Modelo Multilaboratório da Rede de Avaliação Pré-clínica do AVC Tromboembolico com Trombólise: TE-MCAo

Resumo

Para simular o AVC tromboembólico, êmbolos preparados a partir de sangue heterólogo de rato foram injetados na artéria cerebral média, seguidos pela administração de trombólise sistêmica para recanalização. Esta versão do modelo é otimizada para uso em uma rede multilaboratório e suporta o teste de múltiplos candidatos terapêuticos.

Resumo

Modelos atuais de AVC translacional em roedores induzem oclusão da artéria cerebral média (MCAo) usando filamentos de náilon, êmbolos injetados, trombina intraluminal ou endotelina-1 perivascular para simular AVC humano. Entre esses métodos, a injeção de tromboembolia seguida de trombólise imita melhor os eventos neuroinflamatórios observados em pacientes humanos e pode ser preferível ao método de filamento de náilon inerte mais amplamente utilizado. Os modelos tromboembólicos padrão, usados em laboratórios únicos líderes, no entanto, podem ser demorados, produzir resultados variáveis e exigir considerável habilidade para serem dominados. Para abordar essas limitações, desenvolvemos um modelo MCAo tromboembólico que mira a oclusão vascular e utiliza trombólise intravenosa para alcançar a recanalização, paralelamente à trombólise sistêmica aplicada em cenários clínicos. Para reduzir o número de animais, desenvolvemos um método para armazenar sangue de animais doadores para preparação posterior de êmbolos em múltiplos sujeitos. Nossa utilização de microcateteres Doccol pré-fabricados simplifica a preparação e a injeção de trombos ao pré-carregar tromboembolos nos microcateteres, que são então inseridos na artéria carótida interna. Para alcançar a recanalização, infundimos Tenecteplase intravenosa em uma dose de 1,5 mg/kg. Para promover a reprodutibilidade, preparamos e testamos em campo procedimentos operacionais padrão, vídeos de treinamento e oficinas práticas de treinamento cirúrgico. O modelo utiliza uma abordagem cirúrgica padrão que deve ser familiar para todos os pesquisadores que utilizam o modelo amplamente aceito de filamento de náilon. A passagem do microcateter para a artéria carótida interna distal, evitando a artéria pterigopala, é realizada de maneira semelhante à inserção de filamento de náilon. A recuperação e as avaliações pós-AVC podem ser feitas com protocolos comportamentais, radiográficos e histológicos típicos. Esse modelo oferece uma abordagem prática, reprodutível e acessível para pesquisadores que buscam um modelo MCAo tromboembólico com recanalização controlada.

Introdução

O AVC é uma das principais causas de morte e incapacidade no mundo¹. Muitos pacientes se beneficiam da trombolise intravenosa, e alguns pacientes selecionados se beneficiam da trombectomia mecânica. Como nem todos os pacientes chegam ao hospital a tempo para trombolise ou trombectomia, e como nem todos se beneficiam da recuperação completa, ainda existe uma necessidade considerável de desenvolvimento adicional de terapêuticas cerebroprotetoras adicionais ou complementares. O modelo de AVC isquêmico mais amplamente utilizado em roedores é a oclusão monofilamentosa da artéria cerebral média (MCA), seguida por reperfusão completa. Este modelo simula a oclusão de grandes vasos (LVO), modelando pacientes com AVC grande que passam por trombectomia mecânica completa bem-sucedida. No entanto, esse modelo captura uma pequena porcentagem dos AVCs clínicos. Em contraste, mais pacientes sofrem AVCs tromboembólicos secundários à aterosclerose (ruptura in situ de placa aterosclerótica ou atero-embolo por doença sistêmica), e são tratados apenas com trombólise sistêmica, que o modelo de nylon não consegue^{replicar 2,3}. Além disso, o modelo MCAo de filamento de nylon não apresenta a cascata inflamatória associada à oclusão trombótica ^4,5. Modelos animais que empregam tromboembolos seguidos de administração trombolítica sistêmica representam a fisiopatologia e a biologia básica que ocorrem em muitos pacientes com^{AVC 4,6}. Até agora, porém, os modelos de AVC tromboembólico em roedores são conhecidos por serem complexos e difíceis de reproduzir. Em laboratórios isolados com especialistas dedicados, um modelo tromboembólico pode ser alcançado com razoável reprodutibilidade. Tal modelo não se presta facilmente ao uso amplo, como necessário em projetos multilaboratório.

Aqui, fornecemos protocolos detalhados para uma oclusão tromboembólica da artéria cerebral média (TE-MCAo) atualizada e padronizada, seguida por um modelo de trombolise sistêmica. Especificamente, simplificamos a preparação do trombo, padronizamos o carregamento de trombos em cateteres e validamos a escalabilidade desse modelo para ensaios multilaboratoriais. Desenvolvemos esse modelo para uso na Rede de Avaliação Pré-clínica de AVC (SPAN). No entanto, pretendíamos que o modelo fosse útil para qualquer rede que buscasse implementar ensaios pré-clínicos de alto volume com novos tratamentos candidatos. Usando nosso modelo padronizado, conseguimos induzir TE-MCAo em 6 ratos por dia por local de estudo durante o período do estudo.

