Quantificando Microorganismos e Vírus Ambientais Usando qPCR

1. Coleta de Amostras

1. Colete o solo usando um auger ou uma pá a uma profundidade determinada. Se coletar o solo da rizosfera, colete apenas o solo dentro de 7 mm ao redor da raiz vegetal, atingindo o excesso de solo da raiz e raspando o solo desejado em um barril de coleta.
2. Coloque uma garrafa Nalgene estéril em uma vara de mergulho. Segure a ponta da vara e colete água submergindo garrafa. Coloque a garrafa em um refrigerador com gelo.
3. Transfira amostras para o laboratório.

2. Extração de ácidos nucleicos

1. Para isolar os microrganismos das amostras coletadas e extrair DNA e/ou RNA deles, consulte o vídeo da JoVE Science Education sobre extração de ácido nucleico comunitário.

3. Transcrição reversa

1. Se o material genético que está sendo testado for RNA, ele deve ser usado para gerar DNA complementar (cDNA) via transcrição reversa antes de prosseguir para PCR. Para obter detalhes, consulte o vídeo da JoVE Science Education no RT-PCR.

4. Configuração de qPCR

1. Recupere os reagentes armazenados a -20 °C e descongele-os no gelo ou à temperatura ambiente dentro de um capô limpo. Os reagentes utilizados neste exemplo incluem a mistura de reação qPCR (dependente da máquina qPCR usada; contém polimerase de DNA), primers dianteiros e reversos, e a sonda TaqMan. As sequências de primer e sonda são projetadas com sequências específicas do organismo que está sendo enumerada. Consulte a literatura atual para encontrar sequências de interesse. Neste exemplo, será utilizado o sistema de reagente Roche Light Cycler 480 Mix. O vírus da mísera de pimenta será enumerado na amostra de água. ^1,2 Consulte a tabela 1 para sequências de primer e sonda.
2. Degelo extraído (c)DNA de amostras e o DNA de controle positivo (que consiste em sequências específicas do organismo clonadas em plasmídeos bacterianos) à temperatura ambiente.
3. Prepare um modelo de tabela de 96 células que se assemelha à placa qPCR de 96 poços. Rotule cada célula com a reação que será carregada na placa. Inclua reações para cada amostra e padrão em triplicado, bem como para o controle positivo e controle negativo, como uma reação sem DNA.
4. Calcule os volumes de reagentes necessários para uma reação "master mix", que inclui todos os reagentes que são constantes entre as reações, com base nas instruções do fabricante e na literatura. Prepare mistura mestre suficiente para reações triplicadas para todas as amostras mais controles, e um adicional de 10% para explicar o erro de pipetação. Para obter uma receita de mix de mestre de amostra, consulte a Tabela 2.
5. Trabalhando dentro de um capô limpo, uma vez que todos os reagentes são completamente descongelados, adicione a quantidade calculada de cada reagente em um tubo de microfuça de baixa ligação de 1,5 mL para criar mistura mestre. Vórtice e minicentrifuugar brevemente cada reagente antes de adicionar. Altere a ponta da pipeta entre cada reagente para evitar contaminação e garantir as concentrações corretas. Depois de todos os reagentes terem sido adicionados, vórtice e tubo de minicentrifuge com a mistura mestre para garantir a homogeneidade.
6. Aliquot o volume apropriado de mistura mestre em cada poço designado na placa PCR de 96 poços.
7. Adicione o volume apropriado de (c)amostra de DNA, plasmídeo de controle positivo e controle negativo (água de grau molecular) em poços designados.
8. Uma vez adicionadas todas as amostras e controles, a placa de vedação com papel alumínio de vedação. Use uma ferramenta de vedação para empurrar o ar para fora debaixo da folha e evitar bolhas. Rasgue as bordas da folha com cuidado.
9. Centrifugar a placa selada de 96 poços em uma centrífuga com um porta-placas para coletar mistura na parte inferior de cada poço. Certifique-se de usar uma placa de contrapeso para garantir que a centrífuga seja adequadamente equilibrada durante a rotação. Centrífuga de pulso até 1000 rpm, depois deixe a centrífuga parar lentamente sem freios.

5. operação qPCR

1. Coloque placa selada de 96 poços na máquina qPCR. Certifique-se de que a máquina indica que está pronta para iniciar.
2. Siga as instruções da máquina qPCR para inserir corretamente todas as informações necessárias pelo software e, em seguida, defina a máquina qPCR para funcionar.
3. Após a execução da máquina, o software poderá usar as concentrações conhecidas do controle positivo para calcular a quantidade de cDNA em cada reação. A quantidade de vírus na amostra original pode então ser calculada, com base nos processos de diluição, filtração, concentração, amplificação e/ou extração realizados para obter a amostra de DNA.

Reagente	Sequência (5' → 3')	Volume (μL / bem)	Conc Final.
Primer avançado	GAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGA	2.25	900 nM
Primer reverso	TTGTCGGTTGCAATGCAAGAGT	2.25	900 nM
Sondar	FAM-CCTACCGAAGCAAATG-BHQ1	1.0	200 nM

Mesa 1. Prove sequências de primer e sonda para detectar o vírus da mísola de pimenta.

Reagente	Volume (μL / bem)	Número de Poços	Volume de mixagem mestre (μL)
LC 480 Mix	12.5	26	325
Molecular H2O	4.5		117
Primer avançado	2.25		58.5
Primer reverso	2.25		58.5
Sondar	1.0		26
Total	22.5		585

Mesa 2. Volumes de reagentes para reação individual e mistura mestre.