Artigo de método

Um sistema de perfusão normotérmica de código aberto projetado para cientistas pesquisadores

DOI:

10.3791/68722

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18 de julho de 2025

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1Surgical Oncology Program, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 3Radiology and Imaging Sciences, Department of Interventional Radiology, National Institutes of Health, 4Histopathology and Autopsy Pathology, Laboratory of Pathology, National Institutes of Health, 5Division of Cancer Treatment and Diagnosis, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 6Department of Perioperative Medicine, National Institutes of Health, 7Blood Services Section, Department of Transfusion Medicine, National Institutes of Health, 8Translational Hepatology Section, Liver Disease Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, 9Center for Immuno-Oncology, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para um sistema de perfusão ex vivo normotérmico modificável e de código aberto, projetado para superar o alto custo e a flexibilidade limitada das plataformas existentes, permitindo um uso mais acessível, econômico e iterativo na pesquisa biomédica pré-clínica.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A integração de máquinas de perfusão ex vivo para órgãos humanos antes do transplante melhorou os resultados para os receptores e aumentou a disponibilidade de órgãos, ao mesmo tempo em que revelou novos caminhos de investigação para a medicina translacional. No entanto, essas máquinas têm disponibilidade limitada para modificações experimentais, ao mesmo tempo em que apresentam um investimento inicial significativo e um custo proibitivo por uso para o cientista pesquisador. Além disso, há uma necessidade significativa de modelos pré-clínicos aprimorados na pesquisa biomédica que permitam o interrogatório autêntico dos processos celulares no ambiente de órgãos multicelulares.

Para fornecer acesso a tecnologia semelhante para a comunidade de pesquisa em geral, construímos uma máquina de perfusão normotérmica modular de baixo custo inteiramente a partir de peças de fácil origem executadas com código Python modificável pelo usuário. Como o sistema é desprovido de hardware personalizado, os investigadores podem construir e aumentar o sistema conforme necessário para aplicações de pesquisa individualizadas.

Aqui, descrevemos a configuração da máquina e o processo de perfusão em detalhes, transmitimos nossa experiência com órgãos suínos e humanos e fornecemos resultados experimentais iniciais de prova de conceito. Esses estudos demonstram o potencial de interrogar a fisiopatologia e processos celulares complexos usando tecido humano intacto.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embora a perfusão normotérmica de curta duração (<12 h) tenha sido empregada anteriormente para rins e fígados antes do transplante 1,2,3,4,5, a perfusão hepática normotérmica ex vivo prolongada tornou-se uma realidade em 2020 com a máquina Liver4Life6. A intenção dessa tecnologia era voltada para a expansão de órgãos de doadores viáveis, mas as possíveis aplicações translacionais eram prontamente aparentes para a comunidade de pesquisa 7,8,9,10,11,12. Para cientistas de bancada e laboratórios de pesquisa convencionais, essas ferramentas clínicas estão quase certamente fora de alcance devido aos custos iniciais e recorrentes significativos12,13. As máquinas de perfusão normotérmica clínica custam mais de US$ 250.000, com descartáveis de uso único variando de US$ 9.500 a US$ 60.000 por execução 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Além disso, os direitos de propriedade e a incapacidade de adaptar a tecnologia existente tornam as aplicações científicas desafiadoras.

A necessidade destacada de modelos pré-clínicos aprimorados 24,25,26 na pesquisa biomédica, juntamente com as limitações acima mencionadas, inspirou a criação de um sistema de perfusão modificável e de código aberto (Figura 1). O projeto e o desenvolvimento do circuito foram guiados pelos princípios de utilização de custos, requisitos de espaço de laboratório e mobilidade para aplicações translacionais. O sistema pode ser construído por US$ 48.000 a US$ 66.000, e cada custo de perfusão varia de US$ 1.000 a US$ 2.300, o que foi alcançado por meio da integração de componentes individuais de fácil origem executados por código para download gratuito. O sistema foi otimizado por meio de um processo iterativo que utiliza sangue suíno de doador e sangue humano vencido, fígados suínos e segmentos parciais de fígado humano da sala de cirurgia (Tabela Suplementar 1, Tabela Suplementar 2 e Tabela Suplementar 3). Os órgãos são alojados em uma bacia fechada que posiciona a amostra de maneira ideal para minimizar a necrose por pressão, permitir a trajetória ideal da canulação, drenar o escoamento e garantir a normotermia. O reservatório abriga aproximadamente 2-3 L de perfusato antes de ser direcionado para os circuitos de entrada. A hemodiálise, que é crítica para a homeostase eletrolítica e hemoconcentração nas perfusões hepáticas 6,27,28,29, foi integrada por meio de um circuito lateral com uma bomba de rolo independente. As infusões farmacológicas apoiam funções fisiológicas (por exemplo, nutrição parenteral total (NPT), sais biliares, etc.30), aumentam o tônus vascular (epoprostenol, fenilefrina), previnem a coagulação (enoxaparina) e a infecção (piperacilina-tazobactam, anfotericina). Os parâmetros de perfusão fisiológica são garantidos usando sensores em linha em tempo real para obter valores de gasometria, pressão e fluxo. O sistema permite a máxima adaptabilidade do usuário, de modo que a integração de componentes de hardware possa ocorrer em qualquer ponto do circuito. Além disso, cada um dos componentes individuais dentro do circuito pode ser trocado ou modificado para permitir a adaptação a questões específicas de pesquisa e necessidades experimentais. Por exemplo, o circuito de entrada dupla pode ser alterado para perfusão de órgãos com um único influxo (ou seja, rins ou pâncreas) simplesmente removendo o conector Y antes das cabeças da bomba, e claves para infusão / amostragem podem ser instaladas em qualquer ponto dentro do circuito. Além disso, o sistema é executado com código Python que permite perfusão semiautomatizada com base em um conjunto especificado de parâmetros de perfusão ditados pelo usuário final (Figura Suplementar 1). Por exemplo, os sensores adquirem leituras contínuas de gases sanguíneos arteriais (ABG), pressão e fluxo que atuam como entrada para implementar comandos de saída para ajustar automaticamente o fluxo de gás do oxigenador, a velocidade da bomba, etc. A interface gráfica do usuário (GUI) permite a substituição manual dessa automação, se desejado. A personalização do circuito é sua marca registrada e amplia a aplicabilidade geral desse sistema para uma ampla gama de investigações experimentais.

O acesso ao sistema em sua totalidade está disponível gratuitamente (https://github.com/CCR-SOP/OpenSourcePerfusionSystem.git) para incentivar a colaboração e a inovação em um esforço para forjar novas profundidades de conhecimento em vários campos da ciência translacional.

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Figura 1: Sistema de perfusão de código aberto. (A) Esquema do sistema de perfusão de código aberto para configuração de fluxo duplo para perfusão hepática. (B) Renderização tridimensional (3D) do sistema durante a perfusão de órgãos com integração de software, conforme demonstrado nas telas. (C) Foto da máquina de perfusão durante o experimento de perfusão suína. A configuração exposta na figura é apenas para fins demonstrativos. Durante a perfusão, a cortina de aquecimento estéril cobre o órgão para manter um invólucro estéril. Sensor P/F: Sensores de pressão e fluxo. HA: Artéria hepática. VP: Veia porta. HV: Veia hepática. BD: Ducto biliar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo foi conduzido de acordo com os padrões éticos do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos de nossa instituição e segue todas as diretrizes e regulamentos aplicáveis para pesquisas envolvendo seres humanos e tecidos.