O SPAN e redes similares cresceram em resposta a falhas repetidas e contínuas em traduzir os cerebroprotetores promissores do ambiente pré-clínico para o sucesso na prática^{clínica 7}. Em 2019, os Institutos Nacionais de Transtornos Neurológicos e AVC (NINDS) iniciaram o SPAN⁸. O SPAN visa triar de forma mais eficaz potenciais terapêuticas, minimizando o viés por meio de mascaramento centralizado, randomização e análise automatizada e centralizada de resultados. A SPAN 1 utilizou o modelo de filamento de náilon em suas duas primeiras versões porque todos os laboratórios participantes já o utilizavam, e foi fácil implantar^{o 9}. Para modelar de forma mais fiel muitos aspectos do tromboembolismo e da trombolise, a SPAN buscou criar o modelo TE-MCAo descrito aqui. Esse modelo seria útil para os cirurgiões pré-clínicos que estão fazendo a transição do modelo de filamento de náilon para o modelo TE-MCAo. Recomendamos que laboratórios pré-clínicos confirmem a presença de AVC 24/48 horas após MCAo (ou TE-MCAo) usando uma técnica de imagem, por exemplo, ressonância magnética (RM).

A Rede SPAN foi totalmente descrita em estudos^{anteriores 9}, e todos os Procedimentos Operacionais Padrão (SOPs) do SPAN estão disponíveis no site do SPAN. Em resumo, a rede é gerenciada por um centro coordenador (CC) que cuida da distribuição de medicamentos, controle de qualidade de dados, verificação de adesão ao protocolo e comunicação na rede. Todos os SOPs são elaborados pelo CC e aprovados por um Comitê Diretor após revisão. No SPAN, todos os roedores possuem uma etiqueta auricular compatível com código de barras compatível com ressonância magnética colocada ao chegar aos laboratórios de pesquisa, e todos os participantes são registrados no Banco de Dados Eletrônicos de Captura de Dados de Pesquisa SPAN (REDCap). Os animais são randomizados pelo CC usando tabelas de randomização estratificadas por local e sexo. No SPAN 1 e SPAN 2, terapêuticas supostas foram investigadas quanto à eficácia em seis laboratórios de pesquisa participantes. Todos os medicamentos testais foram embalados em frascos de aparência idêntica, rotulados no centro de coordenação e enviados para laboratórios de pesquisa no início do projeto.

Protocolo

Todos os laboratórios participantes da SPAN, incluindo o centro coordenador da USC, seguiram as diretrizes do NIH e AAALAC para o tratamento humano e ético dos animais. A aprovação da IACUC local foi obtida em todos os locais.

1. Preparação do trombo

NOTA: Todo sangue e trombo devem ser manuseados de acordo com todas as diretrizes institucionais locais para riscos biológicos. Todos os materiais que entram em contato com sangue devem ser descartados como resíduos bio-perigosos ou, no caso de instrumentos cirúrgicos, cuidadosamente limpos e desinfetados por autoclave. Para reduzir o uso de animais doadores neste estudo, desenvolvemos um método para armazenar sangue doado e depois usar sangue para fazer tromboembolos conforme necessário.

1. Retirar sangue fresco de doador de uma artéria para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL ou microtubos de ácido tetraacético etilenediamina (EDTA) pediátrico, enchendo apenas até o nível de 500 μL.
   NOTA: Preferimos a canulação da artéria femoral para nossas coletas de sangue, já que a artéria femoral possui um grande diâmetro luminal que permite cateterismo, é bilateral permitindo 2 coletas separadas e é uma cirurgia sobrevivível para os roedores. Na nossa experiência, o sangue pode ser armazenado a 4 °C por 4 semanas.
2. Adicione 1 mL de solução de_{CaCl 2} (5mg/mL) a 500 μL do sangue armazenado e anticoagulado.
3. Imediatamente após a reversão da anticoagulação com_{CaCl 2}, aspire sangue do tubo da microcentrífuga para um tubo de PE-50 de 100 cm usando sucção suave.
   NOTA: O atraso resultará em coágulos sanguíneos antes que ele possa ser puxado para o tubo do PE-50.
4. Incube o tubo enrolado em soro salino tamponado com fosfato pré-aquecido (PBS) a 37 °C por 2 horas em um forno de mesa.
   NOTA: Colocar a placa de Petri sobre uma placa quente aberta resulta em um resultado inconsistente devido à distribuição inconsistente do calor.
5. Ao final da incubação de 2 horas, transfira imediatamente o tubo de PE-50 cheio de sangue para 4 °C para armazenamento. Ele permanecerá utilizável para os próximos passos, entre 20 e 72 horas.

