Mapeando interações proteína-proteína disfuncionais na doença

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir a captura e identificação de interações proteína-proteína específicas da doença de células e tecidos nativos usando sondas químicas e espectrometria de massa. Os conjuntos de dados de interação resultantes são analisados por meio de uma plataforma dedicada baseada na web para revelar disfunções de rede dinâmica e alterações de vias ligadas à doença.

Resumo

As redes de interação proteína-proteína (PPI) são dinamicamente remodeladas na doença, mas a maioria das abordagens de biologia de sistemas se concentra em mudanças na abundância de proteínas, ignorando a disfunção crítica no nível de interação. Aqui, apresentamos um método quimioproteômico robusto - interactoma proteína-proteína disfuncional (dfPPI) - que permite o mapeamento sistemático e contextual da doença de alto rendimento das disfunções da rede PPI em células e tecido humano primário. Este método integra sondas de biologia química que capturam seletivamente conjuntos de interactoma baseados em epichaperomas com cromatografia líquida sem marcadores-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) e análise computacional baseada em rede, para descobrir a religação de redes de proteínas não aparentes apenas a partir de dados transcriptômicos ou proteômicos. A plataforma dfPPI pode ser aplicada em estados de doença, espécies e tecidos para identificar nós acionáveis de disfunção e permitir insights de alta resolução em nível de sistema sobre a progressão da doença. Neste protocolo, demonstramos procedimentos passo a passo para preparação de amostras, tratamento de sonda química, enriquecimento de afinidade, análise de LC-MS/MS sem rótulo e fluxos de trabalho de bioinformática usados para gerar e interpretar conjuntos de dados dfPPI. Este artigo tem como objetivo promover a reprodutibilidade e acessibilidade dessa abordagem, apoiando sua adoção pelas comunidades mais amplas de biologia de sistemas e pesquisa translacional.

Introdução

A função das células e, por extensão, dos organismos, depende da coordenação precisa das redes de interação proteína-proteína (PPI) ^1,2. Essas redes são responsáveis por organizar e executar quase todos os processos biológicos. Embora as redes PPI sejam inerentemente dinâmicas e responsivas ao estresse, na doença, elas podem se tornar anormalmente religadas, levando a funções desadaptativas. É importante ressaltar que essa religação não envolve necessariamente mudanças na expressão gênica ou proteica; em vez disso, surge de interações físicas alteradas entre proteínas que são normalmente expressas ^3,4,5. As abordagens tradicionais em biologia de sistemas, como transcriptômica ou proteômica, não conseguem capturar essas mudanças críticas no nível de interação.

As tecnologias de mapeamento PPI avançaram significativamente, oferecendo insights sobre a organização e regulação das redes celulares 6,7,8,9,10,11. Abordagens comumente usadas, incluindo espectrometria de massa de purificação de afinidade (AP-MS), reticulação (XL)-MS, marcação de proximidade e cofracionamento, oferecem vantagens específicas, como alta especificidade, resolução espacial ou capacidade de detectar complexos transitórios 6,8,9,10,11 . No entanto, esses métodos geralmente requerem proteínas de isca, manipulação genética ou bioinformática complexa e podem ter dificuldades para capturar a religação em larga escala e causada por doenças de redes de proteínas em sistemas biológicos nativos 6,7,8,9,10,11 . A maioria também carece de escalabilidade, tornando-os impraticáveis para analisar grandes coortes de amostras ou mapear sistematicamente as mudanças do interactoma em condições, tipos de células ou pontos de tempo 6,7,8,9,10,11 (Tabela 1).

Para resolver essa lacuna, desenvolvemos a plataforma Dysfunctional Protein-Protein Interactome (dfPPI), um método quimioproteômico que identifica diretamente as disfunções da rede PPI responsáveis pelos fenótipos da doença¹². Ele aproveita uma visão biológica fundamental: em estados de doença, um subconjunto de chaperonas moleculares forma andaimes supramoleculares chamados epichaperomas^{13 , 14 , 15} . Essas estruturas não atuam no dobramento de proteínas, mas funcionam como centros de interação de andaimes que reorganizam a conectividade de proteínas³. Crucialmente, as proteínas sequestradas em epichaperomes não são aleatórias; são aqueles ativamente envolvidos na sustentação do fenótipo da doença 16,17,18,19,20. Ao capturar essas proteínas ligadas ao epichaperoma e seus interagentes, o dfPPI identifica as alterações exatas da rede que impulsionam estados específicos da doença. A religação da rede impulsionada por epichaperoma é prevalente em todas as doenças - a maioria nas coortes da doença de Alzheimer e ~ 70% em amostras de câncer^16,20 - apoiando a aplicabilidade do dfPPI a grandes estudos focados na doença.

A plataforma dfPPI abrange todo o fluxo de trabalho, desde a preparação da amostra, captura de afinidade do epichaperoma e identificação do interactoma por MS, até análises de bioinformática a jusante, como enriquecimento de vias e modelagem de rede de proteínas funcionais (Figura 1). O método faz uso de sondas químicas específicas do epichaperoma imobilizadas em matrizes de afinidade (PU-beads ou outras sondas) ^{13 , 16 , 17} para isolar o interactoma funcional de células ou tecidos. Essas sondas já foram rigorosamente validadas em várias publicações quanto à especificidade para epichaperomas e adequação para dfPPI 16,17,18,20,21,22. Os complexos capturados são submetidos à EM, usando fluxos de trabalho de digestão no grânulo e no gel, seguidos por LC-MS/MS sem marcação. Os dados resultantes podem então ser analisados por meio de um pipeline de bioinformática dedicado que define a disfunção no nível de interação e a vincula a processos biológicos e fenótipos. Como os epichaperomas estruturam interactomas específicos do contexto 17,18,20, o dfPPI revela como as redes de proteínas são remodeladas em uma determinada doença, tipo de célula ou estágio, tornando-o uma poderosa ferramenta de biologia de sistemas para fenotipagem de precisão.

O método é altamente escalável e foi aplicado a centenas de amostras clínicas e experimentais, incluindo tecido humano post-mortem e células cultivadas, em diversas doenças, como câncer e neurodegeneração 16,17,18,19,20,22,23. Ao descobrir as alterações do PPI que definem um estado patológico, o dfPPI permite tanto a visão mecanicista quanto a descoberta de alvos terapêuticos acionáveis 16,17,18,19,20,22,23.

Neste protocolo, descrevemos em detalhes os componentes experimentais da plataforma dfPPI, desde a captura de afinidade de interactomas ligados ao epichaperoma até a preparação de amostras para LC-MS/MS e identificação de interactomas via MS. O pipeline de análise computacional - ou seja, o que é feito com a lista de proteínas identificadas pelo MS para definir interações diferenciais e consequências funcionais - não é abordado aqui devido a limitações de espaço. No entanto, é de acesso gratuito e amplamente documentado através do aplicativo dfPPI Shiny em https://epichaperomics.mskcc.org (atualizado para https://dfppi.mskcc.org) e através do site do Chiosis Lab em https://www.chiosislab.com/resources. Além desses portais, o pipeline completo de bioinformática e os scripts que o acompanham estão incluídos em várias publicações que aplicam o dfPPI ao câncer 16,17,19 e à doença de Alzheimer ^18,20.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana e do comitê de cuidados e uso de animais de nossa instituição. Os equipamentos e reagentes utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação da amostra para captura de afinidade