1. Configuração da máquina

  1. Preparação da tabela
    1. Esterilize a mesa e o carrinho móvel com spray de álcool 70% e limpe bem. Coloque o carrinho móvel perpendicular ao lado esquerdo da mesa. Antes da conexão de todos os tubos e ferragens em todo o protocolo, borrife com álcool 70% ou autoclave, se aplicável, para esterilizar.
      NOTA: Antes de qualquer manuseio ou intervenção de órgãos, use luvas estéreis e spray de álcool para facilitar a esterilidade antes e durante a perfusão.
    2. Cubra a estação de trabalho com cortinas azuis estéreis e, em seguida, almofadas absorventes.
    3. Prenda o suporte do reservatório à perna do carrinho mais próxima da bancada com o anel projetando-se para fora, aproximadamente 12" abaixo da parte inferior da parte superior da estação de trabalho.
    4. Coloque o funil de tambor no lado direito da estação de trabalho com um bico pendurado na borda frontal da mesa. Corte a espuma viscoelástica circular para preencher a base do tambor, permitindo um espaço de 4" para saída perto do bico. Coloque o diafragma embaixo da espuma conectada a um respirador.
    5. Obtenha 2 mantas de aquecimento de água e coloque-as em cima da inserção de espuma com tubo conector orientado para o canto superior esquerdo da manta. Corte as braçadeiras brancas do tubo e insira uma farpa Luer macho de 3/16" em cada tubo. Prenda 1 linha de entrada e 1 linha de saída das linhas do tanque de aquecimento de água Y'ed para cada cobertor.
    6. Obtenha uma cortina mais quente estéril e identifique o quadrado azul central. Dobre ao meio duas vezes e corte 2 mm do canto da dobra para criar um orifício de saída. Coloque a cortina estéril em cima do tambor para que o orifício cortado fique alinhado com o bico de saída.
    7. Obtenha o conector de saída impresso em 3D e coloque o ímã na ranhura. Coloque sob a cortina através do bico de saída e alinhe o orifício cortado com o orifício no conector e no ímã. Coloque um segundo ímã alinhado com o fluxo de saída para prender a cortina.
    8. Levante o excesso de cortina para cobrir todo o funil do tambor e prenda com elástico/elásticos. Dobre o excesso de cortina por cima para criar uma barreira estéril. Recoloque a segunda camisa de água em cima da cortina dobrada.
    9. Corte um pedaço de ~ 30 "de tubo de 1/4" e prenda o aspecto proximal à peça de saída do fundo do bico do funil do tambor e o aspecto distal a uma farpa de entrada do reservatório.
  2. Preparação da bomba e do oxigenador
    1. Coloque as bombas no carrinho móvel mais próximo da borda da estação de trabalho com suporte e dois clamps imediatamente atrás das bombas para que clamps ficam 6" acima das bombas.
    2. Obtenha 2 cabeças de bomba e prenda nas bombas.
    3. Obtenha 2 oxigenadores e coloque dentro de grampos fixados em suportes em uma configuração horizontal. Oriente os oxigenadores com a farpa voltada para fora e a farpa lateral apontando para a direita.
      NOTA: Os oxigenadores com conectores Luer requerem uma configuração alternativa com a etiqueta voltada para fora e os pinos internos voltados para cima.
  3. Preparação do misturador de gás
    1. Corte dois (2) pedaços de 4' de tubo de 1/8" e insira um Luer macho de 1/8" nas extremidades de cada tubo. Conecte um tubo a cada entrada de gás arterial e venoso.
    2. Corte dois (2) pedaços de 2" de tubo de 1/4" e prenda um Luer fêmea de 1/4" em uma extremidade. Encaixe cada uma dessas peças de tubulação nas farpas superiores direitas de cada oxigenador.
    3. Conecte a tubulação de entrada de gás arterial e venosa de 1/8" ao conector Luer superior direito de seus respectivos oxigenadores.
  4. Preparação do circuito de hemodiálise
    1. Remova todos os tubos do kit de hemodiálise, exceto aqueles que levam diretamente ao filtro (linhas azul, vermelha, verde e amarela). Prenda o filtro no pegboard na parte traseira da estação de trabalho, ~12" à direita das bombas, ou alinhado com o reservatório.
    2. Coloque 1 bomba de rolo grande imediatamente à direita do filtro para entrada de sangue. Coloque 2 bombas peristálticas menores à direita da bomba do rolo de sangue.
      1. Obtenha dois (2) tubos peristálticos de 1/8e coloque dentro da bomba branca clamp. Prenda duas (2) farpas Luer fêmeas de 1/8em cada extremidade de cada tubo.
    3. Pendure um saco de 5 L de dialisado na face lateral direita da estação de trabalho.
      1. Conecte a bolsa de dialisato à entrada do filtro de hemodiálise conectando 1/8de tubo ao conector Luer da bolsa. Conecte o Luer macho 1/8 à extremidade desta tubulação e conecte-o à tubulação da bomba peristáltica de entrada.
    4. Entrada/saída de dialisato: Obtenha 3 1/8de tubo com cada extremidade equipada com um Luer macho de 1/8de º.
      1. Fluxo de entrada: Conecte a extremidade proximal ao aspecto distal da tubulação da bomba e a extremidade distal à tubulação de entrada amarela (com 1/8 de Luer fêmea) ao filtro de hemodiálise.
      2. Saída: Conecte a extremidade proximal à tubulação de saída verde (com 1/8 de Luer fêmea) e a extremidade distal à tubulação da bomba peristáltica de saída. Conecte o tubo de 1/8 ao aspecto distal da bomba peristáltica e drene-o para o saco de resíduos por meio de conectores Luer.
  5. Criação de circuito proximal
    1. Coloque o reservatório dentro do suporte do reservatório com números externos e conector com tampa amarela voltado para fora.
    2. Corte ~ 36 "de tubulação de 5/16" e conecte a extremidade proximal ao piquete de saída no fundo do reservatório. Conecte o conector Y de 5/16" à extremidade distal desta tubulação.
    3. Corte dois (2) comprimentos de 4" do tubo de 5/16" e conecte-os à extremidade do conector Y. Prenda cada uma das extremidades desses tubos de 4" no pino horizontal de cada uma das cabeças da bomba.
    4. Corte dois (2) comprimentos de 4" de tubo de 1/4" e conecte 1 a cada uma das farpas verticais dos cabeçotes da bomba. Conecte o aspecto distal ao pino inferior esquerdo de cada oxigenador.
    5. Corte dois (2) comprimentos de 2" de tubo de 1/4" e conecte um Luer fêmea a uma extremidade. Adicione uma tampa Luer macho e prenda-a no pino inferior direito de cada oxigenador.
  6. Criação de circuito venoso
    1. Corte um (1) tubo de 30" de comprimento de 5/16" e prenda a extremidade proximal à farpa de saída (direita) do oxigenador venoso. Corte ao meio e coloque um conector Y de 5/16" sobre a extremidade do corte distal. Reconecte a outra metade à farpa superior do conector Y.
    2. Lado sampCircuito de amostragem: Corte um (1) pedaço de tubo de 2" de 1/4" e estique a extremidade proximal usando uma chave de agulha. Conecte isso à outra farpa do conector Y de 5/16".
      1. Obtenha um sensor de cubeta. Conecte o lado farpado ao tubo de 2" conectado ao conector Y. Corte 1-2" da tubulação da cubeta distal e conecte ao Luer macho de 1/4". Conecte à extremidade proximal do sensor de derivação uma vez calibrado e, no aspecto distal, conecte o Luer macho de 1/8" ao tubo de 1/8".
      2. Conecte o aspecto horizontal do conector T fêmea à tubulação de 1/8" e Luer macho. Ao aspecto perpendicular, conecte uma clave de amostragem. Conecte uma Luer macho de 1/8" ao aspecto horizontal restante do conector T.
      3. Corte 12" de tubo de 1/8", conecte a extremidade proximal à clave de amostragem e conecte um Luer macho de 1/8" à extremidade distal. Conecte-o a outro conector T fêmea. Em um lado do conector T fêmea, conecte um Luer macho de 1/4" e conecte a um canal de entrada usando 2" de tubulação de 1/4".
    3. Retorne à extremidade distal da tubulação de 5/16" e conecte outro conector Y de 5/16". Obtenha ~ 55 "de tubo de 1/4" e conecte à extremidade superior do conector Y de 5/16 ".
    4. Criação do circuito sanguíneo de hemodiálise: Conecte um Luer macho de 1/4" à extremidade distal do tubo de 1/4". Coloque a tubulação através da bomba de rolo grande. Conecte ao fluxo de sangue na parte superior do filtro de hemodiálise (tubo revestido de azul).
      1. Corte um (1) pedaço de tubo de 1/4" de 24" e conecte um Luer macho de 1/4" ao aspecto proximal. Conecte este tubo ao filtro de hemodiálise de saída de sangue (tubo revestido de vermelho). Conecte o aspecto distal a uma farpa de entrada do reservatório.
    5. Retorne para completar o circuito de entrada venosa que leva à amostra. Corte um (1) pedaço de tubo de 36" de 1/4" e estique-o para encaixar na farpa do conector Y de 5/16".
    6. Local de infusão do medicamento: Obtenha 3 torneiras de quatro vias e conecte linearmente. Conecte esta peça ao braço perpendicular de um conector T fêmea. Nos braços em linha do conector T fêmea, conecte dois Luers machos de 1/4". Insira a peça a 12" do lado esquerdo da tubulação.
    7. Conecte os sensores de fluxo externo no tubo de 1/4" após o local de infusão do medicamento. Obtenha 1 montagem de 9" e prenda no nível do funil do tambor. Faça um corte de 2" distal ao final dos sensores de fluxo e insira os sensores de pressão com farpas na tubulação de 1/4". Coloque o aspecto distal da tubulação no centro do funil do tambor. Reserve um (1) Luer macho de 1/4" para canulação venosa na amostra.
  7. Criação de circuito arterial
    1. Corte outro pedaço de ~ 30 "de tubo de 5/16" e prenda a extremidade proximal da farpa de saída direita do oxigenador arterial. Corte este tubo aproximadamente na metade e conecte um conector Y de 1 5/16".
    2. Lado sampcircuito de amostragem: Crie um lado duplicado sampcircuito conforme descrito na etapa 1.6.2 e conecte-o ao aspecto inferior do conector Y, omitindo a cubeta. Quando concluído, conecte o Luer de saída de 1/8" ao conector T.
    3. Corte um (1) pedaço de tubo de 36" de 1/4" e encaixe-o na farpa do conector Y de 5/16".
    4. Repita a etapa 1.6.7. Reserve um (1) Luer macho de 1/4" para canulação arterial na amostra.
  8. Criação de fluxo de saída venosa
    1. Corte ~ 30 "de tubo de 1/4" e prenda 1 Luer macho de 1/4 "na extremidade proximal para prender à saída da veia cava inferior (IVC) da amostra. Fixe a extremidade distal a uma das farpas de entrada do reservatório.
    2. Corte este tubo ~ 6 "do reservatório e conecte 2 1/4" Luers macho a cada extremidade. Insira um T fêmea com uma clave presa ao aspecto perpendicular para amostragem.
  9. Introduza perfusato no circuito conforme descrito na etapa 4. Reaqueça e conecte a amostra conforme descrito na etapa 6.1.4. ou etapa 6.2.4. e iniciar a perfusão.