2. Carregamento de cateter

1. Conecte o tubo enrolado de PE-50 (diâmetro interno: 0,58 mm) a uma seringa de 3 ou 5 cc cheia de soro fisiológico e exija suavemente o trombo para uma placa de Petri contendo PBS.
   NOTA: Isso pode exigir força considerável. Mantenha a pressão no local de conexão para garantir que o cateter e a seringa não se desconectem na extrusão. O cateter PE-50 pode ser cortado em segmentos menores (10-50 cm) se necessário para facilitar a extrusão.
2. Corte seções de trombo de aproximadamente 6 cm de comprimento com uma lâmina de barbear.
3. Lave cada segmento de trombo puxando-o suavemente para dentro de um cateter PE-50 e expelindo-o completamente 5 vezes.
4. Em seguida, lave o trombo puxando-o suavemente para dentro de um cateter PE-10 (diâmetro interno: 0,279 mm) e expelindo-o completamente 15 vezes.
   NOTA: Se houver quebras frequentes durante essa etapa, considere utilizar ampliação com microscópio cirúrgico ou lupa cirúrgica para garantir que o trombo esteja sendo aspirado alinhado com a abertura do cateter.
5. OPCIONAL: Usar o Azul de Evan para visualizar trombos
   1. Prepare Evan's Blue 4% em solução PBS 1x.
   2. Adicione 200 μL do azul de Evan's 4% em uma placa de Petri cheia com 10 mL de PBS 1x. Esta será a solução mais concentrada = Diluição Azul de Evan #1.
   3. Pegue 400 μL da Evan's Blue Dilution #1 e misture em uma placa de Petri separada cheia com 20 mL de 1x PBS. Esta é uma solução diluída do Azul de Evan = Diluição do Azul de Evan #2.
   4. Coloque o coágulo na solução mais concentrada de placa de Petri Evan's Blue (diluição #1) por 1 s e depois transfira para a placa de Petri Evan's Blue diluída (diluição #2).
6. Carregue um trombo lavado em microcateteres pré-fabricados (diâmetro interno: 0,2 mm, diâmetro externo: 0,360 mm, comprimento: 300 mm, conectado ao bloqueio Luer feminino) sem êmbolos de ar usando o método úmido para úmido.
   NOTA: Recomendamos o uso de ampliação (por exemplo, lupas 2,5x) para essa etapa.
7. Quando o trombo estiver totalmente carregado, extruda trombo suficiente para que exatamente 5,0 cm permaneçam no microcateter. Corte o excesso com uma lâmina de barbear.
   NOTA: O comprimento do trombo carregado pode ser adaptado para diferentes aplicações dependendo do tamanho do curso desejado.
8. Marque o microcateter a 16 mm da ponta, para demarcar a extensão do cateter que deve ser avançada intraluminalmente além da bifurcação da artéria carótida comum.

3. Cirurgia e anestesia animal

1. Induzir anestesia com 4% de isoflurano em mistura 30:70 oxigênio:óxido nitroso e manter anestesia com 1-2% de isoflurano na mesma mistura gasosa.
2. Administre analgésicos com carprofeno 5 mg/kg por via subcutânea e atropina 0,05 mg/kg intraperitonealmente para manter o conforto animal durante a cirurgia.
   NOTA: Muitos cirurgiões infundem o local da incisão com 1,0 mL de bupivacaína (2,5 mg/mL).
3. Mantenha a temperatura corporal em 37 ± 0,5 °C durante toda a cirurgia usando uma bolsa térmica controlada por uma sonda de temperatura retal.

