Quantificando Microorganismos e Vírus Ambientais Usando qPCR

O advento da reação em cadeia da polimerase quantitativa, ou qPCR, tornou possível determinar quantitativamente a quantidade de qualquer microrganismo em uma amostra ambiental.

Como o PCR padrão, o qPCR identifica microrganismos detectando a presença ou ausência de sequências de DNA específicas dos organismos de interesse. Isso permite a detecção de micróbios que não podem ser cultivados em laboratório, tornando possível testar uma gama muito maior de organismos ambientais. Além disso, a qPCR permite que a quantidade de DNA seja avaliada quantitativamente. Mas, ao mesmo tempo, as metodologias de PCR detectam DNA de todos os organismos vivos ou mortos, limitando a capacidade de procurar apenas micróbios em crescimento ativo na amostra.

Este vídeo revisará as inovações químicas que distinguem o qPCR do PCR regular, explicará como o qPCR pode ser usado para medir quantitativamente o DNA, demonstrará um protocolo para usar o qPCR para detectar um vírus de RNA em amostras de solo e, finalmente, mostrará como o qPCR está sendo aplicado à microbiologia ambiental hoje.

Os princípios básicos por trás da qPCR são os mesmos da PCR regular - ciclos repetidos de recozimento do primer para o molde, alongamento do produto de PCR e desnaturação do produto do molde, levando à amplificação exponencial de uma sequência alvo de interesse, conhecida como amplicon, de um pool de material de partida.

A inovação da qPCR está na adição de produtos químicos fluorescentes na reação, o que permite que a síntese do produto da PCR em cada ciclo seja visualizada diretamente em "tempo real" por termocicladores especializados, possibilitando quantificar a quantidade de sequência molde na amostra original. A quantidade é geralmente medida em termos do ciclo de limiar, abreviado Ct, também conhecido como ciclo de quantificação ou Cq, que é o ciclo de PCR no qual a quantidade de produtos fluorescentes excede o nível de fundo.

A quantificação pode ser relativa, onde o valor Ct de uma sequência é comparado ao de outra sequência padrão ou controle; a quantidade relativa é igual a dois elevado à potência da diferença em Ct. Alternativamente, se uma série de DNA de quantidade conhecida for executada ao lado das amostras na reação, uma curva padrão comparando o valor de fluorescência com a quantidade de DNA pode ser produzida e permite que o DNA da amostra seja quantificado absolutamente.

Existem dois tipos amplos de moléculas fluorescentes usadas na qPCR. Em um caso, corantes fluorescentes que se ligam especificamente ao DNA de fita dupla são incluídos na reação. O corante só fluoresce quando ligado ao DNA, permitindo assim que a quantidade de produto de DNA de fita dupla seja quantificada.

No outro método, um pequeno trecho de DNA, conhecido como sonda, é projetado contra uma sequência alvo específica de interesse. A sonda é quimicamente ligada a um corante fluorescente, bem como a uma molécula "supressora" que suprime o sinal de fluorescência do corante quando está próximo. A enzima polimerase, que sintetiza o produto do DNA, tem uma atividade degradadora do DNA que faria com que a molécula fluorescente fosse "liberada" da sonda, separando assim o corante do sumidor e permitindo que o sinal de fluorescência fosse detectado.

Agora que você entende os princípios por trás do qPCR, vamos dar uma olhada em um protocolo para usar essa técnica para identificar um vírus de RNA que infecta plantas, o vírus da mancha suave da pimenta, a partir de amostras de solo.

Nesta demonstração, a amostra será coletada da rizosfera, a zona do solo de aproximadamente 7 mm ao redor das raízes das plantas que é influenciada pelas raízes e seus microrganismos simbióticos.

Para coletar o solo da rizosfera, primeiro extraia cuidadosamente a planta de interesse do solo e bata nela para remover o máximo possível de excesso de solo a granel. Embale a planta para processamento posterior no laboratório.

Depois de trazer as amostras de volta ao laboratório, use uma espátula estéril para raspar o solo desejado em um recipiente de coleta. Em seguida, colete o vírus do solo e extraia o RNA.