2. Calibração do sensor CDI

  1. Certifique-se de que as garrafas de gás do calibrador estejam cheias e instaladas de acordo com o manual de operação do usuário e que o monitor esteja configurado para o modo de calibração. Calibre de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Desconecte o aparelho sensor-cabo-cabeçote do monitor assim que a calibração estiver concluída e integre-o imediatamente nos respectivos circuitos venosos e arteriais laterais. As conexões Luer são criadas nas etapas 1.6.2 e 1.7.2.

3. Iniciação do código

  1. Baixe, instale e abra o código Python encontrado no repositório GitHub. Garanta a instalação adequada do software Python e PyCharm.
  2. Crie um ramo exclusivo para cada corrida de perfusão para registro preciso de dados. Uma vez iniciada, uma GUI será exibida com duas janelas. Oriente uma janela por monitor para facilitar o controle do hardware e a exibição dos parâmetros de perfusão.
  3. Ajuste os parâmetros de perfusão manualmente ou automatize a perfusão através dos respectivos botões exibidos na GUI (Figura Suplementar 1).

4. Criação de perfusato e preparação do sistema

  1. Prepare o circuito aproximadamente 2 h antes da perfusão do órgão para permitir a correção de distúrbios metabólicos/eletrolíticos, aquecimento para normotermia e administração de anticoagulação, antibióticos e outros produtos farmacêuticos.
  2. Perfusato suíno
    1. Obtenha 2 L de sangue suíno total do tipo OO e introduza-o no reservatório drenando através de uma seringa aberta de 50-100 mL. Pegue aproximadamente 1 mL de sangue total e meça o pH basal, eletrólitos e hematócrito em uma máquina de ponto de atendimento.
    2. Administre alíquotas de bicarbonato de sódio a 8,4% conforme necessário para neutralizar a acidez devido aos conservantes do sangue frio. Inicie a hemodiálise para normalizar a hipercalemia e a acidemia láctica conforme necessário e titule a concentração de hematócrito desejada. Ajuste o fluxo de gás para titular os níveis fisiológicos de pO2 e pCO2.
    3. Administrar produtos farmacêuticos conforme descrito abaixo (seção 5).
    4. Preserve 1-2 L de sangue total tipo OO para bolus intermitentes, conforme necessário, para manter o hematócrito em ~ 30-40% durante todo o experimento de perfusão.
  3. Perfusado humano
    1. Obtenha hemoderivados compatíveis de um banco de sangue (quase vencidos ou doados para fins de pesquisa).
      NOTA: Aproximadamente 4 unidades de concentrado de glóbulos vermelhos (RBCs) e plasma são necessários para cada experimento de perfusão.
    2. Lave os glóbulos vermelhos para remover conservantes e normalizar os distúrbios eletrolíticos do pellet de hemácias antes do primer. Lave as hemácias duas vezes.
      1. Lavagem de hemácias: Coloque pRBC e 0,9% de NaCl na proporção de 1:1 em um tubo de centrífuga. Centrifugue a 1300 × g por 15 min. Remova o sobrenadante com uma pipeta e readministre NaCl fresco a 0,9% na proporção de 1:1 para o pellet de hemácias. Centrifugue novamente como acima e remova o 2º sobrenadante para o pellet final lavado de hemácias.
    3. Introduza grânulos de hemácias lavados no reservatório usando uma seringa aberta de 50-100 mL. Coloque 4 unidades de plasma no reservatório e comece a circulação.
    4. Inicie a diálise, o aquecimento de cobertores e o influxo de gás assim que o perfusato estiver circulando.
    5. Amostra de perfusato e aplique intervenções farmacológicas conforme necessário para garantir níveis de perfusato quase fisiológicos quanto possível antes da perfusão do órgão.
    6. Lave e introduza pellets de pRBC lavados adicionais e titule o status do volume por meio de hemodiálise, conforme necessário, para manter os níveis de hematócrito de 30-40%.