4. Coleta de sangue doado

1. Colete sangue doador por cateterismo da artéria femoral. Corresponda ao sexo biológico do doador e dos receptores.
2. Se o sangue for usado no mesmo dia:
   1. Prepare três tubos centrífugos de 1,5 mL. Marque cada tubo na marca de 500 μL com uma caneta de laboratório indelével.
   2. Prepare três conjuntos de tubos de PE-50, cada um com 100 cm de comprimento, presos a uma seringa de 1,0 mL por meio de uma agulha romba calibre 23.
3. Se o sangue for armazenado para uso posterior, prepare seis microtubos EDTA pediátricos. Afrouxe as tampas para facilitar o uso depois.
4. Prepare um tubo PE-50 de 10,0 cm de comprimento, preso em uma extremidade com um grampo calçado com borracha e chanfrado sem embutido na outra extremidade.
   1. Para fazer uma gramposa com calças de borracha, insira uma dente de uma grampa hemostática padrão na tubulação PE-100 e corte para ajustar. Repita do outro lado.
   2. Para tornar o PE-50 com chanfro sem emplastrão, primeiro corte a extremidade em um ângulo chanfrado. Depois, corte a ponta do bisel usando microtesouras.
      NOTA: É importante que a ponta seja removida para evitar perfurar a parede posterior da artéria após a inserção, mas se uma parte muito grande da ponta for removida, a perda do efeito de chanfro dificultará muito a inserção intraluminal.
5. Realize um corte padrão na artéria femoral.
6. Prepare o animal (raspe a parte interna da coxa), posicione-se em reclinação dorsal sobre a mesa cirúrgica. Esterilize a pele com 3 lavagens de etanol a 70% seguidas de 1 lavagem com betadine ou outra solução antisséptica.
7. Prenda as patas traseiras de forma aberta usando restrições macias.
8. Faça uma incisão vertical na parte interna da coxa, com aproximadamente 1,5-2 cm de comprimento, ao longo da dobra natural da interseção inguinal com a perna. Essa incisão será ortogonal ao curso anatômico esperado da artéria femoral.
9. Usando dissecação contundente, dissecar cuidadosamente até os vasos femorais. Separe cuidadosamente a artéria femoral da veia e do nervo que correm no mesmo feixe.
10. Ocluir distalmente a artéria femoral com uma ligadura de seda 5-0 e usar as caudas da sutura para fornecer uma leve tensão distal com hemostatos.
11. Esqueletice a artéria femoral o mais próximo possível, traçando a artéria até sua origem retroperitoneal. Coloque frouxamente um laço de seda 5-0 ao redor da artéria femoral e use novamente as caudas para fornecer tensão suave na extremidade proximal da artéria. Não aperte o nó de seda neste momento. Essa tensão proporcionará hemostasia após a formação da arteriotomia.
    NOTA: O alça pode ser movido mais para o lado próximo com uma pinça de aneurisma.
12. Cerca de 2/3 da distância do laço do ponto proximal, coloque um pedaço de ponto de seda sob a artéria e faça uma pequena arteriotomia distal ao ponto solto usando microtesoura. O ponto solto será amarrado para fixar o cateter intraluminal após a canulação.
13. Usando pinças afiadas, levante a abertura superior da arteriotomia e introduza o cateter obtudo e chanfrado na abertura. Avance o cateter o mais próximo possível.
    NOTA: Pode haver atrito entre o cateter e a parede interna do vaso. Duas coisas podem ajudar nisso: 1) revestir a parte externa da ponta do cateter com fluido seroso vindo de dentro da perna logo antes de introduzi-lo no vaso, e 2) usar pinças sem restrição e sulcos, segurar a parte externa do vaso enquanto avança o cateter ao mesmo tempo. Isso impede que o vaso apenas avance junto com o cateter.
14. Uma vez que a ponta do cateter tenha sido avançada quase até o ponto do laço proximal, libere a tensão das caudas dessa sutura. O sangramento deve ser evitado pelo encaixe apertado do cateter dentro do vaso.
15. Avance o cateter o suficiente para que o laço solto, ao apertar, envolva o cateter. Aperte o ponto suavemente, garantindo que não fique tão apertado que o cateter obstrua. Além disso, certifique-se de que o ponto não esteja no bisel do cateter, dado o tamanho afilado desse segmento do cateter.
16. Solte a grampa com calço de borracha. O cateter deve imediatamente se encher de sangue.
17. Encha os tubos abertos da centrífuga ou os microtubos EDTA pediátricos, colocando no máximo 500 μL em qualquer um dos recipientes de coleta.
18. Uma vez que os microtubos estejam preenchidos, remova o cateter PE-50 da artéria femoral, ligue a extremidade proximal e feche a incisão com sutura interrupta de proleno 5-0.
19. Se o sangue for usado posteriormente, coloque as tampas nos tubos EDTA pediátricos preenchidos e armazene-os a 4 °C.
20. Se o trombo deve ser preparado para uso no mesmo dia, prossiga para o passo 1.2 acima.
21. Repita imediatamente com os tubos da centrífuga restantes.
22. Doadores de sangue arterial podem ser devolvidos ao vivário após a recuperação da anestesia se a cateterização unilateral for realizada. A artéria femoral contralateral pode ser cateterizada posteriormente, mas após cateterização bilateral da artéria femoral, os doadores devem ser eutanasiados conforme as regulamentações da IACUC.

5. TE-MCAo

NOTA: A abordagem TE-MCAo utiliza o corte padrão na artéria carótida comum. A escolha da anestesia e a abordagem de redução ficam a critério do usuário. O protocolo aqui começa no ponto em que o cirurgião já isolou a artéria carótida comum (ACC), a artéria carótida interna (ACI) e a artéria carótida externa (ECA).