1. Extração de proteínas do tecido
   NOTA: Este protocolo foi otimizado para amostras de tecido cerebral post-mortem.
   1. Prepare um tampão de extração de proteína contendo 20 mM de Tris (pH 7,5), 20 mM de KCl, 5 mM de MgCl₂ e 0,01% de NP-40 (tampão de lise nativo). Adicione inibidores de protease e fosfatase imediatamente antes de usar. Mantenha o tampão no gelo.
   2. Coloque o tecido congelado (volume alvo de aproximadamente 50 mm³) em um tubo homogeneizador de micro tecidos, que consiste em um tubo de microcentrífuga especializado de 1,5 mL equipado com um pilão. Adicione 500-700 μL de tampão de lise nativo, ajustando o volume com base na compactação do tecido e na facilidade de homogeneização. Homogeneizar a amostra no gelo, movendo suavemente o pilão para cima e para baixo e contra as paredes abrasivas do tubo homogeneizador, até formar uma suspensão homogénea.
      NOTA: Execute todas as etapas no gelo para manter os conjuntos de proteínas em sua configuração nativa e evitar a degradação da proteína.
   3. Incubar lisados a 4 °C durante 30 min, colocando o frasco para injetáveis numa unidade de rotação. Misture suavemente as amostras durante a incubação usando rotação.
   4. Centrifugue as amostras a 13.000 × g por 10 min a 4 °C usando uma centrífuga de bancada para remover os detritos.
   5. Colete os sobrenadantes e transfira-os para tubos de microcentrífuga transparentes de 1,5 mL. Evite perturbar o pellet durante a transferência.
   6. Determine a concentração total de proteína no sobrenadante usando o kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Os lisados de proteínas podem ser armazenados a -80 °C até o uso. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Consulte uma publicação anterior²⁴ para o impacto de ciclos repetidos de congelamento e descongelamento e temperatura de armazenamento na integridade dos conjuntos de proteínas.
2. Normalização de amostra
   NOTA: HSP90α e HSP90β são componentes centrais do epichaperoma e são os parceiros de ligação direta da sonda química usada para captura de interactoma 13,21,23. A normalização de amostras com base em HSP90α (ou HSP90β) garante que a quantidade de epichaperoma direcionável por sonda seja combinada entre as amostras, o que é essencial para uma comparação precisa dos interactomas capturados. As amostras podem ser normalizadas com base nos níveis de HSP90 determinados por Western blot, mas outros métodos também podem ser usados. Se os níveis de HSP90 forem comparáveis entre as amostras, ignore esta seção e prossiga para a etapa 1.3. O uso de HSP90α / β blotting aqui é apenas para normalização de entrada e não deve ser interpretado como uma medida de abundância de epichaperoma.
   1. Prepare 2× Tampão de amostra Laemmli consistindo de 4% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 20% de glicerol, 10% de 2-mercaptoetanol, 0,02% de azul de bromofenol e 0,125 M Tris-HCl, pH ~ 6,8.
      CUIDADO: O 2-mercaptoetanol é tóxico e volátil e deve ser manuseado em uma capela de exaustão.
   2. Combine 5 μg do extrato total de proteína cerebral (da etapa 1.1) 1:1 (v/v) com 2× Laemmli sample tampão em um tubo de microcentrífuga transparente de 1,5 mL.
   3. Aqueça as amostras a 95 °C por 3-5 min em uma unidade de aquecimento para desnaturar as proteínas antes de carregar na eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE).
   4. Carregue as amostras em géis de proteína Tris-Glicina 8% pré-fabricados. Como alternativa, use géis fundidos à mão.
   5. Carregue 5 μL de padrão de proteína pré-corado em cada gel, por exemplo, no primeiro poço, para determinar o peso molecular da proteína.
   6. Execute os géis em tampão de corrida 1× TGS (Tris-Glicina-SDS) em RT. O tempo de execução típico é de 1,5-2 h a 100 V.
   7. Prepare um tampão de transferência contendo 25 mM de Tris, 192 mM de glicina e 20% de metanol.
      CUIDADO: O metanol é inflamável e deve ser manuseado de acordo com as diretrizes de segurança.
   8. Transferir as proteínas para uma membrana de nitrocelulose em tampão de transferência a 4 °C durante 60 min a uma tensão constante (100 V).
   9. Prepare uma solução de lavagem de membrana (1× TBS-0,1% Tween-20) e uma solução de bloqueio (5% de leite em 1× TBS-0,1% Tween-20). Este protocolo usa leite em pó desnatado de uma fonte comercial.
   10. Colocar a membrana em solução de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente (RT) com agitação suave num balancim de plataforma. Use 10 mL de solução bloqueadora por mini gel.
   11. Remova a solução de bloqueio e incube a membrana com anticorpo anti-HSP90α (diluição 1:6.000 em 10 mL de solução de bloqueio) durante a noite a 4 ° C em um balancim de plataforma.
   12. Remova a solução de anticorpos e lave a membrana três vezes por 5 min cada com 10 mL de solução de lavagem.
   13. Adicione o anticorpo secundário anti-coelho de cabra conjugado com HRP (diluição 1:5.000 em 10 mL 1× TBS-0,1% Tween-20) e incube por 1 h em RT em um balancim de plataforma.
   14. Remova o anticorpo secundário e lave a membrana quatro vezes com solução de lavagem (mesmo volume e tempo acima).
   15. Detecte o sinal quimioluminescente específico para HSP90α usando um kit de quimioluminescência aprimorada (ECL) de acordo com as instruções do fabricante. Use um sistema de imagem de quimioluminescência ou filme autorradiográfico.
   16. Quantifique os níveis de HSP90α nas amostras com base na intensidade do sinal e calcule um fator de normalização para pull-down a jusante.
       NOTA: A intensidade do sinal HSP90 reflete a quantidade de epichaperoma direcionável à sonda em cada amostra. Ao comparar a intensidade do sinal entre as amostras e normalizar para uma amostra de referência executada em cada gel, os volumes de entrada para captura de interactoma podem ser ajustados de acordo. A quantificação pode ser realizada usando um software de densitometria. Sempre inclua uma alíquota de uma amostra de referência em cada gel para permitir a normalização entre os borrões.
3. Preparação de PU
   NOTA: Os grânulos de PU e os grânulos de controle podem ser sintetizados internamente conforme relatado anteriormente^21,25 ou solicitados ao laboratório de quiose mediante a execução de um contrato de transferência de material (MTA). Devem ser conservados a -20 °C em isopropanol.
   1. Pegue uma alíquota de grânulos de poliuretano (PU) ou grânulos de controle diretamente do estoque de isopropanol. Inclua aproximadamente 30% de excesso para compensar a perda de contas durante a lavagem e manuseio.
   2. Remova o solvente de armazenamento: deixe os grânulos assentarem e aspire o isopropanol. Adicione tampão de lise nativo (1 mL para um tubo de 1,5 mL; 5 mL para um cônico de 15 mL) e ressuspenda totalmente por pipetagem ou inversão suave.
   3. Lavar e equilibrar três vezes: para cada lavagem, vórtice para ressuspender, centrifugar (tubo de 1,5 ml: 10.000 × g, 1 min; 15 ml cónico: 3.000 × g, 5 min) e, em seguida, aspirar o sobrenadante com uma linha de vácuo equipada com uma ponta de pipeta, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento.
   4. Adicione tampão de lise nativo aos grânulos lavados em uma proporção de volume de 1:1 (grânulos:tampão) para gerar uma pasta de grânulo de trabalho uniforme.
   5. Alíquota de 40 μL de pasta de PU (ou esfera de controle) (por exemplo, 1:1 v/v grânulos: tampão) por amostra em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Use uma ponta de pipeta com a extremidade cortada para facilitar a distribuição do cordão.
      NOTA: As contas de PU são sensíveis à luz. Use tubos escuros ou embrulhados em papel alumínio de 1.5 mL durante as etapas suspensas. Devido ao seu revestimento de superfície hidrofóbico com o aglutinante de epichaperoma de molécula pequena, os grânulos de PU tendem a se aglomerar e aderir a superfícies plásticas. Pipete suavemente e misture bem para garantir uma ressuspensão uniforme. É fundamental dispensar volumes iguais de pasta de grânulos em cada amostra para evitar variabilidade na captura de proteínas, o que pode levar a resultados inconsistentes ou não reprodutíveis.
   6. Lave os grânulos três vezes com tampão de lise nativo adicionando 1 mL de tampão a cada tubo, vórtice, centrifugando a 10.000 × g por 1 min e descartando o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de que as contas sejam totalmente ressuspensas entre cada lavagem.
      NOTA: Ao aspirar, evite tocar nas contas. Pressione a ponta da pipeta suavemente contra a parede do tubo enquanto remove o líquido.
   7. Após a lavagem final, remova a maior parte do líquido dos tubos, tomando cuidado para não perturbar o grânulo do grânulo.
      NOTA: As contas lavadas podem ser armazenadas a 4 °C por alguns dias. Normalmente, as contas são usadas dentro de 1-2 dias após a preparação.
4. Interactoma suspenso
   NOTA: A primeira etapa do pull-down é uma etapa de pré-limpeza usando esferas de controle, que são conjugadas a uma pequena molécula inerte que não se liga aos epichaperomes¹⁶. Esta etapa remove proteínas, agregados e detritos insolúveis que não interagem especificamente do lisado, melhorando assim a especificidade do pull-down subsequente do grânulo de PU. A pré-limpeza reduz a ligação de fundo e aumenta a detecção de proteínas específicas associadas ao epichaperoma.
   O interactoma recuperado por este protocolo é analisado por MS, que é altamente sensível a contaminantes experimentais. Para garantir a identificação precisa de proteínas e preservar a qualidade dos dados, sempre use tampões e reagentes recém-preparados, minimize a exposição à poeira e queratina e use luvas limpas e sem pó ao manusear amostras, consumíveis ou equipamentos. Use vidraria/consumíveis dedicados ao MS para todas as etapas de digestão pull-down e em gel e mantenha todos os itens usados para Western blotting fisicamente separados. Se estiver reutilizando vidraria, descontamine enxaguando sequencialmente com 100% de metanol, água ultrapura, ácido acético 80%, água ultrapura e depois seque ao ar. Não use detergentes; até mesmo resíduos vestigiais podem sujar colunas LC e fontes de íons.
   1. Adicione os extratos de proteína normalizados (conforme a etapa 1.2, calculada com base na intensidade do blot HSP90) a tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mL contendo 40 μL da pasta de grânulos de controle (ou seja, grânulos de 20 μL + tampão de 20 μL) e ajuste o volume final para 250 μL adicionando o volume apropriado de tampão de lise nativo.
      NOTA: Para determinar os volumes de entrada específicos da amostra, use a fórmula A1 = (60 / C1) × X1, onde A1 é o volume de proteína total normalizada a ser adicionada (μL), C1 é a concentração de proteína medida (μg/μL) e X1 é o fator de normalização derivado do HSP90 blotting (conforme descrito na etapa 1.2). O volume de tampão adicional a ser adicionado é calculado como 250 μL menos A1. Se a normalização não for necessária, use 250 μg de proteína total em 250 μL.
   2. Incubar as amostras a 4 °C durante 30 min com rotação num rotador de ponta a ponta (10-15 rpm).
   3. Centrifugue os tubos a 10.000 × g por 1 min a 4 ° C para granular os grânulos de controle junto com proteínas agregadas ou insolúveis.
   4. Colete cuidadosamente o sobrenadante dos grânulos de controle usando uma pipeta de 1 mL e transfira-o para tubos de 1,5 mL contendo 40 μL da pasta de PU lavada.
   5. Incubar as amostras a 4 °C durante 3 h com rotação num rotador de ponta a ponta (10-15 rpm).
   6. Centrifugue cada tubo a 10.000 × g por 1 min, aspire o sobrenadante e lave os grânulos quatro vezes com 1 mL de tampão de lise nativo. Para cada lavagem: vórtice, centrífuga e aspirado, utilizando os parâmetros descritos no passo 1.3.
      NOTA: Nesta fase, as amostras podem ser processadas para LC-MS/MS usando um dos dois fluxos de trabalho: (1) SDS-PAGE seguido de digestão em gel ou (2) digestão no grânulo das proteínas capturadas.
      Para o fluxo de trabalho de digestão em gel, continue com o protocolo conforme escrito. Para digestão no grânulo, lave os grânulos mais duas vezes com PBS frio e prossiga imediatamente para a Seção 3. Não congele as contas se estiver procedendo com a digestão na conta; As amostras devem ser transformadas frescas no mesmo dia. O congelamento de complexos de proteínas ligados a esferas pode prejudicar a eficiência da digestão, promovendo a agregação ou perda de solubilidade de proteínas, levando a uma menor recuperação de peptídeos e maior variabilidade. Com base nas recomendações principais do MS, as amostras devem ser processadas frescas no mesmo dia para garantir uma digestão consistente no grânulo.
5. Preparação de amostras para digestão em gel
   1. Adicione 25 μL de tampão de amostra de 2× Laemmli às amostras de esferas preparadas na etapa 1.4.6, que estão contidas em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
      NOTA: As amostras neste ponto podem ser armazenadas a -80 °C por até 24 h. Sempre carregue todo o volume da amostra no gel SDS-PAGE para digestão em gel para maximizar a cobertura do proteoma e garantir a representação completa do interactoma. O carregamento parcial não é recomendado. Se o volume da amostra for limitado e o carregamento parcial for inevitável, o material restante deve ser armazenado em alíquotas para minimizar os ciclos de congelamento e descongelamento e preservar a integridade do interactoma.
   2. Aqueça cada amostra a 95 °C por 3 min (com o tampão de amostra de 2× Laemmli adicionado, como acima) para desnaturar os complexos de proteínas e eluê-los dos grânulos antes de carregá-los no SDS-PAGE. O SDS e os agentes redutores no tampão interrompem os PPIs e liberam proteínas da matriz.
   3. Centrifugue cada tubo a 10.000 × g por 1 min em RT.
   4. Carregue cada sobrenadante em géis SDS-PAGE pré-moldados de gradiente de 4-20%.
   5. Execute os géis em 1× tampão de execução TGS em RT e pare a corrida no meio (~ 3,5-4 cm no gel a 100 V, normalmente 30-60 minutos de tempo de execução).
   6. Remova o gel da unidade de eletroforese e prossiga para corar com azul brilhante de Coomassie de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: O gel corado, imerso em 5-7 mL de água ultrapura em um recipiente de plástico, pode ser transportado para a instalação de MS para identificação de proteínas. Se não for processado imediatamente, armazene a 4 ° C em água ultrapura por até 1-2 semanas. Dois fluxos de trabalho proteômicos alternativos foram usados, dependendo da instalação principal que executou o trabalho e dos objetivos experimentais: a Seção 2 descreve a digestão em gel seguida pela análise de aquisição independente de dados (DIA)-MS usando espectrômetro de massa orbitrap quadrupolo; A seção 3 detalha um protocolo de digestão no grânulo otimizado para espectrometria de mobilidade de íons aprisionados com fragmentação serial de acumulação paralela (diaPASEF) ²⁶ . As etapas podem ser cruzadas quando apropriado.