5. Intervenção farmacológica e preparação para perfusão

  1. Administração de antibióticos e antifúngicos
    1. Combine dois frascos para injetáveis de 2,5 g de piperacilina/tazobactam num copo de amostra estéril com 40 ml de solução salina estéril. Adicione 10 mL ao reservatório como um "antibiótico prime".
      1. Diluir a mistura restante com 60 mL de solução salina estéril e dividir entre duas seringas de 50 mL. Conecte uma seringa a uma bomba de seringa e programe para fornecer continuamente 41 μL/min ao local de infusão do medicamento na veia porta (etapa 1.6.6).
      2. Conservar o antibiótico restante num frigorífico a 4 °C.
    2. Reconstitua um frasco para injetáveis de 50 mg de anfotericina com 10 ml de água estéril.
      1. Retire 1 mL de anfotericina concentrada e combine-a com 9 mL de solução salina estéril. Administre a mistura de 10 mL no reservatório para servir como um "primo antifúngico" no início da perfusão.
      2. Administrar 1 mL de anfotericina concentrada a cada 12 h no reservatório.
  2. Anticoagulação
    1. Combine 1 mL (100 mg) de enoxaparina com 49 mL de solução salina estéril. Administre uma mistura de 5 mL por litro de perfusato no início da perfusão para um "primo de anticoagulação".
      1. Conservar a restante solução de enoxaparina num frigorífico a 4 °C.
      2. Administrar a solução de enoxaparina (5 ml/1 L de perfusato) de 12 em 12 h ao reservatório.
  3. Esteróides
    1. Reconstitua 1 g de metilprednisolona com 20 mL de água estéril.
    2. Prepare o sistema de acordo com as especificações de dosagem antes do início da perfusão: Os fígados suínos recebem 10 mL (500 mg) de metilprednisolona. Fígados humanos parciais recebem 2 mL (100 mg) de solumedrol.
    3. Dilua a mistura restante com 40 mL de solução salina em uma seringa de 50 mL e coloque-a em uma bomba de seringa para fornecer continuamente 33 μL / min ao local de infusão do medicamento na veia porta (etapa 1.6.6).
  4. Nutrição parenteral e sais biliares
    1. Reconstitua 1,7 g de ácido taurocólico com 50 mL de aminoácido a 10% + componente de nutrição parenteral concentrado eletrolítico de TPN (não misturado com dextrose) em um copo de amostra estéril. Retire para uma seringa de 50 mL e coloque em uma bomba de seringa para fornecer continuamente 83 μL / min ao local de infusão do medicamento na veia porta (etapa 1.6.6).
  5. Controle do tônus vascular
    1. Vasodilatação: Reconstitua 0,5 mg de epoprostenol com 50 mL de solução salina estéril em um copo estéril e coloque em uma seringa de 50 mL. Coloque-o em uma bomba de seringa e conecte-o à clave proximal ao sensor de fluxo da artéria hepática.
      1. Bolus ou infusão contínua (10 μL/min) conforme necessário para atingir a pressão arterial média desejada e/ou para neutralizar o vasoespasmo.
    2. Vasoconstrição: Dilua 5 mL (50 mg) de fenilefrina com 45 mL de solução salina estéril em um copo estéril e coloque em uma seringa de 50 mL. Armazene a mistura na geladeira a 4 ° C e bolus conforme necessário para manter a pressão arterial média desejada.
      NOTA: Isso raramente é necessário e a reconstituição pode ser omitida e implementada apenas quando necessário.
  6. Calibração do sensor de pressão e fluxo
    1. Calibração de pressão: Calibre os sensores de pressão sem perfusato fluindo. Rezere os sensores se a leitura de pressão diferente de zero for exibida de acordo com as instruções do fabricante enquanto a extremidade da tubulação estiver aberta ao ar por uma pressão de 0 mmHg. Garanta medições de pressão adequadas obstruindo suavemente as extremidades proximal e distal da tubulação para produzir pressões elevadas.
    2. Calibração de fluxo: Calibre assim que o circuito estiver circulando perfusato antes da perfusão do órgão para garantir uma medição precisa. Prenda a tubulação distal aos sensores de fluxo para cortar o fluxo. Zere novamente os sensores de fluxo se a taxa de fluxo diferente de zero for exibida de acordo com as instruções do fabricante. Solte a tubulação para permitir a medição de vazão e de vazão precisa.

6. Colheita hepática

  1. Aquisição de suínos
    NOTA: Os fígados suínos são adquiridos em um açougue local em conformidade com os protocolos de manuseio humano de gado do USDA. A dissecção é orientada pela equipe de pesquisa para incluir veia cava infra e supra-hepática e ducto biliar.
    1. Esterilize o fígado com iodo diluído em solução salina estéril e coloque-o em uma bacia estéril sobre gelo. Identifique a veia porta, a artéria hepática, a veia cava superior e o ducto colédoco, canule e prenda com laços de seda 4-0.
      NOTA: O ducto biliar é frequentemente canulado com um angiocateter fenestrado devido ao seu pequeno diâmetro e para prevenir a obstrução biliar de sistemas biliares suínos variantes.
    2. Lave a veia porta canulada e a artéria hepática com 3 L de solução salina estéril fria (2 L PV:1 L HA) seguida de 1 L de solução fria de preservação de órgãos (750 mL PV:250 mL HA). Mergulhe o fígado na solução fria de preservação de órgãos com gelo para transporte.
    3. Prepare o sistema conforme descrito acima (etapa 4.1) até que os parâmetros fisiológicos sejam atendidos.
    4. Mergulhe o fígado canulado em solução salina estéril aquecida para reaquecimento rápido e remoção de quaisquer êmbolos aéreos. Conecte o tubo de entrada apropriado à veia porta e às cânulas da artéria hepática. Titule a velocidade da bomba para valores fisiológicos de fluxo e pressão.
    5. Conecte a cânula de veia cava à tubulação de saída para facilitar a saída para o reservatório para completar o circuito.
    6. Drene a vesícula biliar residual da bile antes de conectar o tubo da seringa à cânula do ducto biliar e a um frasco cônico para coleta.
  2. Aquisição humana
    1. Prepare o sistema conforme descrito acima (etapa 4.1).
    2. Obtenha amostras humanas após ressecções oncológicas padrão indicadas. Meça as taxas de fluxo in vivo por ultrassom intraoperatório para calibração no sistema ex vivo . Identifique a veia porta segmentar, a artéria hepática e o ducto biliar durante a dissecção cirúrgica. Aplique a tríade de acordo com a técnica cirúrgica padrão e entregue a amostra do campo cirúrgico à mesa traseira estéril.
    3. Identifique e canule a veia porta segmentar, a artéria hepática, a veia hepática e o ducto biliar, fixe com laços de seda 4-0 ou sutura de prolene.
      NOTA: Omita a canulação de saída se o segmento não tiver uma veia de saída dominante para evitar hepatopatia congestiva. A saída da bacia funciona como a tubulação de saída da veia hepática / VCI.
    4. Retorne ao laboratório ex vivo e pese a amostra. Mergulhe a amostra em solução salina estéril aquecida e conecte a respectiva tubulação de entrada/saída. Conecte a cânula do ducto biliar ao tubo da seringa para drenagem para o frasco cônico.
    5. Inicie a perfusão e titule o fluxo da bomba para os parâmetros desejados de fluxo e perfusão de pressão.