1. Expõe o CCA e retrai com uma ligadura de seda 3-0. Faça o mesmo para o ECA e o ICA.
2. Usando uma ligadura ou cauterizado, expor e ocluir a artéria occipital.
3. Expor e retrair ou ocluir a artéria pterigopalatina (PPA).
   NOTA: Com experiência suficiente, essa etapa pode ser omitida. Recomendamos sempre realizar essa etapa ao aprender o procedimento.
4. Usando uma retração suave, mova o ECA e o ICA para uma configuração em "T".
5. Amarre a ligadura CCA somente após todos os passos acima serem concluídos.
6. Faça uma arteriotomia no ECA (Zea Longa CCA Open^{Methodology 10}) usando micro tesoura.
7. Usando o método do bisel contundente descrito no passo 4.4.2, prepare a ponta de um dos microcateteres já carregados (diâmetro interno: 0,2 mm, diâmetro externo: 0,360 mm, comprimento: 300 mm, conectado à trava Luer fêmea).
8. Insira cuidadosamente o microcateter com trombo pré-carregado no ECA. Afrouxe o laço de contenção da ACI e avance o microcateter intracraniano até 16 mm na bifurcação da carótida sob visualização direta para evitar a canulação inadvertida da PPA extracraniana.
   NOTA: Se o cateter preferir entrar na ACC, uma pressão suave com um aplicador pontiagudo de algodão pode ajudar a orientar o cateter avançando para dentro da ACI.
9. Fixe o microcateter intraluminal ao ICA e CCA usando seda 3-0, tomando cuidado para não apertar demais.
10. Injete 20 μL na seringa de 1 mL com uma bomba motorizada de seringa a uma taxa de 10 μL/min por uma duração de 2 min.
    NOTA: Normalmente, a bomba da seringa não avança no início até que a pressão seja suficiente.
11. Injete mais 20 μL de soro fisiológico estéril usando as mesmas configurações da bomba.
    NOTA: Durante o estudo do fluxo sanguíneo usando imagem a laser manchada, tivemos 100% de sucesso com uma lavagem de 20 μL.
12. Remova o microcateter e ligue permanentemente a ECA com uma sutura próxima ao local da arteriotomia. Remova todos os laços de contenção. Observe cuidadosamente qualquer vazamento de sangue e prenda com ligaduras adicionais, se necessário.
13. Feche temporariamente a incisão da pele com grampos ou uma sutura prolene 5-0 em movimento.
14. Retire o animal da anestesia e coloque-o em uma gaiola de recuperação quente.
15. Opcional: Os laboratórios podem usar fluxometria Doppler a laser para confirmar a oclusão bem-sucedida da MCA. Alternativamente, a imagem por ressonância magnética pode ser obtida às 24 ou 48 horas para confirmar e quantificar o infarto cerebral.
    NOTA: Muitos usuários preferem administrar 1,5 mL de solução salina ou de Ringer lactada por via subcutânea ao final da cirurgia.

6. Trombólise Sistêmica

NOTA: Tenecteplase (TNK, 1,5 mg/mL) pode ser adquirida para uso como trombolise sistêmica. Os usuários podem preferir outros agentes líticos. Frascos individuais de 50 mg são reconstituídos com 50 mL de água destilada, e então 2,5 mL são precisamente alicotados em frascos de 3,0 mL. As alíquotas podem ser congeladas a -20 °C para uso posterior. A estabilidade do ativador de plasminogênio recombinante reconstituído armazenado a -20 °C é de 60 dias^{e 11}.

1. Descongele uma alíquota congelada de TNK para cada sujeito. Descongela em temperatura ambiente por cerca de 15 minutos.
2. Usando uma seringa de 1 cc, retire exatamente 1,5 mg/kg. Por exemplo, um rato de 300 g precisará de 0,45 mg.
3. Re-anestesie o animal e remova o fechamento temporário da pele.
4. Exponha qualquer ramo da veia jugular externa.
   NOTA: A veia caudal pode ser usada se o laboratório estiver mais confortável com essa rota. Preferimos usar a veia jugular, já que os cirurgiões SPAN se sentem mais confortáveis com a mobilização externa da jugular, e isso é feito rotineiramente no nosso modelo de filamento.
5. Usando uma agulha de 30 ou 32 G, administre o TNK por perfuração direta na veia.
   NOTA: A princípio, os usuários podem querer isolar a veia entre 3 e 0 laços de seda. Com prática, isso não será necessário.
6. Feche a incisão com proleno 5-0 interrompido ou outra sutura não absorvível.
7. Devolva o animal à gaiola de recuperação conforme no passo 5.14.

7. Métodos estatísticos

1. Para fazer estatísticas descritivas, use média e desvio padrão para dados numéricos normalmente distribuídos, e use intervalos medianos e interquartis para dados não distribuídos normalmente. Apresente dados categóricos como distribuições de frequência. Para testes de hipóteses, aplicar o teste t ou ANOVA conforme apropriado para dados paramétricos normalmente distribuídos; caso contrário, não realize testes de hipótese.

