Identificação de Roedores II

A capacidade de identificar animais de pesquisa individuais é um aspecto essencial da manutenção de registros científicos e coleta de dados. A distinção entre os animais garante que o sujeito correto seja usado para o procedimento experimental pretendido.

Existem vários métodos permanentes e temporários que os cientistas usam para identificar animais de laboratório individuais. Neste vídeo, discutiremos métodos envolvendo a tatuagem da cauda de roedor adulto, dedos dos filhos e dos dedos adultos. Em seguida, abordaremos a técnica de colocação de microchips comumente realizada em ratos adultos, seguida pelo método de identificação temporária universal que utiliza corantes não tóxicos.

Antes de aprofundar os protocolos para esses métodos, vamos rever as considerações, benefícios e deficiências de cada uma dessas técnicas. A tatuagem de cauda é benéfica em muitos protocolos de pesquisa, como experimentos envolvendo imagens de ressonância magnética ou aqueles em que os animais são geneticamente predispostos a condições de pele, incluindo dermatite ulcerativa. Outra vantagem das tatuagens de cauda é que elas são facilmente visualizadas sem ter que conter manualmente o animal.

Certos protocolos experimentais requerem genotipagem de recém-nascidos já no primeiro dia, o que torna essencial que esses filhotes sejam permanentemente identificados. O uso da tatuagem dos dedos permite que esses animais sejam identificados até que sejam grandes o suficiente para marcação de ouvido ou socos na orelha. É uma boa ideia aplicar uma tatuagem semelhante ao dedo do pé na mãe adulta para evitar que ela reaja demais e pentee excessivamente a nova tatuagem de seu filhote. Embora existam várias vantagens em utilizar esse método, a desvantagem é que o procedimento requer habilidade, prática, mão firme e equipamentos especializados.

O próximo método de identificação permanente em consideração é a microchipagem. Embora, implantar microchips seja um processo relativamente fácil, existem vários fatores que limitam sua utilidade. Primeiro, esses chips são aproximadamente do tamanho de um grande grão de arroz e requerem uma agulha de calibre 10-12 para implantação, que é muito grande para um rato, limitando assim o método a ratos adultos. Em segundo lugar, os microchips são caros e, portanto, não são ideais para identificar um grande número de animais. Por fim, os microchips não podem ser usados nos experimentos envolvendo ressonância magnética. No entanto, se houver um grupo de animais valiosos como animais criadores com genética única que deve ser permanentemente identificada, microchips podem ser usados.

O último método que discutiremos é a identificação temporária usando marcadores não tóxicos. Os marcadores não tóxicos são feitos para colorir a pele dos animais de pesquisa. Este método é ideal para estudos de curto prazo que exigem que os animais sejam identificados por apenas algumas horas ou dias, embora os corantes possam permanecer visíveis por várias semanas. Alguns pesquisadores usam esses marcadores em conjunto com outros métodos de identificação para identificar facilmente animais específicos em um grupo.

Agora que discutimos o passado, vamos aprender os procedimentos, começando com a tatuagem de cauda. Aqui, vamos demonstrar o procedimento em camundongos adultos, mas o mesmo pode ser aplicado para desmamar e ratos adultos.

Para minimizar qualquer apreensão ou angústia aos animais, a tatuagem da cauda deve ser realizada na sala de procedimento e não na área de alojamento animal. Antes de aplicar a tatuagem, contenha o mouse usando um minguante, com a cauda arrancada da abertura. A flange da taça é realizada no lugar através de uma plataforma de vidro especializada. Em seguida, limpe a cauda com uma pequena quantidade de limpador de tecido diluído em um cotonete com ponta de algodão. Este passo é importante para remover qualquer acúmulo de escala e detritos que possam interferir com a tatuagem. Em seguida, aplique óleo de tecido na pele da cauda com outro cotonete. Isso minimiza os danos teciduais, suavizando a pele e fornecendo lubrificação para a agulha da tatuagem. Além disso, o óleo dissolve a sujeira não removida pelo processo de limpeza e evita a coloração de tinta na pele não tatuada. Agora você está pronto para aplicar a tatuagem.