7. Titulação dos parâmetros de perfusão

  1. Amostra de perfusato de claves pré-hepáticas (circuitos laterais HA e PV) e pós-hepáticas (IVC ou fluxo de saída da bacia) em vários pontos de tempo para titulação de parâmetros de perfusão com base nos valores de gasometria, eletrólitos e hematócrito e hemoglobina no local de atendimento.
  2. Calibre os sensores CDI durante a perfusão usando as análises manuais de amostras.
  3. Ajuste o fluxo de entrada e saída de hemodiálise de acordo para manter o status do volume e a concentração de hematócrito de 30-40% e corrigir quaisquer distúrbios metabólicos e eletrolíticos.
  4. Dose manualmente alíquotas de dextrose a 5%, água livre, bicarbonato de sódio a 8,4% e NaCl a 0,9% conforme necessário para corrigir anormalidades eletrolíticas.

8. Variantes do circuito de perfusão

  1. Adaptação de transporte
    1. Conecte as bombas a uma fonte de energia móvel durante a execução para facilitar a perfusão contínua a caminho da máquina de imagem. Conecte a fonte de alimentação móvel na tomada CA para carregar a bateria externa durante a perfusão.
    2. Desconecte a fonte de alimentação móvel da tomada CA da parede assim que o experimento de perfusão for concluído.
    3. Desconecte a entrada de gás nos oxigenadores. Clamp desligue o circuito lateral de hemodiálise e desconecte o fluxo de sangue para filtrar. Pare as bombas de dialisato.
    4. Remova os sensores de fluxo da tubulação de entrada. Desconecte as infusões de medicamentos e desligue as torneiras. Desconecte os sensores de pressão do plugue de entrada/saída.
    5. Mova cuidadosamente o funil do tambor e a tubulação para o carrinho móvel, que agora é uma unidade independente e pode ser transportado para o conjunto de imagens.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Corridas de suínos representativas
Fígados suínos inteiros foram obtidos de um açougueiro local para eficiência de custos e perfundidos para várias fases de otimização e teste do desenvolvimento da máquina (Tabela Suplementar 1). As primeiras 24 h de três corridas representativas do fígado são avaliadas aqui (Figura 2). A pressão arterial hepática média foi de 80 mmHg ± 11 mmHg, e a pressão venosa portal média foi de 7,1 mmHg ± 3,3 mmHg com fluxos de 107 mL/min ± 102 mL/min e 501 mL/min ± 329 mL/min, respectivamente. Os grandes desvios padrão para pressão e fluxos se correlacionam com a grande diferença no tamanho do fígado, com porcos variando de 50 libras a 350 libras. Os circuitos de entrada duplos permitem diferenciais fisiológicos de oxigênio com saturação arterial média (SO2) de 95 ± 7,4% em comparação com a média de SO2 venoso portal de 85 ± 13% (p < 0,001). O fluxo de saída do SO2 das veias hepáticas foi de 74 ± 18%, indicativo de consumo de oxigênio (p < 0,01), e as medidas de pH periférico estavam dentro das faixas fisiológicas de 7,2 ± 0,09. Parâmetros fisiológicos adicionais, como hemoglobina total (9 ± 2,5 g/dL), níveis de hematócrito (28,3 ± 6,4%), nível de glicose (477 ± 15 mg/dL) e alterações no lactato (3,0 ± 2,5 mmol) e potássio (-0,77 ± 2,3 mmol) foram monitorados durante a perfusão por amostragem em intervalos regulares. Para perfusões suínas, a produção de bile foi indicativa de viabilidade do órgão. A vesícula biliar foi drenada manualmente assim que o órgão se tornou normotérmico, e o ducto biliar comum foi conectado a um pequeno tubo para coleta. A produção total de bile durante a perfusão foi de 41 ± 6,9 mL total, com uma taxa de 6,9 ± 4,0 mL / h.

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Figura 2: Métricas de perfusato durante a perfusão hepática suína (n = 3). (A) Taxas médias de influxo sanguíneo (mL / min) da artéria hepática e veia porta ao longo do tempo. (B) Pressões médias de entrada de sangue (mmHg) da artéria hepática e veia porta ao longo do tempo. (C) Comparação da porcentagem de saturação deO2 de hemácias entre artéria hepática, veia porta e veia cava inferior, demonstrando diferencial de oxigênio entre entradas duplas e consumo de oxigênio na saída. Foram determinadas diferenças estatisticamente significativas entre as saturações da veia porta e arterial (p < 0,0001), as saturações da veia porta e da VCI (p < 0,01) e as saturações arterial e da VCI (p < 0,0001). (D) Avaliação do pH sanguíneo entre artéria hepática, veia porta e veia cava inferior. (E) Níveis de hematócrito (%) e hemoglobina (g/dL) (topo) ao longo da perfusão, além de alteração no PV potássio (mmol) (fundo) como marcador de hemólise. (F) Níveis de glicose do reservatório refletindo a glicose média do circuito (mg / dL) durante a perfusão. (G) Alteração no nível de lactato (mg / dL) durante a perfusão em comparação com os valores de lactato no tempo 0 no fluxo de entrada da artéria hepática, fluxo de saída da VCI e perfusato do sistema. (H) Produção biliar (mL) ao longo do tempo durante a perfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Execuções humanas representativas
Três segmentos hepáticos humanos portadores de tumor foram perfundidos, com tempo de perfusão variando de 48 a 72 h, dependendo das necessidades do experimento (Figura 3). Para comparar os dados entre as execuções representativas da aplicação, avaliamos as primeiras 48 h de valores bioquímicos. A perfusão aproximou os parâmetros in vivo com influxo venoso portal contínuo de baixa pressão e alto volume e influxo arterial pulsátil de alta pressão e baixo volume, que são exibidos em tempo real para permitir fácil titulação. Se o fígado não atingisse valores bioquímicos fisiológicos dentro de duas horas após a perfusão, o experimento era encerrado. Para perfusões hepáticas bem-sucedidas, a pressão arterial hepática média foi de 84 mmHg ± 11 mmHg, e a pressão venosa portal média foi de 9 mmHg ± 4 mmHg com fluxos de 113 mL/min ± 66 mL/min e 317 mL/min ± 302 mL/min, respectivamente. Os circuitos de entrada duplos permitem diferenciais fisiológicos de oxigênio com saturação arterial média (SO2) de 98% ± 3% em comparação com a média de SO2 venoso portal de 92% ± 7% (p < 0,0001). O SO2 do fluxo de saída das veias hepáticas foi de 86% ± 9%, indicativo de consumo de oxigênio (p < 0,0001), e as medições de pH em todo o sistema estavam dentro das faixas fisiológicas de 7,3 ± 0,09. Parâmetros fisiológicos adicionais, como hemoglobina total (10,2 g/dL ± 1,6 g/dL), níveis de hematócrito (30,2% ± 5,5%), nível de glicose (170 mg/dL ± 68 mg/dL) e alterações no lactato (3,6 mmol/L ± 2,2 mmol/L) foram monitorados durante a perfusão por amostragem em intervalos regulares. Em uma corrida representativa, uma média de 1,4 mL / h de bile foi produzida. Antes e ao término dos experimentos de perfusão, foram obtidas biópsias para análise tecidual. Cortes de tecido representativos demonstram parênquima hepático, tumor neuroendócrino metastático e adenocarcinoma colorretal metastático após perfusão.