2. Identificação de proteínas por LC-MS/MS com digestão de proteínas em gel

1. Redução em gel e alquilação de proteínas cisteiniladas
   1. Extirpe a região manchada de cada faixa de gel corada com Coomassie e corte-a em aproximadamente cinco fatias de gel de tamanhos iguais. Destain cada fatia incubando-a três vezes em 500 μL de metanol a 50% (v / v) por 1 min a 37 ° C com agitação a 700 rpm em um agitador de microtubos com temperatura controlada.
      NOTA: Cada fatia de gel não deve ser maior que ~ 1 cm × 0.5 cm × 1 cm para garantir a difusão eficiente dos reagentes nas etapas subsequentes, bem como a digestão eficiente da tripsina em gel durante a noite. Extirpar a região do gel correspondente a proteínas fortemente coradas - como HSP90 e HSC70, que representam aglutinantes diretos da sonda química e componentes centrais do epichaperoma 15,16,23 - separadamente do resto do gel. Sua alta abundância pode interferir na detecção e quantificação de interagentes de menor abundância durante a análise de LC-MS/MS.
   2. Incubar cada fatia de gel em 500 μL de bicarbonato de amônio (ABC) 5 mM preparado em acetonitrila a 30% (ACN) a 37 ° C com agitação a 700 rpm em um agitador de microtubos com temperatura controlada por 15 min para remover a mancha residual. Repita a incubação até que a fatia de gel esteja completamente descorada.
      NOTA: Qualquer mancha de proteína visível remanescente pode interferir na ligação do peptídeo à matriz C18 durante a etapa de limpeza do peptídeo, reduzindo a recuperação e a sensibilidade da EM a jusante.
   3. Remova e descarte a solução ABC / ACN usando uma pipeta de ponta fina, tomando cuidado para não perder os pedaços de gel (ou seja, não aspire os pedaços de gel junto com o líquido). Em seguida, adicione 500 μL de 100% ACN a cada tubo, garantindo que as peças de gel estejam totalmente submersas. Incube em RT em um agitador orbital a 700 rpm por 10 min ou até que os pedaços de gel se tornem translúcidos, encolham de tamanho e adquiram a aparência de papel branco.
      CUIDADO: O ACN é inflamável e deve ser manuseado em uma capela de exaustão.
   4. Remova e descarte o ACN de cada tubo usando uma pipeta de ponta fina, tomando cuidado para não aspirar pedaços de gel. Centrifugue brevemente a 1.000 × g por 10 s para coletar o líquido residual e aspire cuidadosamente as gotículas restantes com uma pipeta de ponta fina. Coloque os tubos abertos em uma centrífuga a vácuo em RT por 10-15 min ou até que as fatias de gel estejam secas e rígidas.
      NOTA: Não seque demais. Verifique periodicamente para evitar rachaduras ou encolhimento excessivo dos pedaços de gel. Depois de secos, conservar os pedaços de gel a 4 °C num tubo selado de baixa ligação ou num tubo de microcentrífuga até à digestão; As proteínas ligadas ao gel e purificadas são estáveis até vários dias quando mantidas a 4 °C.
   5. Redução: Adicione ~ 100 μL de ditiotreitol (DTT) 10 mM (preparado fresco a partir de estoque de 500 mM em bicarbonato de amônio 50 mM) a cada tubo de amostra, garantindo que os pedaços de gel estejam totalmente submersos. Incubar a 56 °C durante 45 min com agitação a 700 rpm num agitador de microtubos com temperatura controlada.
      CUIDADO: A TDC é um irritante cutâneo e respiratório. Manuseie dentro de uma hotte química e use luvas.
      NOTA: Certifique-se de que os tubos estejam bem fechados durante a incubação para evitar a evaporação e manter a concentração de TDT.
   6. Alquilação: Remova a solução de TDT de cada tubo usando uma pipeta de ponta fina, tomando cuidado para não perturbar os pedaços de gel. Adicione imediatamente ~ 100 μL de iodoacetamida (IAA) 55 mM em 50 mM ABC para cobrir totalmente as fatias de gel. Incubar em RT com agitação a 700 rpm por 30 min no escuro.
      CUIDADO: O IAA é tóxico e sensível à luz. Efectue todo o manuseamento numa hotte usando luvas.
      NOTA: Assegure a remoção completa da TDT antes de adicionar IAA para evitar a extinção da reação de alquilação. Embrulhe os tubos em papel alumínio ou use recipientes bloqueadores de luz durante a incubação para minimizar a degradação do IAA.
   7. Centrifugue os tubos brevemente a 1.000 × g por 5 s em RT para coletar o líquido residual no fundo. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma ponta de pipeta de furo fino (por exemplo, ponta P10) para evitar perturbar os pedaços de gel. Incline ligeiramente o tubo e aspire a partir da borda para minimizar o risco de aspiração de fragmentos de gel.
   8. Equilibrar: Cubra os pedaços de gel com 500 μL de 50 mM ABC em 30% de ACN. Incubar em RT por 10 min, agitando a 700 rpm em um agitador orbital aquecido. Esta etapa ajuda a remover o excesso de reagente de alquilação e equilibra o gel antes da desidratação.
   9. Remover a solução: Centrifugar brevemente a 1.000 × g durante 5 s e eliminar o sobrenadante com uma pipeta de ponta fina, conforme descrito acima.
   10. Desidratar novamente: Repita as etapas 2.1.3 e 2.1.4 para desidratar novamente os pedaços de gel usando 100% ACN seguido de centrifugação a vácuo até secar. Esta etapa garante a recuperação ideal de peptídeos durante a digestão enzimática.
2. Proteólise em gel e limpeza de peptídeos
   1. Digerir as amostras de gel seco adicionando tripsina de grau MS a uma concentração final de 5 ng/μL em 50 mM ABC para reidratar totalmente as peças de gel (normalmente 50-100 μL de volume total, ou o suficiente para cobrir as fatias de gel). Incube durante a noite a 37 °C em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, garantindo que os tubos sejam hermeticamente vedados para evitar a evaporação. Agite suavemente, se possível (por exemplo, 300 rpm em um agitador de microtubos com temperatura controlada).
   2. Acidifique a amostra após a digestão durante a noite, adicionando 10% de ácido fórmico (FA) gota a gota para atingir uma concentração final de 1% (v / v) (por exemplo, adicione 1 μL de 10% de FA a 100 μL de digestão). Misture delicadamente e, em seguida, sonice os tubos por 10 min em um sonicador em banho-maria RT para melhorar a extração de peptídeos.
   3. Remova cuidadosamente o sobrenadante contendo peptídeo usando uma pipeta de ponta fina (por exemplo, ponta de furo estreito P10), tomando cuidado para não perturbar a matriz de gel ou aspirar fragmentos de gel. Transfira o sobrenadante coletado para um tubo de 500 μL de baixa ligação e coloque-o no gelo.
   4. Adicione 5% de FA / 50% de solução de ACN (v / v) a cada tubo (normalmente ~ 50-100 μL, ou o suficiente para cobrir totalmente os pedaços de gel) e agite suavemente em RT (por exemplo, em um agitador a 70 rpm por 10-15 min) para extrair peptídeos residuais. Recolha cuidadosamente o sobrenadante e combine-o com a solução peptídica original do passo 2.2.3.
   5. Concentre o extrato peptídico combinado usando centrifugação a vácuo em RT (por exemplo, 1.000 × g por ~ 30 min) até que reste apenas uma pequena gota. Não deixe a amostra secar completamente, pois isso pode causar perda de peptídeos devido à aderência às paredes do tubo. Utilizar o extracto parcialmente seco imediatamente para dessalinizar ou conservar a -20 °C num tubo selado de baixa ligação.
   6. Dessalinize os peptídeos usando ponteiras de pipeta embaladas em pequena escala embaladas à mão com C18 (ou seja, StageTips) preparadas com dois discos de extração C18 empilhados inseridos em uma ponteira de pipeta de 200 μL, conforme descrito anteriormente²⁷, com as seguintes modificações:
   7. Ative os discos C18 adicionando 40 μL de metanol. Centrifugue a ponta da pipeta contendo os discos (inserida em uma ponta de pipeta vazia de 200 μL e colocada dentro de um tubo de 500 μL) usando uma centrífuga de bancada a 1.500 × g por 3 min.
      NOTA: Em todas as etapas, não deixe os discos C18 secarem. A secagem interferirá na ligação e eluição do peptídeo. A ponta externa da pipeta de 200 μL (luva) que contém a ponta da pipeta C18 embalada em pequena escala embalada à mão pode precisar ser encurtada cortando ~ 1 cm da extremidade para garantir que o conjunto de duas pontas no tubo se encaixe corretamente na centrífuga.
   8. Equilibre os discos adicionando 0,1% de FA e centrifugando como acima.
   9. Aplique a solução peptídica, reconstituída em 20 μL de 0,1% de AG, diretamente na parte superior dos discos empilhados.
   10. Centrifugue a 1.500 × g por 5 min para facilitar a ligação do peptídeo aos discos C18.
   11. Lave os peptídeos ligados passando 40 μL de 0,1% de FA pela coluna.
   12. Eluir peptídeos com 40 μL de ACN a 70% contendo 0,1% de FA. Armazene os peptídeos eluídos em tubos de baixa ligação a -80 ° C até a análise LC-MS / MS. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
3. Nano-LC acoplado à análise MS usando DIA
   1. Concentre o eluato peptídico dessalinizado usando centrifugação a vácuo (por exemplo, 20-30 min em RT, 1.000 × g), deixando uma pequena gota. Reconstitua os peptídeos em 10 μL de 0,1% de FA em água de grau LC-MS pipetando para cima e para baixo suavemente e brevemente vórtice. Gire para baixo brevemente para coletar o líquido no fundo do tubo antes de prosseguir.
   2. Analisar alíquotas de 4 μL da amostra de peptídeo reconstituído por nano-LC-MS/MS. Separar os péptidos numa coluna de fase inversa auto-embalada (75 μm ID × 2 cm, resina C18, dimensão de partícula de 3 μm) mantida a 50 °C. Preparar a coluna com uma bomba de pressão²⁸ embalando uma pasta de resina C18 (em metanol, 1:3 v/v) num capilar de sílica fundida com uma ponta de pulverização integrada de 10 μm (360 μm OD × 75 μm ID × ponta de 10 μm). Faça a interface da coluna por meio de ionização por nanospray com um espectrômetro de massa híbrido de alta resolução (tipo quadrupolo Orbitrap) que suporta fluxos de trabalho DIA.
      NOTA: Recomenda-se um comprimento de coluna de 20 cm, pois fornece separação ideal para misturas de peptídeos geradas a partir de fatias de gel SDS-PAGE.
   3. Manter a coluna analítica a 50 °C utilizando um forno de coluna ou um bloco de aquecimento para assegurar uma retenção e separação consistentes dos peptídeos. Garanta um controle de temperatura estável durante toda a corrida, pois as flutuações podem afetar a reprodutibilidade.
   4. Eluir peptídeos usando um gradiente linear de 3-40% ACN em 0,1% FA durante 110 min, a uma taxa de fluxo de 250 nL / min. Este gradiente fornece separação de peptídeos eficaz antes da detecção de EM. O tempo total de análise, incluindo o equilíbrio da coluna, é de 120 min.
   5. Adquira dados no modo DIA usando um MS de alta resolução, conforme descrito anteriormente²⁹.
      1. Defina as varreduras de pesquisa MS1 completas a serem adquiridas no modo de perfil com uma resolução de 120.000 (a m/z 200), em uma faixa de varredura de 300-1650 m/z. Siga cada varredura MS1 com fragmentação MS2 de 30 janelas precursoras sequenciais (364-1370 Th) usando um esquema de janela de isolamento deslizante.
      2. Execute a fragmentação usando energias de colisão normalizadas escalonadas de 25,5, 27,0 e 30,0. O estado de carga do precursor máximo padrão é 4. Defina a primeira massa fixa em varreduras MS/MS para 200 Da e adquira espectros MS2 com uma resolução de 30.000.
      3. Use uma configuração de tempo de injeção automática para MS2 e um tempo máximo de injeção de 60 ms para MS1. Para varreduras MS1 e MS2, defina o alvo de íons (AGC) como 3e6.
4. Quantificação relativa de interactomas capturados por afinidade
   NOTA: Para quantificar as proteínas identificadas nas análises DIA-MS de interactomas de epichaperoma capturados por afinidade, use uma plataforma de software que suporte fluxos de trabalho DIA e forneça quantificação confiável com base na intensidade do peptídeo ou contagens espectrais. Este protocolo usou MaxQuant (por exemplo, versão 2.5.1.0) e seu fluxo de trabalho MaxDIA^20,29 para identificação de peptídeos/proteínas e quantificação baseada em intensidade sem marcador. As pesquisas usaram uma estratégia de chamariz de sequência reversa com 1% de FDR nos níveis de PSM/peptídeo e proteína; As entradas "Reverso" e "Contaminante potencial" foram filtradas antes da bioinformática. Nenhum pico foi usado; A prontidão do instrumento foi verificada com 250 ng de digestão HeLa (e mistura intermitente de 10 fmol 6 proteínas) atendendo aos critérios internos de estabilidade ID e RT.
   1. Analise dados brutos de DIA-MS com parâmetros consistentes em todas as amostras. Inclua até duas clivagens perdidas e defina as modificações da seguinte forma: fixa, carbamidometilação da cisteína; oxidação da metionina e acetilação da proteína N-terminal.
   2. Use uma biblioteca espectral prevista in silico com base no banco de dados de proteínas humanas UniProt (por exemplo, ~ 20.000 entradas), garantindo que as sequências de chamariz e contaminante sejam incluídas para uma estimativa precisa da taxa de descoberta falsa (FDR). Especificar a digestão tríptica, a menos que tenha sido utilizada uma enzima alternativa. Uma biblioteca espectral humana validada (com base na versão UniProt de 18/06/2020, 20.956 entradas) está disponível no repositório³⁰ do Instituto Max Planck de Bioquímica.
      NOTA: Como alternativa a esse fluxo de trabalho com bibliotecas previstas, a etapa 3.4 ilustra o processamento sem biblioteca, que produziu identificação e quantificação comparáveis nesses conjuntos de dados.
   3. Quantifique as abundâncias de proteínas usando valores de intensidade (intensidades de quantificação não livres de rótulo [LFQ]), pois são mais apropriados para análises de rede de PPI a jusante. Certifique-se de que o LFQ esteja desmarcado para evitar artefatos de normalização, que podem distorcer os dados de enriquecimento de afinidade. Em vez disso, use valores brutos de intensidade derivados de correspondências espectrais de peptídeos, que refletem a força da interação em vez da expressão global da proteína. Aplique critérios de filtragem apropriados (por exemplo, mínimo de um peptídeo único por grupo de proteínas) para melhorar a confiabilidade da identificação e quantificação de proteínas. Exporte a tabela de intensidade de proteína resultante para análises estatísticas e baseadas em rede subsequentes.
      NOTA: Ao contrário dos fluxos de trabalho proteômicos padrão, onde os valores de LFQ ajudam a normalizar o carregamento de proteínas em lisados inteiros, aqui as proteínas são enriquecidas por meio da captura de afinidade de epichaperomas. Esta etapa de enriquecimento introduz uma variação biológica que a normalização do LFQ pode obscurecer. Portanto, os valores de intensidade bruta são preferidos, pois refletem melhor as interações diferenciais proteína-epichaperoma entre as condições e preservam o sinal necessário para a análise no nível da rede a jusante (por exemplo, dfPPI). Em estudos anteriores usando pesquisas baseadas em mascotes^16,18, os valores de contagem espectral MS / MS também foram usados no lugar de intensidades. Em fluxos de trabalho de captura de afinidade como este, as contagens espectrais refletem a frequência de interação e são adequadas para identificar proteínas que interagem diferencialmente entre condições. Ao contrário dos valores de LFQ, as contagens de MS/MS não assumem normalização global em todo o proteoma, preservando a variação biologicamente significativa da etapa de enriquecimento do epichaperoma.