Enquanto a máquina está desligada, mergulhe a ponta da agulha da tatuagem, que é uma lança ou agulha hipodérmica, no pigmento. Em seguida, ative a arma usando o pedal do pé, coloque a ferramenta de tatuagem na cauda e leve a ponta da agulha para o local da tatuagem. Aproxime-se da pele com a agulha em um ângulo de 90° e penetre profundamente no ponto dermis de tal forma que o pigmento seja permanentemente depositado. Uma mudança no som da agulha ativada pode ajudar a discernir a profundidade. Faça curtos até traços em uma direção, formando numerais e letras. Tente usar curvas e ângulos mínimos ao aplicar a tatuagem.

Para adicionar pigmento adicional, mergulhe a ponta da agulha no reservatório de corante para cada um dos dois caracteres para ratos e cada caractere para ratos. Borrida a tatuagem completa com uma toalha de papel para remover o excesso de pigmento. A presença de sangue na tatuagem ou na toalha de papel indica que a tatuagem foi feita muito profunda e, portanto, é improvável que seja permanente. Reforce caracteres finos com pigmento adicional colocando a agulha paralela, não no topo, do pigmento já depositado. Limpe completamente o equipamento de tatuagem após cada uso, e uma agulha nova ou esterilizada e um suprimento fresco de tinta devem ser usados entre gaiolas para evitar a transmissão da doença.

Em seguida, aprenderemos como aplicar tatuagens de dedo do dedo em recém-nascidos e adultos. Aqui, vamos demonstrar o procedimento em camundongos, mas os mesmos passos são aplicáveis para ratos.

Os recém-nascidos são tatuados em seus dedos, pois os ossos da cauda não são ossificados e o comprimento da cauda é muito pequeno. Também à medida que a cauda cresce, a pele seria esticada e os números podem ficar distorcidos, fracos e ilegíveis. Comece colocando um ponto de pasta de tatuagem verde em uma superfície não porosa, como a folha de alumínio. Em seguida, copo o filhote pré-desmastado em sua mão usando uma almofada de gaze. Posicione o pé entre o polegar e o torto do dedo indicador para expor os dedos escolhidos para a tatuagem. Segure o pé perto dos dedo dos pés para que o dedo do pé selecionado tenha uma superfície sólida atrás dele para evitar que ele se dobre.

Agora, mergulhe a ponta de uma lança de 4,5 mm na pasta da tatuagem. Em seguida, cutuque o dedo desejado de acordo com o código pré-determinado. Para garantir a permeação adequada, cutuque o mesmo local três vezes. Penetre a pele o suficiente para que a pasta deixe uma marca, mas evite cutucar tão profundamente que o dedo do dedo sangra. Limpe suavemente a nova tatuagem com a gaze para remover qualquer excesso de pasta de tatuagem, e devolva o animal para sua gaiola. Use uma lança lança para a próxima ninhada. Um dia após o procedimento, verifique se a tatuagem é visível.

Quando os filhotes de enfermagem são tatuados, é aconselhável também tatuar a represa. Isso pode impedi-la de exagerar e pentear excessivamente as tatuagens de seu filhote. Para aplicar uma tatuagem do dedo do pé a um adulto, novamente, primeiro coloque um pequeno ponto de pasta de tatuagem verde em uma folha de alumínio. Em seguida, contenha o animal usando um cone de plástico ou um conterrmetro plexiglass que permite o acesso aos pés traseiros. Estenda o pé do dispositivo de contenção e posicione o pé entre o polegar e o torto do dedo indicador para expor os dedos escolhidos para a tatuagem.