Resultados

Figura 1: Coleta de sangue de animais doadores e preparação de trombo. O sangue era coletado do animal doador por cateterismo da artéria femoral e transferido para um tubo microcentrífuga com (pode ser armazenado até 4 semanas) ou sem EDTA (uso no mesmo dia). Para preparar o trombo, uma solução de cloreto de cálcio foi adicionada aos tubos de sangue armazenados e imediatamente aspirada em um cateter PE-50. O tubo enrolado de PE-50 foi incubado em solução salina tamponada com fosfato pré-aquecido (PBS) a 37°C por 2 horas em um forno de mesa. Após 2 horas, o tubo de PE-50 cheio de sangue era imediatamente transferido para 4°C para armazenamento. Veja a seção 1 do protocolo para mais informações. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Carregando trombo no cateter para injeção. (A) No dia da cirurgia do MCAo, o trombo foi extrudido do tubo do PE-50 para uma placa de Petri contendo PBS. (B) Na placa de Petri, o trombo era cortado para aproximadamente 6 cm de comprimento com uma lâmina de barbear. (C) O trombo era lavado com PBS puxando-o para dentro de um tubo de PE-50 e expelido 5 vezes, e depois para um tubo de PE-10 15 vezes. (D) O trombo foi transferido para uma placa de Petri contendo a solução concentrada de Evan's Blue. (E) O trombo foi transferido para uma placa de Petri contendo solução Evan's Blue diluída e carregado em um microcateter pré-fabricado. (F) O microcateter foi avançado pela artéria carótida interna do rato até que 16 mm da ponta do cateter passou pela bifurcação carótida da artéria carótida comum e foi injetado usando uma bomba de seringa motorizada. Veja a seção 2 do protocolo para mais informações. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura. 

Em um estudo piloto de viabilidade, recrutamos 135 participantes em 6 laboratórios de pesquisa. Embora os participantes tenham sido randomizados para um dos 8 tratamentos, aqui relatamos dados agregados apenas para ilustrar a viabilidade do modelo. De 135 participantes inscritos, a TNK foi administrada na dose e no momento corretos em 132 (98%). A ressonância magnética foi realizada 3 dias após TE-MCAo em 102 (75%) devido à morte de animal antes da ultrassonografia em 33 (24%). A perda de animais antes do Dia 3 foi consistente em todos os 6 laboratórios (Tabela 1), indicando que o modelo pode ser implantado em múltiplos locais. A média ± tamanho do DS das lesões foi de 13 ± 16% (área da lesão inclui isquemia e edema como porcentagem do hemisfério ipsilateral), com alguma variabilidade entre laboratórios (Tabela 2). Imagens representativas de ressonância magnética e êmbolos pós-morte podem ser vistos na Figura Suplementar 1.

	Laboratório
Variável	AG	DK	IW	MG	SD	YL
Tamanho da Amostra (N)	23	30	11	28	24	19
Ressonância magnética feita	19	24	9	23	14	13

Tabela 1: Viabilidade por laboratório. Os laboratórios de estudo eram Augusta University (AG), Duke (DK), University of Iowa (IW), Massachusetts General Hospital (MG), University of San Diego (SD) e Yale University (YL). O número de animais inscritos (N) e o número que sobreviveram para fazer a ressonância magnética foi feita no terceiro dia após o AVC são mostrados. Esses dados apoiam a viabilidade do modelo.

Local	Tamanho da Amostra (N)	Volume da lesão (%) Média ± DS	Índice de Turno Midline (%) Média ± SD
AG	19	11 ± 14	11 ± 12
DK	24	18 ± 17	19 ± 13
IW	9	08 ± 13	13 ± 12
MG	23	09 ± 11	15 ± 17
SD	13	14 ± 21	04 ± 19
YL	12	18 ± 22	14 ± 15

Tabela 2: Volume da lesão observado nas ressonâncias magnéticas do dia 3, por local. Para estabelecer a reprodutibilidade do modelo em seis locais de estudo, o volume da lesão (isquemia mais edema) e o deslocamento da linha média foram comparados. O volume da lesão é expresso como a porcentagem areal do hemisfério ipsilateral. O deslocamento da linha média é expresso como a porcentagem linear da largura máxima do espaço intracraniano. Os dados confirmam a heterogeneidade entre os laboratórios.

Figura Suplementar 1: Imagens Representativas. (A-E) Diversas imagens multi-eco, multi-varredura (MEMS) de cérebros de ratos tiradas 48 horas após TE-MCAo. As seções são aproximadamente 1 mm à frente da bregma. (F-J) Vários exemplos de êmbolos alojados na origem do MCA. Por favor, clique aqui para baixar esta figura.

