosadores de seringas descartáveis abordou um obstáculo significativo na entrega de pó seco murino para estudos de prova de conceito, permitindo que os pesquisadores conduzissem estudos preliminares mais precisos e reprodutíveis em modelos animais pequenos para liberação pulmonar de drogas.
Introdução
O uso de inaladores de pó seco (IPS) para liberação pulmonar de fármacos tem despertado interesse significativo nas últimas três décadas devido à eliminação global dos propelentes clorofluorcarbono 1,2. As IPPs oferecem inúmeros benefícios em relação a outros sistemas de liberação pulmonar, como inaladores dosimetrados e nebulizadores, incluindo estabilidade da formulação, portabilidade, facilidade de uso e mecanismos de dispersão sem propelente2. No entanto, antes de mover os produtos de DPI para a tradução clínica, vários estudos pré-clínicos devem ser conduzidos, muitos dos quais são inicialmente concluídos usando um modelo murino. No entanto, as tecnologias disponíveis para fornecer pós secos de forma precisa e reprodutível a pequenos animais são limitadas.
Métodos comuns para administração de pós secos a pequenos animais, como camundongos, incluem inalação passiva 3,4,5,6,7 e administração direta 8,9,10,11,12,13. A inalação passiva normalmente requer uma câmara personalizada que utiliza grandes doses de pó seco por pulverização para preparar uma nuvem de aerossol suficiente. Como camundongos são respiradores nasais obrigatórios14, a administração por inalação passiva requer que o pó percorra o nariz e a garganta para chegar aos pulmões, sendo necessária a manutenção de uma nuvem de aerossol com propriedades aerodinâmicas de partículas suficientes 7,8. Embora seja uma técnica útil e fisiologicamente mais relevante do que a administração direta devido à inalação como resultado da respiração normal14, ela pode não ser adequada para estudos iniciais em que a massa de pó é limitada.
Alternativamente, vários dispositivos de entrega intratraqueal para entrega direta de pó seco têm sido relatados 8,9,10,11,12,13. Os dispositivos intratraqueais contornam o nariz e a garganta, entregando o pó diretamente aos pulmões e permitindo um controle mais fino sobre a dose administrada14. Além disso, alguns dispositivos, especialmente aqueles preparados usando um procedimento de tamping loading9, podem ser preparados com quantidades menores, o que é uma consideração importante para estudos iniciais de prova de conceito. A falta de dispositivos de liberação intratraqueal universalmente disponíveis tem dificultado seu potencial de uso, limitando a disponibilidade e levando a diferenças interlaboratoriais14. Neste estudo, propomos um dosador simples, barato e descartável para entrega intratraqueal que pode ser utilizado para estudos murinos de prova de conceito no desenvolvimento de aerossóis de pó seco.
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com a Lei de Bem-Estar Animal e a Política de Serviços de Saúde Pública sobre Cuidados Humanizados e Uso de Animais de Laboratório. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Tennessee. Camundongos BALB/c fêmeas saudáveis, ~6-8 semanas de idade, receberam o conteúdo de pó seco de um dosador por aerossol intrapulmonar para um estudo farmacocinético usando pós secos de spectinamida 15999. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação do dosador e dos componentes de enchimento
- Corte a porção plástica luer de uma agulha de aço inoxidável rombo de 2,54 cm (1 polegada) (21-25 G) usando uma serra de seccionamento de precisão (ver Tabela de Materiais) ou uma lixadeira de correia até 2-3 mm dos restos plásticos (Figura 1A e Figura 2A).
NOTA: Se for utilizada uma lixadeira de correia, a agulha de aço inoxidável poderá ter de ser limpa utilizando uma agulha ou fio mais pequeno para remover as possíveis obstruções criadas. - Cortar a ponta (1-1,5 cm) de um tubo de centrífuga cônico de 0,6 mL. Encha a ponta do tubo com 30-35 mg de pó.
NOTA: Consulte Resultados Representativos para obter os detalhes dos pós de exemplo usados para o presente estudo. O desempenho do aerossol em pó deve ser avaliado antes do uso nesta aplicação seguindo a metodologia padrão, conforme descrito no Capítulo Geral da USP <601> (consulte a Tabela de Materiais). - Se armazenar e/ou transportar o pó, utilize a tampa do tubo (cortada) para fechar o frasco para injetáveis. Selagem com filme de parafina para minimizar a exposição do pó à umidade ambiente se estiver armazenando e/ou transportando.