Agora, mergulhe a ponta de uma lança de 5 mm na pasta da tatuagem. E, como antes, aplique a tatuagem cutucando e perfurando a pele do dedo do dedo desejado pelo menos três vezes para garantir a penetração adequada. Em seguida, limpe suavemente a tatuagem para remover qualquer excesso de pasta, e devolva o animal para sua gaiola. Assim como os recém-nascidos, verifique a tatuagem um dia após o procedimento. Se a marca for visível no dia seguinte à tatuagem, ela deve permanecer visível durante a vida do animal. Se for fraco ou não visível, refaça a tatuagem como descrito anteriormente.

O próximo método de identificação que discutiremos envolve a implantação de microchips em roedores. O chip comumente usado para rotular animais de laboratório é um chip de identificação de radiofrequência, ou RFID. Normalmente, o chip é pré-carregado em agulhas, que podem então ser colocados no aplicador. Para inserção do chip, use um tubo plexiglass para conter o animal certificando-se de que você ainda pode agarrar a pele sobre os ombros. Primeiro, tenda a pele para criar um bolso. Em seguida, coloque a agulha através da pele, bisbida para cima, paralelamente à coluna vertebral, e direcionada em direção à cauda. Ejete o microchip subcutâneamente e retire a agulha. Aperte a pele fechada no local da injeção para evitar que o chip siga a agulha para fora da pele. Continue a pressionar para fornecer hemostasia para qualquer sangramento na pele. Remova o animal do dispositivo de contenção e escaneie o chip usando o leitor fornecido pela fabricante para confirmar o código de identificação.

Por fim, vamos aprender como aplicar corantes temporários aos roedores para identificação. Vamos começar com ratos. Primeiro, conter o animal de tal forma que a área entre as omoplatas seja acessível. Esta parte do corpo está a salvo de auto-preparação. Coloque um ponto ou raia do corante na pele nesta área e coloque o animal de volta em sua gaiola.

Para ratos, contenha o animal manualmente, agarrando a cauda e segurando-a esticada. Isso garante que a área para aplicação de corante seja facilmente acessível, que pode ser cabeça, ombros ou garupa. Coloque um ponto ou raia do corante na pele. Às vezes é possível aplicar corante não tóxico sem conter o animal. Verifique as marcas nesses animais periodicamente, especialmente se você estiver usando-os como o único identificador por mais de alguns dias.

Agora que revisamos os procedimentos desses diferentes métodos de identificação, vamos ver como os cientistas os estão usando em diferentes estudos de pesquisa hoje.

O uso de roedores em experimentos de comportamento é bastante comum. Aqui, os pesquisadores usaram a tatuagem da cauda para marcar os animais permanentemente e, em seguida, observaram-nos por vários dias em um ambiente artificialmente construído em casa-gaiola. Os dados coletados revelaram diferenças de comportamentos, como a distância movida, entre o controle e os animais experimentais, durante um período pós-cirurgia de 10 dias.

Em outro experimento de comportamento, os investigadores realizaram tatuagens de dedos em recém-nascidos e os colocaram em uma caixa de gravação com microfones especiais para gravar vocalizações ultrassônicas. O objetivo deste experimento foi olhar para as diferenças na taxa de chamada, que é o número de vocalizações por minuto, em camundongos selvagens e camundongos deficientes shank2 – um modelo de autismo -durante 12 dias de período neonatal e idade adulta.

Por fim, como discutido anteriormente, o uso de corante não tóxico é uma maneira eficiente de marcar animais para experimentos de curto prazo. Aqui, os cientistas estavam interessados na expressão transitória de uma proteína plasmática. Então eles marcaram os animais com marcadores temporários, injetaram o DNA plasmídeo por via intravenosa, e coletaram a amostra de sangue dois dias depois para determinar a expressão proteica usando a técnica de mancha ocidental.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à tatuagem, colocação de microchips e métodos temporários de identificação para ratos e ratos de laboratório. A identificação animal é um componente primário da manutenção de registros em pesquisas. Portanto, ao escolher o método de identificação adequado, muitos fatores devem ser deliberados. Isso inclui o nível de desconforto para o animal, a facilidade da técnica, as necessidades experimentais e, finalmente, o custo associado ao método. Como sempre, obrigado por assistir!