Quantificando Microorganismos e Vírus Ambientais Usando qPCR

O advento da reação quantitacionária da cadeia de polimerase, ou qPCR, tornou possível determinar quantitativamente a quantidade de qualquer microrganismo em uma amostra ambiental.

Como o PCR padrão, o qPCR identifica microrganismos detectando para a presença ou ausência de sequências de DNA específicas dos organismos de interesse. Isso permite a detecção de micróbios que não podem ser cultivados em laboratório, possibilitando avaliar uma gama muito maior de organismos ambientais. Além disso, o qPCR permite que a quantidade de DNA seja avaliada quantitativamente. Mas, ao mesmo tempo, as metodologias pcr detectam DNA de todos os organismos vivos ou mortos, limitando a capacidade de procurar apenas micróbios em crescimento ativo na amostra.

Este vídeo revisará as inovações químicas que distinguem o qPCR do PCR regular, explicará como o QPCR pode ser usado para medir quantitativamente o DNA, demonstrará um protocolo para o uso de qPCR para detectar um vírus RNA a partir de amostras de solo e, finalmente, mostrará como o qPCR está sendo aplicado à microbiologia ambiental hoje.

Os princípios básicos por trás do qPCR são os mesmos do PCR regular – ciclos repetidos de remarcação de primer ao modelo, alongamento do produto PCR e desnaturação do produto do modelo, levando à amplificação exponencial de uma sequência de juros alvo, conhecida como amplicon, a partir de um pool de material inicial.

A inovação do qPCR é a adição de produtos químicos fluorescentes na reação, o que permite que a síntese do produto PCR em cada ciclo seja diretamente visualizada em “tempo real” por termociclistas especializados, possibilitando quantificar a quantidade de sequência de modelos na amostra original. A quantidade é geralmente medida em termos do ciclo limiar, abreviado C_t, também conhecido como ciclo de quantificação ou C_q,que é o ciclo PCR no qual a quantidade de produtos fluorescentes excede o nível de fundo.

A quantificação pode ser relativa, onde o valor C_t de uma sequência é comparado ao de outro padrão ou sequência de controle; a quantidade relativa é igual a duas elevadas ao poder da diferença em C_t. Alternativamente, se uma série de DNA de quantidade conhecida é executado ao lado das amostras na reação, uma curva padrão comparando o valor da fluorescência com a quantidade de DNA pode ser produzida, e permite que o DNA da amostra seja absolutamente quantitado.

Existem dois tipos amplos de moléculas fluorescentes usadas em qPCR. Em um caso, corantes fluorescentes que se ligam especificamente ao DNA de dupla fita está incluído na reação. O corante só fluoresce quando vinculado ao DNA, permitindo assim que a quantidade de produto de DNA de dupla cadeia seja quantificada.

No outro método, um pequeno trecho de DNA, conhecido como sonda, é projetado contra uma sequência específica de interesse. A sonda é quimicamente ligada a um corante fluorescente, bem como uma molécula “quencher” que suprime o sinal de fluorescência do corante quando está perto. A enzima polimerase, que sintetiza o produto de DNA, tem uma atividade degradante de DNA que faria com que a molécula fluorescente fosse “liberada” da sonda, separando assim o corante da quencher e permitindo que o sinal de fluorescência fosse detectado.

Agora que você entende os princípios por trás do qPCR, vamos olhar para um protocolo para usar esta técnica para identificar um vírus RNA que infecta plantas, o vírus da pimenta, a partir de amostras de solo.

Nesta demonstração, a amostra será coletada da rizosfera, a zona do solo de aproximadamente 7 mm em torno das raízes vegetais que é influenciada pelas raízes e seus microrganismos simbióticos.

Para coletar solo da rizosfera, primeiro extrair cuidadosamente a planta de interesse do solo, e atingi-la para remover o máximo de excesso de solo a granel possível. Embale a planta para mais processamento no laboratório.

Depois de trazer as amostras de volta ao laboratório, use uma espátula estéril para raspar o solo desejado em um vaso de coleta. Então, recolhe o vírus do solo e extraia o RNA.

Uma vez coletado o RNA da amostra, converta-o em complementar ou cDNA via transcrição reversa. Consulte o vídeo JoVE SciEd sobre transcrição reversa-PCR para obter detalhes deste procedimento.

Quando estiver pronto para executar o qPCR, descongele reagentes congelados à temperatura ambiente dentro de um capô de fluxo laminar dedicado, e coloque no gelo uma vez descongelado. Os componentes do reagente contendo a enzima polimerase de DNA devem ser sempre mantidos no gelo.