3. Identificação de proteínas por LC-MS/MS com digestão de proteínas no grânulo

1. Digestão no grânulo
   NOTA: Para garantir a recuperação ideal de proteínas e minimizar a perda de amostras durante a digestão de proteínas no grânulo para análise de EM, é essencial usar tubos de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas. Esses tubos são projetados para reduzir a absorção de proteínas nas paredes do tubo, melhorando assim a recuperação da amostra. Todos os reagentes usados nesta seção devem ser preparados recentemente usando água e produtos químicos de qualidade LC-MS. Se enviar amostras para um núcleo proteômico, verifique as políticas locais, pois algumas instalações podem exigir que todos os tampões sejam esterilizados por filtro antes do uso.
   1. Remova qualquer PBS residual que possa permanecer no tubo da etapa 1.4.6. Ressuspenda os grânulos em 80 μL de uréia 2 M, recém-preparados em 50 mM ABC, pH 8,5. Garanta a mistura completa por pipetagem ou vórtice breve.
      NOTA: Ajuste o volume proporcionalmente com base na quantidade e no tipo de contas. Este protocolo é otimizado para 40 μL de pasta de PU.
   2. Adicione TDT para obter uma concentração final de 1 mM.
      NOTA: Prepare uma solução fresca de DTT 10 mM a partir de uma solução estoque de DTT 1 M em água de grau LC-MS imediatamente antes do uso, pois o DTT é propenso à oxidação na solução. Adicione o volume necessário diretamente à amostra e misture delicadamente pipetando.
   3. Tampe o tubo e incube a 37 ° C por 30 min com agitação a 1.100 rpm em um agitador orbital aquecido. Feche bem as tampas para minimizar a evaporação.
   4. Adicionar IAA para atingir uma concentração final de 3,67 mM. Incubar no escuro em RT por 45 min com agitação a 1.100 rpm.
      NOTA: Prepare um estoque fresco de IAA 10 mM em água de grau LC-MS imediatamente antes de usar. Adicione o volume necessário à amostra e misture delicadamente pipetando.
   5. Adicione DTT adicional para extinguir o IAA não reagido, atingindo uma concentração final de 3,67 mM. Misture delicadamente pipetando.
      NOTA: A extinção do IAA não reagido evita a alquilação excessiva, o que pode comprometer a atividade da protease e a eficiência da digestão. Prepare o DTT fresco e calcule o volume com base no volume de amostra atual para atingir a concentração alvo.
   6. Adicione 750 ng de 0,5 mg / mL de protease Lys-C de grau MS à amostra. Incubar a 37 °C durante 1 h com agitação a 1.150 rpm.
      NOTA: Prepare o Lys-C dissolvendo-o em água de grau LC-MS. Armazenar alíquotas enzimáticas a -80 °C e evitar congelamentos e descongelamentos múltiplos.
   7. Adicione 750 ng de 0,5 mg / mL de tripsina de grau sequencial recém-preparada. Incubar durante a noite a 37 °C com agitação a 1.150 rpm. Incubar não mais do que 16-18 h para evitar a digestão excessiva e a degradação dos peptídeos.
   8. No dia seguinte, centrifugue a amostra a 1.000-5.000 × g por 1-5 min em RT e transfira o sobrenadante pipetando para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Descarte as contas.
   9. Ajuste o pH do digesto para menos de 3 adicionando 50% de ácido trifluoroacético (TFA) gota a gota. Verifique o pH usando tiras indicadoras de pH.
      NOTA: A faixa de pH típica deve ser ~ 2,5-3,0 e as amostras devem ser acidificadas antes da dessalinização.
      CUIDADO: O TFA é corrosivo e volátil. Adicione um exaustor e use equipamento de proteção individual (EPI) adequado.
2. Dessalinização de peptídeos
   NOTA: Para dessalinização e limpeza de peptídeos, use ponteiras de pipeta cheias de C18 em pequena escala (ou seja, StageTips)³¹. Prepare as C18 StageTips embalando três camadas de material C18 (por exemplo, discos de extração em fase sólida C18) em uma ponta de pipeta de 200 μL. Colunas giratórias C18 pré-fabricadas e disponíveis comercialmente também podem ser usadas. Siga o protocolo do fabricante para condicionamento, carregamento de amostras e eluição de peptídeos. O desempenho (por exemplo, eficiência de retenção, rendimento de recuperação) pode variar entre dispositivos caseiros e comerciais. As ponteiras de pipeta com C18 em pequena escala devem ser embaladas firmemente para evitar o fluxo de desvio.
   1. Condicione as ponteiras de pipeta embaladas com C18 em pequena escala sequencialmente com: (1) 100 μL de metanol. Centrifugar a 400 × g e rejeitar o escoamento; (2) 100 μL de 70% ACN/0,1% TFA. Centrifugar a 400 × g e rejeitar o escoamento; (3) 100 μL de TFA a 0,1%. Centrifugar a 400 × g e rejeitar o escoamento. Repita esta etapa duas vezes.
      NOTA: O condicionamento garante umedecimento total da resina C18 hidrofóbica. Para colunas giratórias C18 pré-fabricadas e disponíveis comercialmente, também podem ser usados coletores de vácuo. Os usuários devem consultar as instruções do fabricante para obter recomendações específicas de manuseio.
   2. Carregue o digestor de peptídeo acidificado nas ponteiras de pipeta condicionadas em pequena escala embaladas com C18, pipetando lentamente a amostra diretamente na ponteira. Centrifugar a 300 × g para permitir que o digestor passe através da resina e rejeitar o fluxo. Se o volume da amostra exceder a capacidade, carregue em várias rodadas.
      NOTA: Pipete o digesto diretamente no leito de resina embalado, evitando bolhas de ar. Se estiver usando ponteiras de baixa retenção, toque na parede interna das ponteiras de pipeta com C18 em pequena escala para liberar o líquido lenta e uniformemente.
   3. Pipete 100 μL de FA a 0,1% diretamente na ponta da pipeta embalada com C18 em pequena escala, garantindo que a solução sature totalmente o material C18. Centrifugar a 400 × g e rejeitar o escoamento. Repita esta etapa duas vezes para remover sais e substâncias interferentes.
      NOTA: Certifique-se de que o líquido flua totalmente através do material C18 antes de cada centrifugação. Evite prender bolhas de ar dispensando a solução de lavagem lentamente pela parede da ponta da pipeta.
   4. Eluir os peptídeos ligados pipetando 50 μL de 70% de ACN/0,1% de AG na ponta da pipeta em pequena escala com C18. Centrifugar a 300 × g e recolher o eluído num tubo de microcentrífuga limpo e de baixa ligação. Repita esta etapa duas vezes para garantir a eluição completa.
      NOTA: Várias rodadas de centrifugação podem ser necessárias para recuperar totalmente o eluato. Se o líquido residual permanecer preso na base da ponteira, bata suavemente na ponteira da pipeta em pequena escala com C18 ou faça breves giros adicionais para coletar o volume restante. Combine os eluatos e verifique o volume final antes de prosseguir.
   5. Congele e seque os peptídeos eluídos usando um concentrador a vácuo até secar. Certifique-se de que a tampa esteja frouxa para permitir a ventilação, mas evite respingos.
   6. Reconstitua os peptídeos secos adicionando 12 μL de 0,1% de FA em água de grau LC-MS diretamente no fundo do tubo. Suavemente vórtice e sonicar os tubos para dissolver totalmente os peptídeos.
      NOTA: Certifique-se de que todo o pellet ou filme seco esteja totalmente reconstituído. A dissolução baseada em pipeta corre o risco de perda de peptídeos devido à aderência às superfícies da ponta.
   7. Sonicar os peptídeos reconstituídos por 5 min em um sonicador de banho cheio de água fria para garantir a dissolução completa e evitar o superaquecimento.
   8. Centrifugue os peptídeos a 20.000 × g a 4 °C por 10 min. Transfira o sobrenadante peptídico para um frasco amostrador automático apropriado para carregar no sistema LC-MS. Use frascos de polipropileno testados para cromatografia gasosa (GC) de baixo volume e alta qualidade com tampas de septo de silicone/politetrafluoretileno (PTFE) coladas para minimizar a perda de amostra. Rotule os frascos claramente com o ID da amostra e a ordem de injeção.
   9. Estimar a concentração de peptídeos utilizando um espectrofotómetro a 280 nm. Observe que isso é aproximado e pode ser afetado pelo teor de resíduos aromáticos ou contaminantes. Como alternativa, use ensaios de peptídeos colorimétricos para uma quantificação mais precisa.
3. Parâmetros LC e MS
   NOTA: Os seguintes parâmetros LC e MS são otimizados para o sistema nano-LC acoplado ao espectrômetro de massa usado no protocolo atual. Para outros sistemas nano-LC e espectrômetros de massa, os parâmetros devem ser ajustados de acordo.
   1. Prepare as fases móveis semanalmente para garantir a compatibilidade LC-MS e minimizar a contaminação: (1) Fase Móvel A: Adicione 1 mL de FA de grau LC-MS a 1 L de água de grau LC-MS e (2) Fase Móvel B: Adicione 1 mL de FA de grau LC-MS a 1 L de ACN de grau LC-MS.
      NOTA: Use apenas solventes e ácidos de grau LC-MS. Prepare ambas as fases em garrafas de vidro limpas e desgaseifique se exigido pelo sistema LC. Descarte as fases não utilizadas semanalmente para evitar o crescimento ou degradação microbiana.
   2. Instale uma coluna capilar de sílica fundida de 25 cm de comprimento e 75 μm de diâmetro interno preenchida com partículas de fase reversa C18 de 1,7 μm.
      NOTA: Manuseie as colunas com cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar ou danificar o material de embalagem. Siga as instruções do fabricante para instalação e equilíbrio da coluna.
   3. Condicione a coluna aumentando gradualmente a vazão de 50 nL/min para 300 nL/min usando 3% de Fase Móvel B.
      NOTA: Esta etapa garante que a fase estacionária seja devidamente umedecida e equilibrada antes da injeção da amostra. Monitore a pressão da coluna durante o aumento da vazão. Picos repentinos de pressão podem indicar bolhas de ar ou bloqueio da coluna. O equilíbrio pode ser considerado completo quando a pressão basal se estabiliza.
   4. Manter a temperatura da coluna a 50 °C para garantir um desempenho cromatográfico óptimo.
   5. Injete 100 ng de um digestor tríptico de células HeLa como um padrão de controle de qualidade (CQ) para avaliar o desempenho do sistema.
      NOTA: Esta injeção de CQ serve como referência para avaliar a consistência do tempo de retenção de LC, a sensibilidade de MS e a cobertura do proteoma em todas as execuções. Compare as contagens de identificação de proteínas, a reprodutibilidade do tempo de retenção e a intensidade do sinal com um conjunto de dados de CQ de referência para confirmar a prontidão do sistema antes de analisar amostras experimentais. Use padrões comerciais de digestão HeLa preparados em concentrações conhecidas para reprodutibilidade entre experimentos.
   6. Empregue uma eluição gradiente de 2% a 35% da fase móvel B durante 90 min a uma taxa de fluxo de 300 nL / min. O gradiente de 90 minutos fornece separação de peptídeos de alta resolução adequada para proteomas complexos. Seguindo o gradiente, mantenha a 95% da Fase B Móvel por 7 min para lavar a coluna.
      NOTA: Inclua uma etapa de reequilíbrio (por exemplo, retornar a 2% B por 10-15 min) antes da próxima injeção para garantir a reprodutibilidade da coluna entre as execuções. Evite mudanças abruptas de gradiente, que podem afetar a estabilidade do tempo de retenção e a forma do pico.
   7. Realize a análise de MS usando um espectrômetro de massa equipado com uma fonte de ionização por eletrospray compatível com nanofluxo (por exemplo, estilo CaptiveSpray).
      NOTA: A fonte de íons CaptiveSpray fornece eletrospray estável em baixas taxas de nanofluxo, aumentando a eficiência e a sensibilidade da ionização. Para laboratórios que usam espectrômetros de massa alternativos, ajuste os parâmetros de aquisição e ionização de acordo. Garanta o ajuste e a calibração adequados antes da análise para manter a precisão e a resolução. Posicione o emissor de pulverização corretamente e monitore a estabilidade da pulverização durante a execução para evitar quedas de sinal.
   8. Utilize um método diaPASEF de aquisição independente de dados³². Para usuários não familiarizados com o diaPASEF, consulte a documentação técnica do fabricante ou protocolos recentes que descrevem os fluxos de trabalho de espectrometria de mobilidade de íons aprisionados (TIMS)-DIA³³ para otimizar para diferentes tipos de amostra ou comprimentos de gradiente.
      NOTA: diaPASEF combina TIMS com DIA para aumentar a velocidade e a sensibilidade do sequenciamento, alinhando íons precursores e fragmentos na dimensão de mobilidade³⁴. Certifique-se de que o dispositivo TIMS esteja devidamente calibrado e sincronizado com o quadrupolo para evitar o desalinhamento da mobilidade iônica e das janelas de massa.
   9. Use as seguintes configurações do instrumento: (1) Faixa de massa: 100 a 1700 m/z; (2) Faixa de mobilidade iônica: 0,60-1,60 V · s / cm²; (3) Energia de colisão: 20-59 eV, rampa; (4) Tempo de rampa: 100 ms; (5) Tempo de acumulação: 100 ms; (6) Faixa de massa para diaPASEF: 400-1201 Da; (7) Largura da janela de massa: 26 Da com 1 sobreposição Da; (8) Número de passos de massa por ciclo: 32; (9) Tempo de ciclo: ~ 1,8 s
      NOTA: Essas configurações são otimizadas para equilibrar a profundidade de cobertura e a velocidade de digitalização. Pequenos ajustes (por exemplo, largura da janela ou número de etapas) podem ser necessários dependendo da complexidade da amostra, comprimento do gradiente e desempenho do sistema LC-MS. Alcançar a identificação de mais de 7.500 proteínas para o digesto HeLa indica o desempenho ideal do sistema. O número de identificações pode variar de acordo com o instrumento e deve ser avaliado de acordo.
   10. Carregue 300-400 ng de amostra de peptídeo por injeção para evitar sobrecarregar a coluna analítica. A sobrecarga pode levar ao alargamento do pico, supressão de íons e reprodutibilidade reduzida. Confirme a concentração de peptídeos antes da injeção usando um espectrofotômetro ou ensaio de peptídeos colorimétricos para evitar variabilidade entre as corridas.
   11. Execute injeções em branco entre grupos de amostra para evitar transferência. Use 100% de fase móvel A (água com 0,1% de FA) como branco de injeção. Isso libera os peptídeos residuais da coluna e reduz a contaminação entre as execuções. Monitore os íons de linha de base e de fundo para confirmar a limpeza adequada.
4. Análise de dados do DIA
   1. Use um software adequado que suporte a análise de dados usando o fluxo de trabalho directDIA³⁵ e o processamento sem biblioteca de dados proteômicos do DIA. Realize a identificação e quantificação de proteínas com base em um banco de dados UniProt FASTA³⁶, com parâmetros de pesquisa padrão e configurações de quantificação padrão.
      NOTA: Todos os parâmetros, incluindo especificidade enzimática, configurações de modificação, limites de FDR e saídas pós-análise, são detalhados no Arquivo Suplementar 1. Plataformas alternativas de análise DIA, como DIA-NN³⁷ , também podem ser usadas se suportarem fluxos de trabalho e saídas semelhantes.
   2. Execute o directDIA sem biblioteca com cortes de valor q correspondentes a 1% FDR nos níveis de precursor, peptídeo e grupo de proteínas; excluir identificações de iscas antes da análise a jusante.
      NOTA: Nenhum padrão iRT foi adicionado; o desempenho foi comparado com execuções de resumo HeLa em relação a critérios predefinidos de identificação e estabilidade do tempo de retenção.