Discussão

Refinamos o modelo tromboembólico de roedor do AVC isquêmico para uso em uma rede de testes pré-clínicos multilaboratoriais, o SPAN. Reduzimos muito o número de animais usados ao desenvolver um método para armazenar sangue de doador para uso posterior. Também simplificamos a preparação dos tromboembolos e a abordagem cirúrgica para facilitar a realização de vários procedimentos de MCAo em um único dia. Nossa intenção é que o TE-MCAo alcance os mesmos níveis de conforto do usuário e volumes cirúrgicos possíveis com a amplamente utilizada versão de filamento de náilon do MCAo. Para alcançar esse resultado, realizamos dois workshops presenciais de treinamento de cirurgiões, e todos os cirurgiões envolvidos neste estudo já tinham vários meses, senão anos, de experiência com o modelo de filamento mais padrão. Demonstramos viabilidade em seis laboratórios de pesquisa diferentes e apresentamos excelente adesão ao protocolo.

Ao escolher implementar esse protocolo, o investigador deve considerar os seguintes itens que determinam o sucesso do protocolo. Primeiro, o cuidado escrupuloso na coleta de sangue influenciará a formação bem-sucedida do trombo. O sangue arterial, não venoso, deve ser coletado para evitar coágulos prematuros. Segundo, é importante coletar mais sangue do que parece ser necessário. Às vezes, um espécime não tromba durante a noite, enquanto os outros falham. Terceiro, recomendamos fortemente que o carregamento do cateter seja feito usando ampliação óptica, seja lupas cirúrgicas com lanterna de cabeça ou uma lente de aumento com iluminação. Quarto, a dissecação cautelosa e cuidadosa do CCA, ICA e ECA é essencial para evitar lesão e trombose intravascular. Além disso, é essencial visualizar a PPA para garantir que o cateter de entrega entre corretamente na ACI. Quinto, é raro observar qualquer efeito adverso nos roedores devido à injeção de trombolíticos. Em nossos estudos, não observamos eventos adversos, como angioedema ou sangramento periférico, após a injeção de TNK. Isso não quer dizer que não seja possível, mas não temos conhecimento de relatos de efeitos colaterais sistêmicos de trombolíticos em roedores. Um pesquisador que optar por implementar esse protocolo pela primeira vez pode ser aconselhado a consultar um dos pesquisadores nomeados como coautor aqui, pois achamos que a instrução personalizada é muito útil.

Ao selecionar um modelo de doença animal para testar terapias candidatas, é importante representar com precisão a população de pacientes que o medicamento pretende tratar. Modelos focais de AVC isquêmico incluem modelos fototrombóticos de Rose Bengal, oclusão da artéria pial cortical e injeção estereotáxica de endotelina-1 13,14,15. Esses modelos têm a vantagem de criar lesões altamente reprodutíveis em áreas previsíveis do córtex. Essa vantagem os torna preferíveis em estudos de mecanismos celulares ou na correlação da localização da lesão com os desfechos comportamentais. Custo adicional, complexidade e ausência de componente de reperfusão tornam esses componentes menos úteis para triagem de drogas.

A MCAo com monofilamento intraluminal ou tromboembolismo são os modelos estabelecidos de escolha para a oclusão de grandes vasos (LVO⁾10,16,17. O modelo monofilamento revestido com silício é simples de executar e amplamente utilizado. Embora a localização e o tamanho da lesão sejam menos previsíveis, em testes de drogas em larga escala, essa heterogeneidade é vista como uma vantagem porque os AVCs humanos também são bastante^{heterogêneos 18,19}. Uma desvantagem do método do monofilamento é que a oclusão é biologicamente inerte. Nos pacientes, trombombos e trombólise produzem uma cascata inflamatória associada à liberação de trombonina, plasminôgeno e outros elementos do trombo 20,21,22. Para superar essa limitação, muitos propuseram modelos de tromboembolismo em estudos com coelhos, suínos, caninos e primatas não humanos 23,24,25,26,27. Esses estudos são complexos e exigem expertise especializada em geral. No entanto, buscamos adaptar o modelo tromboembólico para uso em nossa rede de testes pré-clínicos multilaboratório. Isso exigiu que simplificássemos a preparação do tromboembolo, simplificássemos a abordagem cirúrgica e reduzíssemos significativamente o número de animais necessários. Desenvolvemos um modelo tromboembólico, o TE-MCAo, que pôde ser implementado com sucesso em seis laboratórios diferentes, com excelente adesão ao protocolo (Tabela 1) e tamanho razoavelmente consistente da lesão (Tabela 2). O débito foi suficiente, com uma média de 6 sujeitos por semana.