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Figura 3: Métricas de perfusato e tecido durante a perfusão do(s) segmento(s) hepático humano(s) (n = 3). (A) Taxa média de influxo de perfusato (mL/min) para a artéria hepática e veia porta. (B) Pressão média de entrada de perfusato (mmHg) para a artéria hepática e veia porta ao longo do tempo. (C) Saturação de oxigênio dos glóbulos vermelhos (%) para a artéria hepática de entrada, veia porta de entrada e veia hepática de saída. Foram determinadas diferenças estatisticamente significativas entre as saturações da veia porta e arterial (p < 0,0001), as saturações da veia porta e da VCI (p < 0,0001) e as saturações arterial e da VCI (p < 0,0001). (D) pH do perfusato para a artéria hepática de entrada, veia porta de entrada e veia hepática de saída. (E) Métricas de glóbulos vermelhos durante a perfusão, incluindo os níveis médios de hematócrito (%) e hemoglobina (g/dL) de perfusato (superior) com alteração no perfusato de potássio (mmol) desde a linha de base ao longo do tempo (inferior). (F) Concentração média de glicose (mg/dL) para a artéria hepática de entrada, veia porta de entrada e veia hepática de saída ao longo do tempo. (G) Alteração na concentração de lactato de perfusato (mg / dL) desde a linha de base ao longo do tempo para a artéria hepática de entrada, veia hepática de saída e perfusato sistêmico. (H) Produção de bile (mL) ao longo do tempo. (I) Segmentos hepáticos humanos (Couinaud II-IV) durante (esquerda) e pós-perfusão (direita) demonstrando falta de necrose por pressão após a otimização do sistema. Área superficial de cauterização presente na parte superior da imagem esquerda devido à hemostasia intraoperatória. (J) Corte de tecido pós-perfusão demonstrando parênquima hepático (coloração de hematoxilina e eosina, 10x, inserção 40x; barra de escala 50 μM). (K) Corte de tecido pós-perfusão demonstrando tumor neuroendócrino metastático (coloração de hematoxilina e eosina, 10x, inserção 40x; barra de escala 250 μM). (L) Corte de tecido pós-perfusão demonstrando adenocarcinoma colorretal metastático (coloração de hematoxilina e eosina, 10x, inserção 40x; barra de escala 50 μM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aplicação representativa: Imagem de TC de espécime perfundido
A capacidade de integrar fontes de dados clínicos, como tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (RM) com patologia, pode promover diagnósticos e medicamentos personalizados. No entanto, os relatórios de patologia são achados resumidos, e a heterogeneidade inerente aos tumores sólidos excede em muito as capacidades humanas de delineamento. Uma solução potencial é realizar imagens ex vivo seguidas pela preparação imediata de seções de tecido em macroescala para permitir a integração radiômica de dados celulares com preservação espacial (por exemplo, transcriptômica espacial, imunofluorescência altamente multiplex). Para acomodar imagens convencionais no sistema, uma configuração móvel foi construída, incluindo bombas de transição para uma fonte de bateria externa para fornecer energia ininterrupta durante o transporte e a geração de imagens (Figura 4A). Com o fígado na mesa de TC, foi administrado contraste iodado e obtidas imagens que demonstram características radiográficas consistentes com as adquiridas in vivo (Figura 4B).

Aplicação representativa: Perfusão renal e pâncreas
Inato ao seu design, o sistema é adaptável à perfusão de órgãos adicionais (Figura 4C-F), o que evita a necessidade de influxo duplo e, assim, diminui os custos por uso. Para demonstrar, removemos o circuito venoso portal para um único influxo arterial (Figura Suplementar 2) e perfundimos um rim humano (Figura 4C) e um pâncreas parcial humano (Figura 4E). Cortes de tecido representativos após a perfusão demonstram glomérulos ( Figura 4D ) e ilhotas de Langerhans ( Figura 4F ).

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Figura 4: Aplicação representativa de máquinas de perfusão: imagens de TC e modularidade de órgãos. (A) Adaptação móvel do sistema para transporte. (B) Imagens representativas de TC do fígado com tumor após administração de contraste iodado in vivo (superior) e ex vivo após perfusão (inferior). (C) Perfusão renal humana na máquina reconfigurada para fluxo único. (D) A secção do tecido pós-perfusão demonstra glomérulos renais e ductos coletores (coloração de hematoxilina e eosina, 8x; barra de escala 250 μm). (E) Perfusão do pâncreas distal humano na máquina reconfigurada para fluxo único. (F) A secção do tecido pós-perfusão demonstra ilhotas pancreáticas (coloração de hematoxilina e eosina, 8x; barra de escala de 250 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Configurações de código Python para facilitar a perfusão semiautomatizada. Esquema que descreve os parâmetros de entrada e saída utilizados pelo código, permitindo a semiautomação com a adição de ajustes manuais comumente empregados (Tabela). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Esquema de entrada única usado para perfusão renal e pâncreas. Sensor P/F: Sensores de pressão e fluxo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 3 suplementar: Otimização dos glóbulos vermelhos. (A) O experimento de perfusão somente de sangue demonstrou significativamente menos hemólise em condições de baixa RPM em comparação com condições de alta RPM (p < 0,01) usando hemoglobina livre de plasma como substituta da lise celular. (B) A comparação qualitativa da hemólise plasmática ao longo do tempo demonstra visualmente menos hemólise em estados de baixa RPM quando comparados a estados de alta RPM. (C-F) Avaliação da hemólise em sistemas com diferentes níveis de resistência e integração da bacia com substitutos de plasma: (C) Uma diferença significativa nos níveis de lactato foi determinada entre a configuração do circuito paralelo e a configuração da bacia fechada e da bacia (p < 0,0001 e p < 0,0001, respectivamente). (D) Uma diferença significativa nos níveis de potássio foi determinada entre a configuração do circuito paralelo e as séries fechadas e as séries com configuração da bacia (p < 0,0001 e p < 0,0001, respectivamente). (E) Uma diferença significativa nos níveis de hematócrito foi determinada entre a configuração do circuito paralelo e as séries fechadas e com a configuração da bacia (p < 0,0001 e p < 0,0001, respectivamente). (F) Foi determinada diferença significativa nos níveis de hemoglobina entre a configuração do circuito paralelo e as séries fechadas e as séries com configuração da bacia (p < 0,0001 e p < 0,0001, respectivamente). Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 1: Perfusões de otimização de órgãos suínos. Trinta e cinco experimentos de perfusão suína realizados durante as fases de otimização, incluindo 25 fígados parciais, 2 rins e 8 fígados inteiros. Estão incluídos a duração da perfusão e o motivo da interrupção. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Validação do fígado humano e perfusões de aplicação. Quatorze perfusões hepáticas parciais humanas, incluindo hepatectomias formais esquerda e direita, abrangendo experimentos de perfusão de segmento único. Estão incluídos patologia, objetivo experimental, duração da perfusão e justificativa para a interrupção. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Otimização somente de perfusato. Vinte e duas execuções de otimização somente de perfusato, incluindo tipo de espécie, objetivo experimental, duração do experimento e motivo do término. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As máquinas de perfusão normotérmicas comumente empregadas antes do transplante de órgãos sólidos permitiram avanços significativos na perfusão ex vivo. Embora seu uso com órgãos parciais seja tecnicamente viável em alguns casos 7,8,9, eles permanecem inacessíveis para o pesquisador devido aos altos custos e disponibilidade limitada. Neste trabalho, procuramos fornecer uma alternativa comparável e de código aberto para a comunidade de pesquisa em geral por meio do uso de componentes de fontes prontas e código de acesso livre para executar o sistema para uma ampla gama de endpoints de pesquisa.