Resultados

Após a execução bem-sucedida do protocolo, os usuários devem obter conjuntos de dados de interação de alta qualidade adequados para análise dfPPI downstream. A identificação de proteínas é realizada a partir de dados de DIA a 1% FDR (PSM e níveis de proteína), e a quantificação usa intensidades brutas ou contagens espectrais de MS/MS (não LFQ). As assinaturas de CQ esperadas incluem: agrupamento apertado de replicados técnicos por PCA, CVs médios de precursores/proteínas de aproximadamente 10-12%, agrupamento hierárquico impulsionado pela origem biológica em vez de replicar e enriquecimento robusto em nível de via em g:Profiler/Reactome.

Geração de sonda PU-bead e validação de atividade antes do uso

Os grânulos de PU são preparados acoplando um análogo de molécula pequena de ligação ao epichaperoma à agarose ativada por NHS, conforme descrito anteriormente²⁵. Um pacote de resina padrão de 25 mL produz ~ 25 mL de grânulos de PU armazenados como uma pasta 1: 1 em isopropanol. Alíquota em tubos de baixa ligação e armazene a -20 °C, protegida da luz (por exemplo, embrulhe em papel alumínio). Nessas condições, um lote permanece estável por ≥12 meses. Antes de usar, remova o isopropanol e equilibre os grânulos no tampão de ligação nativo (etapa 1.3). Cada lote é qualificado na síntese e periodicamente a partir de então, usando dois ensaios (Figura 2): (i) Especificidade biológica - realizar pull-downs combinados de um lisado alto de epichaperoma (por exemplo, MDA-MB-468) e um lisado de baixo epichaperoma (por exemplo, ASPC1) sob condições idênticas (40 μL de pasta de grânulos com 250 μg de proteína total; 3 h a 4 ° C; lavagens nativas), eluir / desnaturar e immunoblot para HSP90, HSC70 e HOP. Aceitação: forte enriquecimento na amostra alta do epichaperômio com sinal mínimo na amostra baixa; relações banda-intensidade comparáveis a um lote de referência (±20-30%). (ii) Capturas paralelas de perfil de carga global de um lisado de alto epichaperômio com grânulos de PU versus grânulos de controle inertes correspondentes, volumes de eluído iguais de carga em SDS-PAGE e coloração de Coomassie. Aceitação: Os grânulos de PU mostram uma carga rica e de alto peso molecular com fundo mínimo na faixa do grânulo de controle. Um lote de 25 mL suporta ~600 capturas a 40 μL por amostra; Aposente-se muito se a especificidade ou o perfil da carga não for aceito após a relavagem/reequilíbrio.

Resultados representativos de protocolos em gel e no grânulo

Em uma comparação piloto direta em células MDA-MB-468 com alto teor de epichaperoma, os fluxos de trabalho no gel e no grânulo produziram interactomas altamente concordantes: 4.616 de 6.333 proteínas (73%) foram compartilhadas no nível do grupo de proteínas, com 1.275 (20%) detectadas apenas pelo gel e 442 (7%) apenas pelo grânulo. A concordância no nível da via foi ainda maior: entre 860 termos do Reactome, 727 (85%) eram comuns, com 81 (9%) exclusivos para o gel e 52 (6%) exclusivos para o grânulo. As intensidades medianas de proteína foram ~ 3× mais altas para o gel do que para o grânulo, consistente com a concentração de eluição do gel, mas isso não afetou materialmente a concordância da via.

Exemplo em escala de coorte e assinaturas de CQ

Como exemplo, analisamos doze amostras biológicas (Figura 3). Quatro amostras foram eluídas e processadas por digestão em gel; oito amostras foram submetidas à purificação por afinidade de complexos epichaperomas seguida de digestão em esferas e nano-LC-MS/MS em duplicata técnica. As assinaturas de CQ esperadas foram observadas: agrupamento apertado de réplicas técnicas por PCA, CVs médios de precursores/proteínas de ~ 10-12%, agrupamento hierárquico impulsionado pela origem biológica em vez de replicar e enriquecimento robusto no nível da via em g:Profiler/Reactome. Esses resultados ilustram a reprodutibilidade entre os componentes do fluxo de trabalho, ampla detecção de proteínas engajadas no epichaperoma e interpretabilidade funcional clara de interagentes diferenciais no nível da via. Os enriquecimentos de vias derivados de ambos os fluxos de trabalho corresponderam às nossas saídas de dfPPI publicadas para esta linha, validadas por vários ensaios ortogonais bioquímicos e funcionais¹⁷.

Qualidade do material de entrada e digestão

Um gel SDS-PAGE corado com Coomassie representativo é mostrado para quatro das amostras processadas por digestão em gel (Figura 3A). O gel ilustra a captura reprodutível de proteínas e a distribuição consistente de bandas entre as pistas, confirmando o enriquecimento bem-sucedido de complexos proteicos de lisados nativos antes da espectrometria de massa. Esses perfis de interactoma desnaturados demonstram que a etapa de captura de afinidade produz entrada de proteína suficiente e consistente para análise de MS a jusante.

Os interactomas capturados mostram ampla cobertura de proteínas em pesos moleculares, refletindo o enriquecimento bem-sucedido de conjuntos de proteínas de lisados nativos. Criticamente, essa recuperação não se limita a proteínas abundantes, mas inclui interagentes de menor abundância, fornecendo a complexidade e a profundidade necessárias para a análise em nível de sistema.

Controles e especificidade em escala

Neste fluxo de trabalho, usamos cordões de controle apenas para pré-limpeza (consulte as etapas 1.3 e 1.4); Não realizamos capturas comparativas de rotina de "sonda inerte" em cada bioespécime. Para grandes coortes clínicas, as capturas inertes consomem material precioso, mas agregam pouco valor interpretativo para o dfPPI porque as estatísticas a jusante operam no nível da rede / via, não no nível de uma única proteína. Contaminantes aleatórios ou pegajosos de resina não aparecem de forma coordenada entre os membros da mesma via e, portanto, não sobrevivem a testes de enriquecimento no nível da via ou filtros de consistência em nível de coorte. Na prática, a especificidade é garantida por (i) pré-limpeza, (ii) reprodutibilidade de réplica apertada (PCA/CV) e (iii) estabilidade do caminho através dos limiares e reamostragem. Historicamente, avaliamos experimentos de blocos de captura inerte e concorrente solúvel (PU-H71) e descobrimos que eles não alteraram os resultados da via dfPPI 16,17,21, enquanto consumiam material clínico insubstituível; portanto, nós os reservamos apenas para verificação do piloto. Para grupos que preferem verificações explícitas em nível de execução, observamos que ambas as opções são compatíveis com o protocolo, mas não são necessárias para análises dfPPI em escala de coorte.

Número de replicação

A inferência de caminho no dfPPI é baseada em conjunto e não requer um número de replicação fixo. Com aquisições robustas, uma única amostra por condição pode produzir chamadas de caminhos exploratórios. Para análises confirmatórias, recomendamos ≥3 réplicas biológicas por condição para células cultivadas (com injeções duplicadas de LC-MS/MS quando viável) e Ns apropriado para coorte para tecido humano (normalmente ≥5-10 por grupo para descoberta, maior se estratificado por covariáveis). Avaliamos a estabilidade por agrupamento replicado (PCA), CV precursor mediano (alvo ~ 10-15%) e bootstrap / reamostragem dos resultados de enriquecimento.

Reprodutibilidade técnica entre execuções

A reprodutibilidade técnica foi avaliada usando análise de componentes principais (PCA) (Figura 3B) de dados de intensidade de peptídeos de amostras digeridas no grânulo (oito cérebros murinos, executados em duplicata). As réplicas agruparam-se firmemente para cada amostra biológica, enquanto diferentes amostras se separaram de forma limpa ao longo dos dois primeiros componentes principais. Os dois primeiros componentes principais explicaram 28,6% e 22,0% da variância total, respectivamente, e distribuíram as amostras de acordo com as diferenças biológicas e não com o ruído técnico. Essa estrutura reflete alta consistência analítica e confirma que o método preserva diferenças biologicamente relevantes, o que é fundamental para permitir que o dfPPI detecte a religação de rede específica da condição.

Consistência da detecção entre amostras

As distribuições de coeficiente de variação (CV) para intensidades de íons precursores demonstram que a grande maioria das características fica abaixo de 20% CV, com valores medianos variando de 9,7% a 11,9% em todas as condições (Figura 3C). Esses resultados confirmam a detecção consistente de EM e a recuperação de peptídeos entre as replicações.

Faixa dinâmica e cobertura de proteoma

O agrupamento hierárquico dos valores de abundância de proteínas transformadas em log (Figura 3D) mostrou forte separação de amostras e preservação da variação entre amostras, ao mesmo tempo em que refletiu a ampla faixa dinâmica capturada nas execuções de MS. As intensidades de proteína abrangeram de interagentes de baixa abundância a grupos de proteínas altamente enriquecidos, conforme visualizado pelo gradiente de azul a amarelo. Os dados confirmam que o protocolo permite a detecção de diversos conjuntos de proteínas e interagentes, capturando componentes centrais e periféricos.

Interpretação funcional via dfPPI

Para apoiar a interpretação e a reprodutibilidade, fornecemos dois recursos complementares para análises de conjuntos de dados dfPPI: (i) um aplicativo da web Shiny interativo (https://epichaperomics.mskcc.org/ atualizado para https://dfppi.mskcc.org) e (ii) fluxos de trabalho abertos e programáveis e arquivos de sessão do Cytoscape lançados com estudos anteriores de dfPPI (GitHub / Zenodo) ^{38 , 39 , 40 , 41}. O aplicativo ingere tabelas de intensidade bruta ou contagem espectral de MS/MS, realiza controle de qualidade (agrupamento de replicações, verificações de valores ausentes), tratamento opcional de ruído/lote (regressão de covariável), identifica proteínas diferencialmente engajadas e fornece leituras de via/rede por meio de gráficos interativos e relatórios para download - sem a necessidade de codificação.