2. Carregamento e montagem de dosadores
- Tampar a agulha de aço inoxidável aparada no leito de pó na ponta do tubo da centrífuga cônica de 0,6 mL quantas vezes forem necessárias para atingir a dose desejada (Figura 2B). Limpe suavemente as laterais da agulha de aço inoxidável com um limpador de fiapos baixo para remover qualquer excesso de pó (Figura 3).
- Insira delicadamente a agulha de aço inoxidável carregada em uma agulha de polipropileno de 3,81 cm (1,5 polegadas) ou politetrafluoretileno (PTFE) de 5,08 cm (2 polegadas) (16-20 G) (ver Tabela de Materiais) para evitar o deslocamento de qualquer pó (Figura 1B, C e Figura 2C).
3. Dosadores de acionamento
- Retire uma seringa descartável para o volume desejado, que pode variar de acordo com a aplicação.
NOTA: Para administração intrapulmonar em camundongos, 0,15-0,6 mL é tipicamente apropriado 8,9. - Fixe a seringa à trava luer da agulha de polipropileno ou PTFE (Figura 2D).
- Insira a extremidade da agulha do dosador no alvo desejado. Para analisar o teor e a reprodutibilidade do pó, insira a agulha através de um septo de borracha perfurado ou filme de parafina em um frasco contendo uma pequena quantidade (por exemplo, 1-5 mL) de água e/ou solvente orgânico (por exemplo, etanol), com identidade e volume do solvente dependentes das características físicas do ingrediente farmacêutico ativo (IFA) e do método de quantificação.
- Para o nascimento em camundongos, inserir a agulha até a primeira bifurcação brônquica da traqueia de camundongos anestesiados, seguindo protocolos estabelecidos 9,15.
- Pressione a seringa com força, expelindo o pó para fora do dispositivo para o frasco de coleta (Figura 2E).
NOTA: A mesma técnica deve ser seguida para entregar o pó aos pulmões murinos. - Para analisar o conteúdo e a reprodutibilidade do frasco de coleta, utilize um método analítico apropriado para o IFA específico, como espectrofotometria UV-Visível (UV-Vis) ou cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
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Resultados
O desempenho do aerossol de vários pós secos por pulverização foi estabelecido antes do uso neste estudo. A distribuição aerodinâmica granulométrica (APSD) foi descrita pelo diâmetro aerodinâmico mediano de massa (MMAD), representando o tamanho que divide a distribuição em doisno percentil 50 (d50), e o desvio padrão geométrico (GSD), refletindo a amplitude da distribuição. A GSD é definida pela raiz quadrada do diâmetro aerodinâmico no percentil 80 dividido pela raiz quadrada do percentil 16 (d
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Discussão
Como camundongos são respiradores nasais obrigatórios, a administração via inalação passiva para estudos iniciais de prova de conceito torna a eficiência e a estimativa da dose desafiadoras, pois o pó deve passar pelo nariz e garganta de forma dependente das propriedades das partículas e da eficiência de dispersão do pó 7,8,14. O uso dos dosadores aqui desenvolvidos contorna o nariz e a garganta, com o dosador inserido ...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores agradecem o financiamento do National Institutes of Health (R01AI155922). A microscopia foi realizada no Chapel Hill Analytical and Nanofabrication Laboratory (CHANL), membro da North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network, RTNN, que é apoiada pela National Science Foundation, Grant ECCS-1542015, como parte da National Nanotechnology Coordinated Infrastructure, NNCI.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de microcentrífuga de 0,6 mL | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Balança analítica | Mettler Toledo | AR1140 | Qualquer balança analítica com alcance suficiente pode ser usada |
| Agulha de aço inoxidável sem corte, 1 polegada, 21 G | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Agulha de aço inoxidável sem corte, 1 polegada, 22 G | McMaster-Carr | 75165A683 | |
| Agulha de aço inoxidável sem corte, 1 polegada, 25 G | McMaster-Carr | 75165A687 | |