Várias etapas dentro do protocolo são essenciais para alcançar a perfusão estável do órgão. Uma das etapas mais críticas é a descarga efetiva da pressão para evitar o colapso do parênquima e a dilatação sinusoidal. Isso foi conseguido implementando espuma viscoelástica suportada por um diafragma oscilante para distribuir uniformemente o peso do órgão e manter a pressão portal próxima à atmosfera para drenagem adequada. O uso inicial de uma grade metálica para apoiar o fígado resultou em colapso parenquimatoso e congestão sinusoidal, conforme observado na análise histológica e na ultrassonografia durante a perfusão. Isso foi parcialmente resolvido com a transição para uma rede de silicone perfurada. Embora a necrose por pressão macroscópica tenha sido resolvida, ainda havia evidências notáveis de colapso parenquimatoso, como evidenciado por altas pressões da veia porta e espécimes significativamente congestionados após 48 h de perfusão. Submergir o fígado em solução salina ou sangue também foi tentado e foi bem-sucedido no alívio da congestão e hipertensão portal; no entanto, não foi viável devido à grande quantidade de perfusato necessária, dificuldade em manter a esterilidade e falta de drenagem eficiente para o reservatório. Quando comparado à técnica flutuante, observamos a mesma pressão portal próxima à atmosfera quando o fígado foi colocado em uma almofada de espuma viscoelástica com um diafragma oscilante para dispersar o peso de maneira mais uniforme (Figura 1B e Figura 3I). Este projeto resulta em segmentos mais macios e melhor perfundidos, ao mesmo tempo em que permite uma drenagem fácil e eficiente do fluxo de sangue da amostra.

Um segundo passo crítico é minimizar a resistência do circuito que transmite estresse de cisalhamento aos glóbulos vermelhos para evitar a hemólise. Isso foi conseguido com a introdução de circuitos laterais com componentes restritivos para facilitar o fluxo fisiológico sem submeter o perfusato a pressão desnecessária. A hemólise é um processo inevitável e contínuo durante a perfusão da máquina. Nas primeiras iterações do sistema, a hemólise extensa contribuiu significativamente para a interrupção precoce. A tensão de cisalhamento que o sistema transmite aos glóbulos vermelhos decorre predominantemente das bombas devido à estase e recirculação do perfusato, além de diâmetros estreitos de tubos e membranas. As bombas atualmente empregadas causam algum grau de hemólise, que aumenta com o tempo. A eficiência da bomba é um fator importante na hemólise, pois fluxos mais altos podem ser benéficos devido a taxas mais baixas de reciclagem de sangue e fluxo secundário, mitigados por maior volume de perfusato e/ou velocidades de bomba mais baixas. Como grandes volumes de pRBCs são frequentemente difíceis de adquirir, concentramos esforços no redesenho do sistema para fornecer taxas de fluxo fisiológico em velocidades de bomba mais baixas, conferindo menor resistência no circuito em geral31. Para diminuir ainda mais a resistência intrínseca do circuito, integramos os circuitos laterais em paralelo, o que resultou em níveis mais baixos de lactato e potássio e níveis mais altos de hematócrito e hemoglobina ao longo do tempo (Figura 3 suplementar). Por fim, o hemofiltro atual é integrado ao circuito lateral da veia porta com sangue propelido por uma bomba peristáltica que confere uma quantidade significativa de hemólise devido à notável resistência e tensão de cisalhamento transmitida pelo filtro e sua bomba. Um de nossos esforços atuais de otimização está focado na remoção desse circuito lateral, investigando a possível implementação de tubos de hemodiálise no reservatório. A remoção dos hemofiltros de grau clínico permitiria a remoção subsequente da bomba peristáltica, minimizaria ainda mais a hemólise e reduziria o custo geral do sistema.

Apesar da utilidade e adaptabilidade do sistema aqui descrito, as limitações devem ser reconhecidas. Notavelmente, a duração da perfusão viável reprodutível é de 3 a 4 dias. A hemólise continua sendo um fator central que limita a longevidade da perfusão, conforme discutido acima. No entanto, descobrimos que o aumento significativo do volume total de perfusato pode estender substancialmente a duração da perfusão se forem necessários tempos de perfusão mais longos, mas isso aumenta a utilização de recursos além do que descrevemos aqui. A duração ideal da perfusão dependerá, em última análise, da pergunta experimental específica que está sendo feita ao sistema. Por exemplo, estudos que investigam a cinética de entrega de medicamentos ou a inibição da via podem ser conduzidos com eficácia ao longo de 2-12 h, enquanto questões envolvendo o recrutamento celular para o microambiente tumoral podem exigir 48 h32. Estender a viabilidade além da janela atual pode ser importante para aplicações como remodelação da matriz extracelular (ou seja, fibrose), mas acreditamos que a maioria das aplicações relacionadas ao câncer não exigirá o gasto extra de recursos. O foco principal foi em aplicações translacionais orientadas para oncologia, com o objetivo de manter tumores humanos em um ambiente ex vivo controlado no qual a terapia pode ser administrada por meio de parênquima intacto e vasculatura tumoral, condições que replicam mais de perto as complexidades dos cenários in vivo25. Nesse cenário, o sistema aborda questões de longa data nos modelos atuais de oncologia pré-clínica relacionadas à administração de medicamentos, heterogeneidade tumoral e metabolismo de medicamentos, o que pode explicar a frequente falha em traduzir o sucesso pré-clínico em eficácia clínica33,34.

Em comparação com as máquinas comerciais existentes, o sistema oferece vantagens de custo significativas, escalabilidade modular e flexibilidade experimental. Os dispositivos comerciais geralmente são proprietários, caros e otimizados para perfusão de órgãos completos em ambientes de transplante. O sistema é escalável de uma forma que as máquinas comerciais não são, de modo que podemos visualizar sua aplicabilidade amplamente. O sistema aqui apresentado não é um produto final, mas sim um projeto, que pode ser modificado, adaptado e reaproveitado para atender a uma ampla variedade de interesses de pesquisa e questões experimentais, preenchendo um vazio para cientistas em muitas disciplinas.