O dfPPI trata as intensidades medidas ou contagens espectrais como proxies para o "engajamento do epichaperoma". Os usuários selecionam um modelo de conectividade diferencial (DC) que varia de um teste t bicaudal simples (padrão) a modelos lineares com reconhecimento de covariável; a etapa DC também pode ser ignorada. Após a DC, os usuários definem limites de alteração de dobra e valor p (os padrões espelham o trabalho anterior do dfPPI; por exemplo, FC > 1,0, p nominal ≤ 0,25) para passar os candidatos ao enriquecimento. Dois mecanismos de enriquecimento estão disponíveis: GSEA baseado em classificação (em estatísticas assinadas) e super-representação (hipergeométrica) via g:Profiler com correção de vários testes. Para um contexto centrado em chaperonas, o pipeline também fornece Análise de Enriquecimento de Intertoma (iEA) para testar se os interagentes diretos das proteínas de andaime de chaperonas estão super-representados entre as proteínas diferencialmente engajadas. As visualizações de rede ponderam nós/bordas por tamanho de efeito e/ou suporte estatístico, permitindo a visualização de religação coordenada em vez de efeitos de proteína única. Para usuários que preferem fluxos de trabalho com script, o código R subjacente e os arquivos de sessão do Cytoscape usados para construir mapas e figuras de rede estão disponíveis publicamente (por exemplo, GitHub/Zenodo)^38,39,40,41 com as publicações associadas 17,18,19,20 e podem ser executados localmente ou adaptados para novos conjuntos de dados.

Um corte permissivo (mudança de dobra > 1,0; p nominal ≤ 0,25) é recomendado para reter os sinais de estado de interação introduzidos pelo enriquecimento de afinidade. Em seguida, mudamos o controle estatístico para o nível da via: as proteínas candidatas são testadas para enriquecimento em ontologias selecionadas (por exemplo, GO, Reactome) usando g:Profiler, e os valores p da via ajustada por vários testes determinam a significância e a classificação. Esse design reflete o objetivo do dfPPI - detectar a religação coordenada da rede, não a expressão diferencial de uma única proteína - e evita a normalização em todo o proteoma que pode obscurecer os sinais de enriquecimento em conjuntos de dados suspensos. Conforme mostrado em estudos anteriores de dfPPI^17,20, limiares de nível de proteína mais brandos produzem chamadas de via estáveis e relevantes para a doença, enquanto outros modelos (por exemplo, modelos lineares com encolhimento empírico de Bayes) podem ser usados quando a variância ou as covariáveis de lote o justificam, sem alterar a inferência centrada na via central.

A captura de afinidade inevitavelmente co-enriquece proteínas "pegajosas" (por exemplo, queratinas, proteínas do citoesqueleto, proteínas ribossômicas), e as esferas de PU também podem capturar interagentes chaperonas gerais. No dfPPI, eles não impulsionam a biologia por vários motivos. Primeiro, a pré-limpeza e as lavagens rigorosas removem a maioria dos aglutinantes inespecíficos. Em segundo lugar, os fichários genéricos, incluindo muitos interagentes acompanhantes, mostram mudanças de dobra próximas a 1,0 em todas as condições e/ou detecção inconsistente e, portanto, falham nas telas de valor FC/p. Em terceiro lugar, o enriquecimento da via é baseado em conjuntos e com reconhecimento de antecedentes: a significância é calculada em relação ao proteoma detectado específico do experimento e requer que vários membros da mesma via covariem. Contaminantes aleatórios ou de alta abundância são dispersos em muitos termos e, portanto, não formam enriquecimentos coerentes e significativos para FDR. Nenhum contaminante de proteína - ou não - pode "fazer" uma chamada de caminho. Quarto, o dfPPI interpreta a coerência no nível da rede, não proteínas individuais; as chamadas de via devem sobreviver à correção de vários testes (por exemplo, valores p ajustados por g:Profiler), tamanhos mínimos de conjuntos de genes e consistência de replicação. Juntamente com os preclears de esferas inertes e a filtragem de contaminantes comuns, esta estrutura torna o dfPPI robusto em segundo plano: mesmo que centenas de proteínas não informativas estejam presentes, elas não alteram as classificações das vias porque o enriquecimento depende do número de proteínas concordantes dentro de uma via, não do comprimento total da lista de proteínas. Além disso, todos os estudos publicados sobre dfPPI até o momento corroboraram as previsões em nível de via e rede com extensa validação experimental (por exemplo, bioquímica direcionada, leituras de sinalização, perturbações genéticas ou farmacológicas) ^{16 , 17 , 18 , 19 , 20} , demonstrando que as saídas de dfPPI não são apenas listas de proteínas barulhentas, mas mapas reprodutíveis de disfunção da rede PPI relevante para a doença.

Para avaliar a paisagem funcional capturada pelo conjunto de dados dfPPI da Figura 3D, realizamos uma análise de enriquecimento usando g:Profiler⁴² (Figura 3E). Os resultados demonstram uma cobertura robusta de anotações em todas as principais ontologias funcionais, incluindo processo biológico de ontologia genética (GO-BP), função molecular (GO-MF) e componente celular (GO-CC), bem como recursos de vias selecionadas, como Reactome, KEGG e WikiPathways. Esta análise representativa ilustra um ponto forte da abordagem dfPPI: sua capacidade de revelar associações de vias biologicamente significativas em diversos tipos de anotações, mesmo a partir de tamanhos de amostra relativamente pequenos. A ampla cobertura do Reactome observada aqui provavelmente reflete o fato de que o dfPPI é baseado na religação de redes de proteínas que capturam mudanças no nível de interação de redes de proteínas que mapeiam diretamente em processos multicomponentes e cascatas de sinalização, que estão bem representadas na estrutura do Reactome. Como o dfPPI aproveita as mudanças na conectividade em vez da expressão, ele é particularmente adequado para detectar mudanças funcionais no nível do sistema que podem ser perdidas pela transcriptômica ou proteômica somente de abundância. Essa descoberta se alinha com outros trabalhos em que o Reactome produziu consistentemente os enriquecimentos mais coerentes e relevantes para a doença a partir de conjuntos de proteínas derivadas de dfPPI 14,15,16,17,18,20,21.

O reatoma é organizado em torno de processos e complexos multiproteicos (cascatas de transdução de sinal, módulos do ciclo celular, conjuntos metabólicos). Como o dfPPI enriquece os interagentes engajados no epichaperoma - ou seja, grupos de proteínas que são funcionalmente co-recrutadas em andaimes de doenças - sua saída contém naturalmente módulos de vias coesas em vez de ocorrências isoladas. Essa captura coordenada produz uma cobertura ampla e de alta significância do Reactome em subvias e hierarquias relacionadas. Em contraste, ômicas centradas na abundância (transcriptômica; proteômica global) relatam mudanças de expressão, não estados de interação; AP-MS de isca única ou rotulagem de proximidade fornecem bairros locais em torno de uma isca projetada de cada vez; e a reticulação/co-fracionamento geralmente fornecem conectividade esparsa. Nenhum deles, sozinho, produz rotineiramente os conjuntos de nível de sistema selecionados pelo contexto que o dfPPI retorna de uma única captura endógena em células ou tecidos. O resultado é o enriquecimento da via que é amplo (vários ramos do Reactome se iluminam) e mecanicamente coerente (as proteínas mudam juntas porque suas interações - não apenas suas quantidades - são reconectadas por epichaperomas). No entanto, notamos que o dfPPI é complementar, não um substituto: cada método interactômico tem pontos fortes e limitações distintas, e a escolha ideal (ou combinação) deve ser orientada pela questão biológica, restrições de amostra e a resolução necessária.

Juntos, esses resultados confirmam que o protocolo produz conjuntos de dados reprodutíveis e biologicamente informativos que podem ser usados para descobrir a remodelação do interactoma diferencial em estados de doença ou perturbações experimentais. A saída dfPPI é adequada para integração com estruturas de enriquecimento de vias e permite o mapeamento de eventos de religação funcional não detectáveis por métodos padrão baseados em abundância.

Figura 1: Visão geral da plataforma dfPPI. (A) A plataforma dfPPI (Interactoma Proteína-Proteína Disfuncional) permite a identificação de disfunções da rede PPI específicas da doença por meio de um fluxo de trabalho quimioproteômico. A Seção 1 envolve a preparação da amostra e a captura do interactoma usando sondas químicas direcionadas ao epichaperoma imobilizadas em matrizes de afinidade (por exemplo, esferas de PU). As seções 2 e 3 descrevem dois fluxos de trabalho de digestão compatíveis - no grânulo ou em gel - seguidos por LC-MS / MS sem rótulo para identificação do interactoma. Análises computacionais, incluindo modelagem estatística e enriquecimento de vias, são realizadas usando o pipeline de bioinformática dfPPI, que não é abordado neste protocolo, mas está disponível gratuitamente em https://epichaperomics.mskcc.org/. (B) Princípio do dfPPI. Em contextos relevantes para doenças, os epichaperomes endógenos formam andaimes supramoleculares que reorganizam as redes de PPI. Sondas químicas dirigidas por epichaperoma (por exemplo, esferas de PU ou equivalente) capturam esses andaimes junto com seus interagentes ligados diretamente de células intactas ou de lisados nativos, produzindo um pull-down de várias iscas em um único experimento. Controles combinados (por exemplo, controle de esferas inertes e/ou competição com sonda livre) podem ser processados em paralelo. O material capturado é eluído e digerido no grânulo ou no gel, analisado por LC-MS/MS, e as proteínas são quantificadas (intensidade ou contagens espectrais de MS/MS). O interactoma resultante é usado para calcular interagentes diferenciais entre condições e para realizar o enriquecimento de via/rede, revelando disfunção PPI específica do contexto no nível dos sistemas. O fluxo de trabalho não requer marcação genética ou superexpressão, é compatível com células e tecidos e pode ser dimensionado para estudos de coorte. Por outro lado, o MS tradicional de purificação de afinidade se concentra em uma isca marcada de cada vez, produzindo uma vizinhança local por construção e normalmente exigindo muitas construções/execuções para amostrar uma rede. Em contraste, o dfPPI usa epichaperomas endógenos como isca, capturando muitos PPIs disfuncionais simultaneamente do sistema nativo, o que acelera a descoberta de religações de rede específicas da doença e fornece leituras no nível da via a partir de uma única captura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Validação do lote de PU e especificidade de captura. (A) Especificidade biológica e consistência lote a lote. As células MDA-MB-468 (epichaperoma-alto) e ASPC1 (epichaperoma-baixo) foram lisadas em tampão nativo (20 mM Tris, pH 7,4; 20 mM KCl; 5 mM MgCl₂; 0,01% NP-40; inibidores de protease/fosfatase). Para cada captura, 40 μL de pasta de PU foram incubados com 250 μg de proteína total (1 μg/μL) por 3 h a 4 °C com rotação. As contas foram lavadas em tampão nativo; os complexos foram desnaturados/eluídos em ~ 100 μL de tampão de amostra SDS. 5-10 μL de cada eluato foram resolvidos por SDS-PAGE e imunoblotted para HSP90, HSC70 e HOP. Os lisados de entrada são mostrados para referência. Dois lotes de PU (Lote 1, fresco; O lote 2, envelhecido) produz forte enriquecimento em MDA-MB-468 e sinal mínimo em ASPC1, demonstrando especificidade e consistência de lote preservadas. (B) Carga global versus contas de controle. Os lisados MDA-MB-468 foram processados como em (A) com grânulos de PU ou grânulos de controle correspondentes. ~ 20 μL de cada eluato foram carregados, separados por SDS-PAGE e corados com Coomassie. Os grânulos de PU recuperam uma carga complexa e de alto MW característica de conjuntos ligados a epichaperomas, enquanto os grânulos de controle mostram um fundo mínimo. Marcadores de peso molecular (kDa) são indicados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultados representativos da captura de afinidade dfPPI, identificação de interactoma e análises de bioinformática. (A) Gel SDS-PAGE corado com Coomassie de proteínas eluídas de capturas de afinidade de PU-bead de interactomas ligados a epichaperoma de quatro amostras representativas de cérebro humano (PT1-PT4). Os conjuntos de proteínas ligados a grânulos foram desnaturados por fervura em tampão de amostra SDS, resolvidos por SDS-PAGE e corados para avaliar a recuperação do interactoma em pesos moleculares. Cada amostra foi carregada em uma pista separada, com uma pista vazia entre as amostras para minimizar a contaminação cruzada; Um sinal fraco ocasionalmente observado nessas faixas vazias reflete um pequeno transbordamento de amostra durante a eletroforese. Esses géis são representativos de amostras submetidas à instalação de MS, onde cada pista foi seccionada em cinco fatias para digestão em gel e identificação de proteínas por MS. (B) A análise de componentes principais (PCA) das intensidades de proteína identificadas a partir de interactomas de epichaperoma digeridos no grânulo de oito amostras representativas de cérebro murino (executadas em duplicata) revela um agrupamento apertado de réplicas técnicas e uma separação biológica clara ao longo de PC1 e PC2. Isso confirma alta reprodutibilidade técnica e variância biológica suficiente para uma análise robusta do dfPPI. A estrutura de dados demonstra que as diferenças de nível de interação - não artefatos técnicos - impulsionam a separação da amostra, fornecendo uma base sólida para a modelagem de interactoma diferencial a jusante sem a necessidade de normalização artificial. (C) As distribuições do coeficiente de variação (CV) para intensidades de íons precursores nos oito grupos de amostra mostram variância consistentemente baixa, com CVs medianos variando de 9,7% a 11,9% (indicados por linhas tracejadas verticais). Esses baixos CVs destacam a reprodutibilidade e a robustez do pipeline de detecção e quantificação de MS. A consistência suporta o uso de intensidade bruta ou valores de MS/MS como entradas confiáveis para análise de dfPPI, onde a variação na força de interação - não a expressão global de proteínas - é o sinal biológico de interesse. (D) Mapa de calor de agrupamento hierárquico de valores de intensidade de proteína transformada em log₂ em todas as amostras (com duplicatas técnicas mostradas). As amostras se agrupam por origem biológica em vez de se replicarem, confirmando a captura robusta de interactomas ligados ao epichaperoma e a preservação da variância biologicamente relevante. A ampla faixa dinâmica e a detecção consistente em todas as proteínas suportam ainda mais a qualidade do conjunto de dados para análise de dfPPI. A barra de escala representa os valores de intensidade da proteína transformada em log₂, variando de 2 (azul, baixa abundância) a 14 (amarelo, alta abundância). (E) Gráfico de Manhattan da análise de enriquecimento da via realizada em proteínas de interação diferencial identificadas por dfPPI. O enriquecimento foi conduzido usando g:Profiler, e os termos significativos são plotados por −log₁₀(valor-p), coloridos pela fonte de anotação: GO Molecular Function (GO:MF), GO Biological Process (GO:BP), GO Cellular Component (GO:CC), KEGG, Reactome, WikiPathways e Human Phenotype Ontology (HP). Esta saída representa a utilidade central do dfPPI: descobrir vias funcionais biologicamente significativas perturbadas pela remodelação do interactoma orientada por epichaperoma. A ampla cobertura de anotações ressalta a visão em nível de sistema alcançável por meio dessa abordagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Método	O que ele captura	Principais pontos fortes	Principais limitações	Uso típico	Escalabilidade (coortes)
AP-MS (purificação de afinidade – MS)	Interagentes diretos/quase diretos de uma única isca	Alta especificidade; quantitativo; bom para composição complexa	Requer isca/etiqueta/anticorpo; uma isca de cada vez; pode perder transitório/fraco	Definir parceiros de uma proteína de interesse	Baixo-moderado (muitas iscas necessárias)
Rotulagem de proximidade (por exemplo, variantes BioID/APEX)	Proteínas nas proximidades em nanoescala de uma isca ao longo do tempo	Captura vizinhos transitórios/fracos; funciona em células vivas	Engenharia genética; rotulagem fora do alvo; com muitos parâmetros	Mapas de bairros locais; dinâmica	Baixo-moderado (engenharia por isca)
XL-MS (MS de reticulação)	Proximidades/contatos espaciais dentro/entre proteínas	Restrições estruturais; captura contatos transitórios	Análise complexa; menor amplitude do proteoma; específico da amostra	Topologia estrutural/contextual	Baixo (especializado)
Co-fracionamento/MS (CF-MS)	Co-eluição de assemblies nativos	Sem marcação; assemblies nativos	Trabalhoso; inferência complexa; sensibilidade limitada	Cenário global complexo	Moderado
CETSA/TPP	Perfis de co-estabilidade/co-agregação	Sem rótulo; Condições nativas	Indireto para IBPs; Restrições de solubilidade	Engajamento do alvo; Deslocamentos térmicos	Moderado
dfPPI (epichaperômica)	Religação de interação em nível de rede capturada por epichaperomas endógenos como iscas multiplex	Endógeno; sem marcação; uma captura interroga milhares de IBPs disfuncionais; leituras de vias/redes; compatível com tecidos; Adequado para coortes	Aplicável apenas ao contexto da doença; sondas especializadas (PU-grânulos, YK5-B); não se destina à descoberta complexa genérica	Remodelação do interactoma doença-contexto, priorização de vias, geração de hipóteses	Alta (centenas de amostras viáveis)