| Seringa descartável com trava luer (1 mL) | Seringas Fisher Scientific | 14-823-30 | de 3 mL também podem ser usadas |
| Camundongos BALB/c fêmeas | Charles River, Wilmington, MA, EUA | ||
| Impactador em cascata de alto desempenho | Aparelho de Impacto de Próxima Geração | 5 | |
| Filme de laboratório (por exemplo, Parafilm) | Fisher Scientific | S37440 | |
| Limpador de baixo fiapo (por exemplo, Kimwipes) | Kimberly-Clark Professional | 34133 | |
| Inalador de pó seco de baixa resistência | RS01 mod 7 | ||
| Agulha de polipropileno, 1,5 polegadas, 16 G | McMaster-Carr | 6934A111 | |
| Agulha de polipropileno, 1,5 polegadas, 18 G | McMaster-Carr | 6934A53 | |
| Agulha de polipropileno, 1,5 polegadas, 20 G | McMaster-Carr | 6934A55 | |
| Serra de corte de precisão | TedPella | 812-300 | A lixadeira de cinta pode ser usada como alternativa |
| Agulha de PTFE, 2 polegadas, 20 G | McMaster-Carr | 75175A694 | |
| Capítulo Geral da USP < 601> | http://www.uspbpep.com/usp31/v31261/usp31nf26s1_c601.asp |
Referências
- Wu, X., Li, X., Mansour, H. M. Surface analytical techniques in solid-state particle characterization for predicting performance in dry powder inhalers. KONA Powder and Particle Journal. 28, 3-18 (2010).
- Maloney, S. E., Mecham, J. B., Hickey, A. J. Performance testing for dry powder inhaler products: towards clinical relevance. KONA Powder and Particle Journal. 40, 172-185 (2023).
- Maloney, S. E., et al. Spray dried tigecycline dry powder aerosols for the treatment of nontuberculous mycobacterial pulmonary infections. Tuberculosis. 139, 102306(2023).
- Kaur, J., et al. A hand-held apparatus for "nose-only" exposure of mice to inhalable microparticles as a dry powder inhalation targeting lung and airway macrophages. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 34 (1), 56-65 (2008).
- Yi, J., et al. Whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposures. Journal of Visualized Experiments. (75), e50263(2013).
- Chung, Y. H., Han, J. H., Lee, Y. -H. A study on subchronic inhalation toxicology of 1-chloropropane. Toxicological Research. 31 (4), 393-402 (2015).
- Kuehl, P. J., et al. Regional particle size dependent deposition of inhaled aerosols in rats and mice. Inhalation Toxicology. 24 (1), 27-35 (2012).
- Manser, M., et al. Design considerations for intratracheal delivery devices to achieve proof-of-concept dry powder biopharmaceutical delivery in mice. Pharmaceutical Research. 40, 1165-1176 (2023).
- Stewart, I. E., et al. Development and characterization of a dry powder formulation for anti-tuberculosis drug spectinamide 1599. Pharmaceutical Research. 36 (9), 136(2019).
- Durham, P. G., et al. Disposable dosators for pulmonary insufflation of therapeutic agents to small animals. Journal of Visualized Experiments. (121), e55356(2017).
- Miwata, K., et al. Intratracheal administration of siRNA dry powder targeting vascular endothelial growth factor inhibits lung tumor growth in mice. Molecular Therapy: Nucleic Acids. 12, 698-706 (2018).
- Duret, C., et al. Pharmacokinetic evaulation in mice of amorphous itraconazole-based dry powder formulations for inhalation with high bioavailability and extended lung retention. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 46-54 (2014).
- Maloney, S. E., et al. Preparation strategies of the anti-mycobacterial drug bedaquiline for intrapulmonary routes of administration. Pharmaceuticals. 16 (5), 729(2023).
- Price, D. N., Kunda, N. K., Muttil, P. Challenges associated with the pulmonary delivery of therapeutic dry powders for preclinical testing. KONA Powder and Particle Journal. 36, 129-144 (2019).
- Qiu, Y., Liao, Q., Chow, M. Y. T., Lam, J. K. W. Intratracheal administration of dry powder formulation in mice. Journal of Visualized Experiments. (161), e61469(2020).
- Fiegel, J., et al. Preparation and in vivo evaluation of a dry powder for inhalation of capreomycin. Pharmaceutical Research. 25 (4), 805-811 (2008).
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Reimpressões e permissões