Existem vários passos de solução de problemas que podem ser úteis. A falha do sangue em trombose é a fonte mais frequente de falha do protocolo e geralmente ocorre devido à contaminação do cateter de preparação com EDTA ou heparina se colocado na mesa cirúrgica. Recomendamos uma técnica de coleta rigorosa. Também recomendamos preparar a solução de cloreto de cálcio usada para inativar o EDTA fresca toda semana ou a cada duas semanas. Após eluir o trombo do cateter de preparação, pode ser desafiador cortar o trombo nos fragmentos de 5 cm necessários. Alguns trombombos são frágeis e se fraturam facilmente. Recomendamos preparar os coágulos com ampliação óptica e, em casos extremos, passar para um trombo doador diferente. Trombos aspiradores e eluídos requerem um nível moderado de habilidade; Por isso, recomendamos um período de treinamento bastante longo. Certifique-se de que a ponta do cateter de aspiração esteja livre de encolhidos usando ampliação óptica. Trombos podem ser encaixados no cateter de implantação – recomendamos uma alternância suave de 'vai e vem' entre aspiração e elução. Para cirurgiões experientes com o modelo típico de filamento MCAo, a identificação do PPA pode ser um novo passo. Recomendamos fortemente marcar os trombos com azul de Evan, para que o cateter possa ser rastreado e acompanhado enquanto sobe pela ACI. A bifurcação da ACI/PPA pode ser facilmente localizada por dissecação cuidadosa e profunda seguindo a ACI, e é localizada de forma confiável até um ramo fino do nervo carótido interno.

Esse protocolo tem algumas limitações. Há um elemento de habilidade cirúrgica necessário para realizar a canulação das artérias carótidas dos roedores. No entanto, isso é igualmente verdadeiro para o modelo de filamento. O manuseio dos trombos sanguíneos também exige habilidade cirúrgica. Como em todos os modelos tromboembólicos, há uma taxa menor de infarto bem-sucedido em comparação com o modelo de filamento. Se o objetivo da investigação for mais frequente de infarto, o modelo de filamento seria preferível. Por outro lado, se o objetivo for replicar trombo e trombólise, então esse modelo é desejável.

Este modelo é destinado a testar candidatos a protetores cerebrais usando um modelo que emprega fidelmente trombose e trombose. Direções futuras também podem incluir estudos de terapia adjuvante direcionada ao fenômeno do não refluxo. Muitos propuseram anticoagulantes e agentes antiplaquetários para esse propósito.

Em conclusão, o protocolo TE-MCAo apresentado aqui foi adaptado para permitir a implantação em múltiplos laboratórios. Simplificamos a preparação dos trombones e simplificamos a abordagem cirúrgica. Desenvolvemos um método para armazenar sangue de doadores, reduzindo significativamente o número de animais necessários.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 ml de seringa	BD	309628
Lupas 10x
Seringa de 1cc	Terumo	SS-01T
Agulha cega de 23g	Grainger	5FVK7
Seringa de 3,0 cc	BD	309656
Ligadura de seda 3-0
Agulha de 30g	BD	305128
Sutura prolene 5-0	Ethicon	8698	Para fechar a pele cortar
Ligadura de seda 5-0	Ethicon	A182
Pinça para aneurisma
Sulfato de atropina	Veterinário Um	NDC86136-006-10	Reduzir secreções brônquicas
Pinças sulcadas sem embutido
Bupivacaína	Xelia Pharmaceuticals	NDC70594-118-01	Anestésicos locais
Cloreto de cálcio	Sigma	C7902
Carprofeno	Zoetis Inc	NADA #141-199	Analgésico
Tubos centrífugas	Eppendorf	22364111	Para coleta de sangue
Etanol	Koptec	UN1170
Evan' s Azul	Sigma	E2129
Bolsa térmica	Aparato de Harvard	K021-435
Pinça hemostática
Isoflurano	Veterinário Um	NDC13985-528-60
Loops de Tecelagem Definitivo Feitos Por Mim	Grupos Horizon	Não aplicável	Contenções macias
Micro tesoura	F.S.T.	15000-00
Microcateteres	Doccol Corporation	PE-FL-360-200-300	Cateteres de injeção pré-fabricados
Cateter PE-10	BD	427401
Tubo PE-100	Intramédico	7426
Tubo PE-50	BD	427410
Tubos EDTA pediátricos	BD Microtainer	K2E-363706	Armazenar sangue doado
Placa de Petri	Eppendorf	30702115
Soro salino tamponado com fosfato	Fisher	B2438
Prevânticos	PDI Inc.	NDC10189-1080-1	Asséptico
Cotonete	VWR	89031-288
Lâmina de barbear	AccuTec Pro	71960
Soro fisiológico	Hospira, Inc.	NDC 0409-4888-02
Tesoura	F.S.T.	14958-11
Pinças agudas
Bomba de seringa	New Era Pumps Inc.	BS-300
Forno de mesa	Boekel	132000
Tenecteplase (TNK)	Genentech, São Francisco	NDC50242-120-47	trombólise
Etiqueta auricular	RapID Lab, San Francisco, CA & nbsp;	RapID Tags