Descongele a amostra cDNA e um DNA de controle positivo, como um pedaço circular de DNA conhecido como plasmídeo que tem o amplicon de interesse clonado nele.

Antes de montar as reações em uma placa qPCR de 96 poços, prepare um modelo de mesa de 96 células no papel e rotule cada célula com a reação que será carregada na placa. Inclua reações para cada amostra e padrão em triplicado, bem como para o controle positivo e controle negativo, como uma reação sem DNA.

Calcule os volumes de reagente necessários para uma reação “master mix”, que inclui todos os reagentes que são constantes entre as reações. Prepare mistura mestre suficiente para reações triplicadas para todas as amostras mais controles, e um adicional de 10% para explicar o erro de pipetação.

Uma vez que os reagentes são descongelados, monte a mistura mestre em um tubo de microfuge de baixa adsorção de 1,5 mL. Para isso, bata brevemente cada reagente para misturar bem, coletar qualquer líquido na lateral dos tubos usando uma mini-centrífuga e pipeta o reagente no tubo de microfuge. Certifique-se de usar novas dicas de pipeta para cada componente de reação. Depois de todos os reagentes terem sido adicionados, vórtice para misturar e centrífuga. Em seguida, aliquotar a quantidade apropriada de mistura mestre nos poços designados na placa PCR.

Em seguida, vórtice e centrífuga cada tubo com DNA de amostra e controle, e pipeta a quantidade apropriada nos respectivos poços na placa PCR. Uma vez adicionadas as amostras, sele a placa com uma folha de vedação e use a ferramenta de vedação para achatar totalmente o selo e empurrar quaisquer bolhas de ar. Retire cuidadosamente as abas não adesivas das extremidades do selo.

Para coletar totalmente a mistura de reação na parte inferior dos poços, coloque a placa de reação em uma centrífuga com um suporte de placa e equilibre corretamente o rotor com uma placa de contrapeso. Centrifugar a placa até 1.000 rpm, depois deixe a centrífuga lentamente parar sem freios.

Coloque a placa de reação na máquina qPCR. Defina o programa PCR de acordo com a especificação do fabricante, definindo a temperatura de fusão de acordo com o par de primer que está sendo usado. Defina o programa de reação para ser executado.

Uma vez que o programa qPCR seja concluído, o software poderá usar as concentrações conhecidas do controle positivo para calcular a quantidade de cDNA em cada reação. A quantidade de vírus na amostra original pode então ser calculada.

Uma vez que o programa qPCR seja concluído, o software poderá usar as concentrações conhecidas do controle positivo para calcular a quantidade de cDNA em cada reação.

Com os resultados da qPCR, o volume transferido para os poços, a extração do solo e o fator da transcrição reversa, o número de vírus na amostra inicial do solo pode ser calculado.

Agora que você sabe como o qPCR é realizado, vamos ver como ele pode ser usado para analisar diferentes amostras ambientais.

qPCR pode ser usado para quantificar a quantidade de vírus recuperados de muitos tipos diferentes de amostras. Nesta aplicação, dois tipos diferentes de adenovírus foram concentrados a partir de amostras de água por uma série de métodos diferentes. O DNA foi então extraído dos vírus e submetido à qPCR, para avaliar a eficiência relativa dos métodos de concentração.

Outra aplicação para enumeração microbiana baseada em qPCR é quantificar o conteúdo bacteriano em amostras de alimentos e agrícolas – neste exemplo, amostras fecais e de lixo de granjas de frango. Em vez de atingir espécies individuais, os cientistas realizaram qPCR usando primers contra um gene altamente conservado encontrado em todas as bactérias e quantificaram a comunidade bacteriana total encontrada nas amostras.

Finalmente, como mencionado anteriormente, uma desvantagem da metodologia tradicional qPCR é que micróbios vivos e mortos não podem ser distinguidos. No entanto, adicionando um químico conhecido como monóxido de propídio, ou PMA, que só pode entrar em células mortas onde se liga ao DNA para inibir reações enzimáticas subsequentes, como o PCR, os pesquisadores aqui foram capazes de distinguir entre culturas vivas e mortas de E. coli O157:H7, uma cepa patogênica comum encontrada em alimentos e água contaminados.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE para quantificar microrganismos ambientais e vírus usando qPCR. Agora você deve entender como funciona o qPCR, como usar qPCR para medir a quantidade de um micróbio em uma amostra ambiental, e algumas aplicações dessa técnica. Obrigado por assistir!