Tabela 1: Comparação das abordagens de mapeamento de PPI e dfPPI. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: Configurações completas dos parâmetros do Spectronaut. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O protocolo descrito aqui permite o mapeamento de PPIs disfuncionais em amostras biológicas nativas usando a plataforma dfPPI. Ao contrário dos métodos tradicionais que inferem a disfunção a partir de mudanças de abundância ou expressão, esta plataforma captura a religação da rede no nível estrutural, isolando interagentes específicos da doença por meio da purificação de afinidade com sondas direcionadas ao epichaperoma, seguidas por MS quantitativo baseado em intensidade sem marcador. Embora a aplicação atual se concentre no tecido cerebral post-mortem, o método é amplamente aplicável a outros tipos de amostras e modelos de doenças, incluindo células e tecidos cultivados de modelos de câncer, neurodegeneração e disfunção imunológica 16,17,18,19,20,22,23.

O dfPPI depende de sondas que selecionam cineticamente epichaperomes e prendem os assemblies com seus interagentes ligados. Os grânulos de PU (derivados de quimiotipos de ligação ao epichaperoma, como PU-H71 / PU-AD) envolvem epichaperomas nucleados por HSP90 de forma não covalente, mas com longo tempo de residência, uma marca registrada de seletividade cinética para a conformação do epichaperoma em relação aos complexos de chaperonas convencionais²³. YK5-B é uma sonda covalente biotinilada direcionada para HSC70 dentro de epichaperomas, permitindo a captura na célula antes da lise e preservando PPIs endógenos¹⁷. A seletividade decorre de PTMs associados a doenças que remodelam as conformações HSP90 / HSC70 e a química da bolsa e estabilizam os conjuntos de epichaperome 14,23,43,44; essas mudanças produzem alta afinidade, ligação lenta_{k off} para sondas não covalentes do tipo PU⁴⁵ (e permitem a captura covalente com YK5-B direcionado por HSC70), retendo cineticamente os complexos de epichaperoma e co-isolando seus interagentes diretos e indiretos para LC-MS / MS. Na prática, os grânulos de PU são ideais para fluxos de trabalho de lisado/homogeneizado, enquanto o YK5-B suporta captura de células vivas; ambos retêm assemblies dependentes do contexto que podem ser identificados por LC-MS/MS e usados para análise dfPPI downstream.

Para dfPPI, é necessário conhecimento especializado em química para sintetizar as sondas de captura. No entanto, esse requisito não é exclusivo do dfPPI: métodos de PPI amplamente utilizados (AP-MS, rotulagem de proximidade, XL-MS) também dependem de habilidades especializadas - por exemplo, iscas marcadas de clonagem / engenharia, geração de linha celular estável, otimização de rotulagem / reticulação e pipelines bioinformáticos complexos. Em contraste, o dfPPI evita a manipulação genética e a superexpressão de iscas, opera diretamente em células ou tecidos nativos (incluindo bioespécimes clínicos escassos) e usa fluxos de trabalho padrão de captura de afinidade e LC-MS já rotineiros em núcleos proteômicos. Para reduzir as barreiras de adoção, grânulos de PU validados e grânulos de controle combinados estão disponíveis via MTA do laboratório de quiose, e as etapas de manuseio/controle de qualidade são totalmente especificadas nas etapas 1.3 e 1.4. Por fim, a análise é suportada por um aplicativo dfPPI baseado na web que implementa as estatísticas necessárias e as leituras de caminho/rede, reduzindo a carga de bioinformática (ou seja, para usuários sem experiência em codificação e apenas habilidades básicas de bioinformática).

AP-MS, XL-MS, rotulagem de proximidade, co-fracionamento e CETSA / TPP respondem a perguntas diferentes (ligantes diretos, proximidade espacial, rotulagem de vizinhança, co-montagem ou co-estabilidade térmica). O dfPPI é o método de escolha quando o objetivo é mapear a religação endógena dependente do contexto na doença - especialmente em tecidos nativos ou grandes coortes clínicas onde a marcação genética não é viável e quando as leituras em nível de via / rede de uma única captura são desejadas. O dfPPI usa epichaperomes como iscas multiplex para capturar mudanças de interação coordenadas em muitas proteínas em um pull-down, permitindo a identificação escalável de LC-MS/MS e análise centrada na via do material primário. Na prática, o dfPPI pode semear a jusante, validação focada em isca (por exemplo, AP-MS em nós específicos), enquanto os métodos tradicionais podem refinar a topologia (contatos diretos, restrições espaciais) para complexos destacados pelo dfPPI. Consulte a Tabela 1 para uma comparação lado a lado.

Várias etapas críticas influenciam o sucesso do fluxo de trabalho. Primeiro, extratos de proteína de alta qualidade são essenciais. Isso requer o manuseio cuidadoso de tecidos ou células - idealmente congelados e armazenados a -80 ° C - para minimizar a proteólise e preservar os complexos nativos. A inclusão de inibidores de protease e fosfatase não é negociável: a integridade do epichaperoma, que atua como a "isca" funcional neste ensaio, depende de modificações pós-traducionais específicas de componentes principais, como HSP90^23,43. Por exemplo, a fosforilação de Ser226 e Ser255 é essencial para estabilizar a conformação do epichaperoma e preservar sua função de andaime²³. A omissão de inibidores da fosfatase corre o risco de colapso estrutural e perda de especificidade biológica.

Outro determinante importante é a qualidade e o manuseio da matriz de afinidade dos grânulos de PU. Os grânulos devem ser armazenados em isopropanol a 100% a -20 °C e usados dentro de uma janela de atividade definida, idealmente dentro de 1-2 anos. A atividade deve ser validada antes de experimentos críticos, pois os grânulos envelhecidos podem exibir capacidade de ligação reduzida ou aumento de interações inespecíficas. O tempo de incubação e a entrada de proteínas também devem ser otimizados: a incubação excessiva pode elevar o fundo, enquanto a entrada insuficiente de proteínas pode comprometer a profundidade de detecção. Recomendamos incubações de 3 h e pull-downs piloto para calibrar a entrada apropriada para cada tipo de amostra.

Duas estratégias de digestão são compatíveis com este protocolo: no grânulo e no gel. Embora ambos os fluxos de trabalho produzam resultados reproduzíveis, cada um oferece compensações. A digestão em gel pode introduzir contaminantes como a queratina e requer etapas adicionais de manuseio. A digestão no grânulo agiliza o fluxo de trabalho e geralmente é preferida quando o rendimento da amostra ou a quantidade de entrada são limitantes. No entanto, as quantidades de protease devem ser calibradas com base na entrada total de proteínas: embora o método seja projetado para 750 ng de tripsina, pode ocorrer digestão incompleta se os níveis de proteína forem altos, levando a clivagens perdidas e recuperação reduzida de peptídeos. É aconselhável avaliar a eficiência da digestão e ajustar a entrada enzimática de acordo. Todas as etapas de digestão devem ser realizadas em tubos de baixa ligação usando reagentes recém-preparados e livres de contaminação para garantir a consistência e minimizar o fundo.

A carga de proteína por injeção de LC-MS depende do fluxo de trabalho de captura, do rendimento de peptídeos e da capacidade da coluna. Para digeridos no grânulo analisados em colunas nano-LC C18 padrão (~ 50-75 μm ID, ~ 15-25 cm), normalmente carregamos 300-500 ng por injeção; Não observamos ganhos de desempenho acima de ~ 400-500 ng, enquanto cargas mais altas correm o risco de supressão de íons e alargamento de pico. Para fluxos de trabalho em gel (por exemplo, cinco fatias por pista), geralmente injetamos ~ 25% do material dessalinizado por fatia por réplica e retemos ~ 50% como backup para reinjeção, se necessário. Em todos os casos, meça a concentração de peptídeos antes da injeção, verifique a resposta linear com um resumo de CQ e ajuste a carga para que a forma do pico cromatográfico e a profundidade de identificação sejam mantidas sem sobrecarga.

A quantificação sem marcação via DIA é amplamente utilizada em proteômica devido à sua reprodutibilidade e profundidade⁴⁶. No entanto, no contexto de experimentos de captura de afinidade como este - onde o objetivo é identificar proteínas interagindo com andaimes de epichaperome em vez de medir a abundância global de proteínas - estratégias de normalização como MaxLFQ não são apropriadas. Essas abordagens assumem entrada uniforme e similaridade em todo o proteoma, que são violadas pela etapa de enriquecimento intrínseca a este protocolo. Em vez disso, os valores de intensidade ou as contagens espectrais de MS/MS fornecem quantificação suficiente e biologicamente significativa para a análise funcional a jusante. Essas métricas refletem a força de interação relativa ou a frequência das proteínas com epichaperomas em todas as condições. Conforme demonstrado em estudos anteriores 16,17,18,20, esses valores são adequados para análises de interactoma em nível de sistemas, como dfPPI, que identificam vias biológicas alteradas sem depender da normalização em todo o proteoma. Ao preservar a verdadeira variância biológica introduzida pela doença ou tratamento, a quantificação baseada em intensidade ou MS/MS permite um mapeamento preciso e robusto das disfunções da rede PPI.