As direções futuras para esta plataforma incluem a redução para segmentos hepáticos subsegmentares e o volume de perfusato para permitir o uso de produtos sanguíneos autólogos para apoiar aplicações de imuno-oncologia. Também estamos trabalhando para integrar plataformas multiômicas e imagens em tempo real para fornecer monitoramento dinâmico da resposta ao tratamento, abrindo caminho para estudos farmacológicos detalhados. Esperamos que o sistema incentive a colaboração e a inovação em um esforço para forjar novas profundidades de conhecimento em vários campos da ciência translacional.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores relatam não haver conflitos de interesse neste estudo e em seus achados. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo programa de pesquisa interna do National Institutes of Health. Fonte de financiamento para a imagem de amostra e radiômica preliminar apoiada pelo Prêmio de Pesquisa para Médicos da Equipe ID da proposta 231145 a Elliot Levy.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de reconhecer e expressar sua gratidão em apoio a este projeto aos seguintes grupos: Departamento de Medicina Transfusional do NIH, Departamento de Medicina Perioperatória do NIH, Departamento de Patologia do NIH, Wagner's Meats.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Versilon de parede de 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16"  C-219-A Tubo de PVC FlexívelCorporação de Plástico dos EUA57682
Seringas de 10 cc com ponta BD Luer-LockBD302995
Seringas de 1cc com ponta BD Luer-LockBD309628
Cânula Portal 25 FrXVIVO11.01.520
Suporte de sensor de fluxo impresso em 3Dn/an/aconsulte GitHub para arquivos SDL
Suporte magnético impresso em 3Dn/an/aconsulte GitHub para arquivos SDL
48 pol. H x 24 pol. W Pegboard BrancoDepósito doméstico109099
Torneira de 4 vias, amarela, 2 travas Luer fêmea, Luer macho com trava giratóriaInstrumentos de precisão mundiais14057-10
Seringas de 50 cc com ponta BD Luer-LockBD309653
ACF00023 Tygon S3  por Saint Gobain | 5/16" I.D. x 1/2" O.D. x 3/32" Parede | E-3603 Não-DEHP | Tubulação de Laboratório Sem Ftalatos | 50' Comprimento do PacoteArmazém de mangueirasACF00023
AnfotericinaFarmácia Veterinárian/ahttps://mms.mckesson.com/product/505635/Xgen-Pharmaceuticals-39822105505
Conexão farpada, conector em Y, ID do tubo de 3/8", PP, 5/PKVWRMFLX06368-24Tipo de material não crítico
Calibrador CDI 540Terumo540CL
Suporte de cabeça de cabo CDITerumoCDI519CL
CDI MonitorTerumo500AVHCTCL
Braçadeira de pólo CDITerumoCDI517CL
Conector de Tubulação Clave IV Sem Agulha 100/CaHenry Schein Dental1097422
Clinimix com eletrólitosBaxter2B7721use apenas o lado do aminoácido, não misture com o lado da dextrose
CO2 Grau USP 50 LBOxigênio de RobertR25
Monitores de computador para GUI n/an/aqualquer tipo de tela para visualização da GUI
Dispositivo de aquisição de dadosComputação de mediçãoUSB-202precisa de 2 ou 3, dependendo de como o maquinário está conectado
Fonte de alimentação de mesa para bombaLevitronix100-40015precisa de 2, um para HA um para PV
Funil de Tambor Eagle 1662 com Tela de Latão, 18" de Diâmetro x 7" de Altura, AmareloIndústria GlobalWB440139
EpoprostenolFarmácia Veterinárian/ahttps://mms.mckesson.com/product/1239813/Sun-Pharmaceuticals-62756005940
Fêmea Luer ¼ "farpa em sala limpa de nylon natural fabricada; Pacote com 10VWRMFLX40314-26Tipo de material não crítico
Encaixe, polipropileno, reto, fêmea Luer aos adaptadores da mangueira, 1/8" identificação; 25/PKVWRMFLX30800-08Tipo de material não crítico
Encaixe, Polipropileno, Reto, Macho Luer Lock para Adaptador de Mangueira, 1/8" ID; 25/PKVWRMFLX30800-18Tipo de material não crítico
Conexões, PVDF, Retas, Redutor de Mangueira Barb, 5/16" ID x ¼ " Identificação; 10/PKVWRMFLX40614-62Tipo de material não crítico
Montagens de Fluxo n/an/aconsulte GitHub para arquivos SDL
Braçadeira do sensor de fluxoKeyenceFD-XC20R1
Controlador do sensor de fluxoKeyenceFD-XA1
Cabeça do sensor de fluxoKeyenceFD-XS20
Fonte de alimentação do sensor de fluxoKeyenceMS2-H50
Liquidificador a Gás Quadrante MestralGB100+2precisa de 2, um para HA um para PV
Garrafa de Gás A, CDI 500TerumoCDI506
Garrafa de Gás B, CDI 500TerumoCDI507
Kit glucagon, glucagon 1 mg, água estéril 1 mL, frascoFresenius0593-03
CUBETA H / S 1 / 4x1 / 4 W / 6 "EXT 1CA = 10EA 70-2006-4298-4Terumo6934
Reservatório Hardshell com 150 µ Filtro MCorporação de Hemonomia00205-00
Almofada de Calor Frio, Mul-T-Pad, Tamanho da Almofada TP12E 13" x 18" para Bomba Gaymar TP700Almofada Mul-T8002-062-012https://www.amazon.com/Heat-Cold-Mul-T-Pad-Gaymar-TP700/dp/B00HFF7876. Of  observe que a Stryker também fornece jaquetas de água aquecidas semelhantes ao "Mul-T-Pad C2Dx 8002-062-012"
InsulinaFarmácia Veterináriahttps://mms.mckesson.com/product/294668/Novo-Nordisk-Pharmaceutical-00169183311
Bomba Ismatec Modelo Ecoline VC-280 IIIsmatecISM1078B-115
LTV 1200 Ventilador PediátricoFusão de cuidadoshttps://coastbiomed.com/product/carefusion-ltv-1200-ventilator/?srsltid=AfmBOopSCKwTLmKhZXcI
CgGQHfiKwj__78jNWxVaznJCS
aq3RjXw2E-H.
Este modelo de ventilador pediátrico foi reaproveitado a partir do excedente hospitalar e não foi adquirido. Qualquer bomba intermitente comercial ou máquina de aeração é um substituto adequado.
Cabo da bomba principalLevitronix190-10331precisa de 2, um para HA um para PV
Solução de preservação de órgãos MaPerSol, saco de 1LSoluções de preservaçãoRolamento PS005
Masterflex Adaptadores de Encaixe, Luer para Luer, Tee, Avantor VWRMFLX45508-56Tipo de material não crítico
Masterflex Luer fêmea 3/16" de farpa da identificação na sala de limpeza natural de PVDF fabricadaVWRMFLX40314-22Tipo de material não crítico
Bomba Digital Masterflex Ismatec Reglo com MasterflexLive, 4 canais, 8 rolos; 115/230 VACMasterflexMFLX78018-22https://www.avantorsciences.com/us/en/product/NA5139147/masterflex-ismatec-reglo-digital-multichannel-pumps-avantor
Masterflex Macho Luer 1/4" ID Barb em PVDF Natural Fabricado em Sala Limpa, 10/PKVWRMFLX40318-27Tipo de material não crítico
Masterflex Macho Luer 3/16" ID Barb em PVDF Natural Sala Limpa FabricadaVWRMFLX40318-22Tipo de material não crítico
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