Embora a captura de afinidade reduza o espaço de busca em comparação com o lisado inteiro, os pull-downs dfPPI ainda contêm centenas a milhares de proteínas abrangendo uma ampla faixa dinâmica, além de fundo co-enriquecido. Para comparações em escala de coorte, a seleção de precursores estocásticos do DDA leva a valores ausentes de corrida a execução e amostragem variável de interagentes de baixa abundância¹⁸. O DIA fragmenta sistematicamente todos os íons em janelas predefinidas, fornecendo maior profundidade, menos valores ausentes e propriedades de reprodutibilidade run-to-run mais altas que são cruciais quando a inferência downstream é no nível da via/rede, em vez de uma única proteína. É por isso que padronizamos o DIA para dfPPI.

Tal como acontece com todos os métodos de captura de afinidade, a ligação inespecífica a proteínas é uma consideração inerente. As proteínas podem ser retidas devido à viscosidade da resina, alta abundância ou agregação. Embora esses interagentes não específicos possam aparecer no eluído pull-down, sua presença não prejudica o objetivo analítico a jusante deste protocolo¹⁷. O fluxo de trabalho dfPPI não foi projetado para definir interações binárias, mas sim para extrair padrões de religação de PPI no nível dos sistemas. As análises de enriquecimento funcional são realizadas em interagentes diferenciais e aproveitam as estatísticas baseadas em rede para revelar alterações coordenadas no nível da via. Conforme demonstrado em trabalhos anteriores¹⁷, essa abordagem em nível de sistema minimiza o impacto de proteínas inespecíficas isoladas e permite que conclusões biológicas robustas surjam de dados em nível de coorte.

Em comparação com as abordagens convencionais de mapeamento de interactoma - como co-imunoprecipitação, rotulagem de proximidade ou reticulação - a plataforma dfPPI oferece uma vantagem distinta: ela captura a remodelação funcional do interactoma sob condições relevantes para a doença sem exigir engenharia de isca ou superexpressão. Como o método isola complexos de proteínas formados em torno de epichaperomas supramoleculares, ele detecta conjuntos de proteínas emergentes que não estão presentes em sistemas saudáveis, permitindo a descoberta de novos condutores de doenças. A abordagem é escalável e adaptável em tecidos, espécies e estados de doença, e já forneceu insights exclusivos sobre a remodelação do proteoma no câncer e na neurodegeneração. Como tal, este método oferece uma ferramenta poderosa para descobrir redes funcionais interrompidas em doenças humanas.

Além dos exemplos aqui, o dfPPI está bem posicionado para (i) grandes coortes clínicas estratificarem pacientes por disfunção de rede e descobrirem biomarcadores farmacodinâmicos que relatam o envolvimento do alvo e a correção da via; (ii) amostragem longitudinal (por exemplo, pré/pós-terapia, estadiamento da doença) para rastrear trajetórias de religação e prever respondedores; (iii) integração com fosfoproteômica e outras ômicas com reconhecimento de PTM para vincular mudanças de estado de interação à sinalização upstream; (iv) capturas espacialmente resolvidas de regiões microdissecadas (interfaces tumor-normais, sub-regiões cerebrais) para mapear a patobiologia da rede local; (v) telas de perturbação (genéticas ou compostas) onde as leituras de dfPPI nomeiam nós acionáveis e mecanismos de ação; e (vi) modelagem de gráfico/IA que aprende características de rede específicas da doença a partir de mapas dfPPI para prognóstico e design terapêutico. Metodologicamente, a miniaturização, a automação (por exemplo, formatos de 96 poços) e o controle de qualidade padronizado permitirão pipelines de alto rendimento para estudos translacionais e ensaios clínicos. Finalmente, as saídas do dfPPI podem semear acompanhamentos direcionados - AP-MS, XL-MS ou rotulagem de proximidade - para resolver a topologia de módulos priorizados, ressaltando a complementaridade do método dentro do kit de ferramentas interactômica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250	Tóxico, Combustível
Acetonitrilo (ACN) Optima	Fisher Scientific & nbsp;	A955-1	Grau LC/MS (Inflamável)
Mídia de cromatografia de afinidade ativada Affi-Gel 10	Bio-Rad	1536099	Usado para fabricar contas de PU e contas de controle (Inflamável)
Bicarbonato de Amônio (ABC)	Sigma-Aldrich	09830-500G
Coluna UHPLC Aurora Ultimate 25x75 C18	IonOpticks	AUR3-25075C18-CSI
Filme autoradiográfico	EWEN-PARKER X-RAY CORP	EBA45	Alternativa para a detecção de sinais quimioluminescentes após Western blot
Biomasher micro homogeneizador de tecidos	DWK Ciências da Vida Kimble	7496250010	Usado para homogeneizar tecido cerebral congelado para extração de proteínas
Azul de bromofenol	Biorreagente Fisher	BP115-25
Centrífuga para tubos de 1,5 mL	Eppendorf	5424
Centrífuga para tubos de 1,5 mL	Eppendorf	5417R	Com controle de temperatura
Centrífuga para tubos de 15-50 mL	Eppendorf	5810R	Uso para tubos cônicos
Sistema de imagem ChemiDoc MP	Bio-Rad	17001402	Usado para densitometria de gel/blot
Forno de coluna	Sonation GmBH, Alemanha	ES071/ES072	Mantém a coluna nanoLC em 50 e graus; C de retenção consistente
Tubos cônicos (15 mL)	Fisher Scientific	352096
Esferas de controle	Laboratório de Quiose	N/A	Taldone et al. (PMID:  21459002)
Coloração Coomassie G-250 (Bio-segura)	Bio-Rad	1610786
Tubos Eppendorf escuros (1,5 mL)	USA Scientific	1415-2507
Ditiotreitol (DTT)	Roche	10197777001	Irritante
NLC 1000 fácil	Thermo Fisher Scientific	NLC 1000 fácil	Sistema LC usado com Q Exactive HF
Discos de extração em fase sólida Empore	Companhia 3M	2215-C18 (Octadecílo)	Usado para preparar StageTips para dessalinização de peptídeos; Ativado com 100% de metanol
Kit de quimioluminescência aprimorada (ECL)	Thermo Fisher Scientific	32209
Tubos Eppendorf (1,5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Ácido Fórmico (FA) Optima	Fisher Scientific	A117-10X1AMP	Grau LC/MS
g:Profiler (e111_eg58_p18_f463989d)	Grupo BIIT-Tartu & Uuml; likool	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost	Enriquecimento de vias
Glicerol	Biorreagente Fisher	BP229-1	Grau em biologia molecular
Glicina	Biorreagente Fisher	BP381-5	Pó cristalino
Anticorpo secundário conjugado com HRP anti-camundongo (RRID: AB_2619742)	Sothern Biotech	1030-05	Secundário para o anticorpo H90-10
Anticorpo secundário conjugado com HRP anti-coelho (RRID: AB_2632593)	Sothern Biotech	4010-05	Secundário para o HSP90 e alfa; e anticorpos HOP
Anticorpo secundário conjugado com HRP anti-rato de cabra (RRID: AB_2716837)	Sothern Biotech	3030-05	Secundário para o anticorpo HSC70
Agitador orbital aquecido	Eppendorf	TermoMisturador C (2231001127)
HeLa proteína digerir standard-Pierce	Thermo Fisher Scientific	88329	Utilizado para avaliação de QC LC-MS
Anticorpo HOP (RRID: AB_10828378)	Sinalização de Celular	5670	Para controle de qualidade de contas de PU
Anticorpo HSC70 (RRID: AB_10617277)	Enzo	SPA-815	Para controle de qualidade de contas de PU
Anticorpo HSP90 (H90-10) (RRID: AB_854214)	StressMarq	SMC-107	Para controle de qualidade de contas de PU
Anticorpo alfa HSP90 (RRID: AB_303423)	Abcam	Ab2928	Para normalização conforme a Seção 1.2
Linha celular humana: ASPC1 (RRID:CVCL_0152)	ATCC	CRL-1682	Linha celular de controle, epichaperoma baixo/acompanhante alto
Linha celular humana: MDA-MB-468 (RRID: CVCL_0419)	ATCC	HTB-132	Linha celular de controle, epichaperoma alto/acompanhante alto
ImageJ (v1.54p)	Wayne Rasband	https://imagej.net/ij/	Densitometria
Iodoacetamida (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Tóxico
Tubos microcentrífugas de baixa ligação a proteínas	Sarstedt	72.706.600
Protease Lys-C	Promega	VA1170	Grau LC/MS
Cloreto de Magnésio	Sigma-Aldrich	63068	Grau em biologia molecular
MaxQuant (v2.1.1.0)	Instituto Max-Planck de Bioquímica	https://www.maxquant.org/	Fluxo de trabalho MaxDIA para identificação de peptídeos/proteínas e quantificação baseada em intensidade sem marcação
Metanol	Fisher Chemical	A454-4	Grau HPLC, inflamável, tóxico
Mini comprimido de coquetel inibidor de protease (Completo)	Roche	4693124001
Célula de Transferência Eletroforética Mini Trans Blot	Bio-Rad	1703930
Mini-gel de eletroforese & nbsp;	Thermo Fisher Scientific	A25977	Usado para géis pré-moldados Novex
Célula de Eletroforese Tetra Vertical Mini-PROTEAN	Bio-Rad	1658004	Usado para géis proteicos pré-moldados Mini-PROTEAN ou géis fundidos à mão
Mini-PROTEAN  Gels de proteína pré-fabricados TGX (4– 20%)	Bio-Rad	4561094
NanoDrop	Agilent	BioTek Sinergia H1	Usado para estimar a concentração de peptídeos antes da injeção de LC-MS
NanoElute 2	Bruker	https://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdf	Usado no fluxo de trabalho diaPASEF
Fonte Nanospray Flex	Thermo Fisher Scientific	ES071	Para acoplamento ESI de nanospray
Novo Objetivo PicoTip Emmiter/PicoFrit SELF/P	New Objective Inc.	PF360-75-10-N-5	Compactado com pasta C18 até 20 cm de comprimento
Membrana de nitrocelulose	Cytiva Amersham	10600006
Leite desnatado	Laboratório Científico	M0841
Géis pré-fabricados Novex 8% Tris-Glycine	Thermo Fisher Scientific	XP00080BOX
NP-40	Roche	11754599001
Soro salino tamponado com fosfato (PBS)	Gibco	10010023
Comprimido de coquetel inibidor de fosfatase PhosSTOP	Roche	4906837001
Kit de ensaio de proteína Pierce BCA	Thermo Fisher Scientific	23225
Recipientes plásticos	Fisher Scientific	FB0875711A
Balanço plataforma	Corning	6705
Cloreto de potássio	Biorreagente Fisher	BP366-1	Cristais Brancos
Fonte de Alimentação Universal PowerPac	Bio-Rad	1645070
Proteína Proteica Caleidoscópica Precision Plus Proteína Padrão Prestained	Bio-Rad	1610375
Contas de PU-	Laboratório de Quiose	N/A	Taldone et al. (PMID:  21459002)
Q Espectrômetro de massa HF Exativo Orbitrap	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdf	Usado para DIA-MS
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 & micro; m	Dr. Maisch GmbH, Alemanha	R13.aq	Mídia de sílica para separação peptídica; Pasta de pó/Metanol (1:3, v/v)
Unidade de rotação (rotador de ponta a ponta)	Barnstead  Internacional	400110
Cartuchos Sep-Pak C18 (100 mg)	Waters Corporation	WAT023590
Dodecilsulfato de sódio (SDS)	Biorreagente Fisher	BP166-500	Grau de eletroforese
Sonicator	Branson	2510
Leitor de Microplacas Multi-Modo SpectraMax Paradigm	Dispositivos Moleculares	Paradigma SpectraMax
Spectronaut	Biognosys	https://biognosys.com/software/spectronaut/	Fluxo de trabalho directDIA
Concentrador SpeedVac	Thermo Fisher Scientific	Savant SPD111V
Vácuo de sucção	Saúde Cardinal	CDL-65651-320
Espectrômetro de massa TimsTOF HT	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.html	Usado para análise diaPASEF
Óptimos do Ácido Trifluoracético (TFA)	Sigma-Aldrich	T6508-10AMP	Grau LC/MS (Corrosivo, combustível)
Tris	Biorreagente Fisher	BP152-5	Pó cristalino; Grau em biologia molecular
Tris, pH 6,8 (1 M)	Teknova	T1068
Tris, pH 7,5 (1 M)	Biorreagente Fisher	BP1757-500	Grau em biologia molecular
Buffer de soro fisiológico trís-tamponado (20x colheres de sopa)	VWR, Ciências da vida	97064-338
Tris-Glicina-SDS (TGS 10x) funcionando com tampão de gel	Biorreagente Fisher	BP13414	Eletroforese
Tripsina	Promega	V5111	Classificação de sequenciamento
Tripsina Ouro	Promega	V5280
Tween 20	Biorreagente Fisher	BP337-100
Ureia	Sigma-Aldrich	U0631-500G
Vórtice	Fisher Scientific	02-215-414
Água	Fisher Scientific	W6-1	Grau LC/MS