Uma vez que o RNA é coletado da amostra, converta-o em complementar ou cDNA via transcrição reversa. Consulte o vídeo JoVE SciEd sobre PCR de transcrição reversa para obter detalhes sobre este procedimento.

Quando estiver pronto para realizar o qPCR, descongele os reagentes congelados à temperatura ambiente dentro de uma capela de fluxo laminar dedicada e coloque no gelo depois de descongelado. Os componentes reagentes que contêm a enzima DNA polimerase devem ser sempre mantidos em gelo.

Descongele o cDNA da amostra e um DNA de controle positivo, como um pedaço circular de DNA conhecido como plasmídeo que tem o amplicon de interesse clonado nele.

Antes de montar as reações em uma placa de qPCR de 96 poços, prepare um modelo de tabela de 96 células em papel e rotule cada célula com a reação que será carregada na placa. Inclua reações para cada amostra e padrão em triplicado, bem como para o controle positivo e controle negativo, como uma reação sem DNA.

Calcule os volumes de reagentes necessários para uma "mistura principal" de reação, que inclui todos os reagentes que são constantes entre as reações. Prepare master mix suficiente para reações triplicadas para todas as amostras mais controles, e um adicional de 10% para contabilizar o erro de pipetagem.

Assim que os reagentes forem descongelados, monte a mistura principal em um tubo de microcentrífuga de baixa adsorção de 1,5 mL. Para fazer isso, faça um vórtice breve de cada reagente para misturar completamente, colete qualquer líquido na lateral dos tubos usando uma minicentrífuga e pipete o reagente no tubo de microcentrífuga. Certifique-se de usar novas ponteiras de pipeta para cada componente de reação. Depois que todos os reagentes forem adicionados, vórtice para misturar e centrifugar. Em seguida, alíquota a quantidade apropriada de mistura principal nos poços designados na placa de PCR.

Em seguida, vórtice e centrifugue cada tubo com amostra e DNA de controle e pipete a quantidade apropriada nos respectivos poços na placa de PCR. Depois que as amostras forem adicionadas, sele a placa com uma folha de vedação e use a ferramenta de vedação para achatar totalmente a vedação e expulsar quaisquer bolhas de ar. Retire cuidadosamente as abas não adesivas das extremidades do selo.

Para coletar totalmente a mistura de reação no fundo dos poços, coloque a placa de reação em uma centrífuga com um suporte de placa e equilibre adequadamente o rotor com uma placa de contrapeso. Centrifugue a placa por pulso até 1.000 rpm e, em seguida, deixe a centrífuga parar lentamente sem freios.

Coloque a placa de reação na máquina de qPCR. Defina o programa de PCR de acordo com a especificação do fabricante, definindo a temperatura de fusão de acordo com o par de primers que está sendo usado. Defina o programa de reação para ser executado.

Uma vez concluído o programa qPCR, o software poderá usar as concentrações conhecidas do controle positivo para calcular a quantidade de cDNA em cada reação. A quantidade de vírus na amostra original pode então ser calculada.

Uma vez concluído o programa qPCR, o software poderá usar as concentrações conhecidas do controle positivo para calcular a quantidade de cDNA em cada reação.

Com os resultados da qPCR, o volume transferido para os poços, a extração do solo e o fator da transcrição reversa, pode-se calcular o número de vírus na amostra inicial do solo.

Agora que você sabe como o qPCR é realizado, vamos ver como ele pode ser usado para analisar diferentes amostras ambientais.

qPCR pode ser usado para quantificar a quantidade de vírus recuperados de muitos tipos diferentes de amostras. Nesta aplicação, dois tipos diferentes de adenovírus foram concentrados a partir de amostras de água por vários métodos diferentes. O DNA foi então extraído dos vírus e submetido a qPCR, para avaliar a eficiência relativa dos métodos de concentração.

Outra aplicação para enumeração microbiana baseada em qPCR é quantificar o conteúdo bacteriano em amostras de alimentos e agrícolas - neste exemplo, amostras fecais e de cama de granjas de frangos. Em vez de visar espécies individuais, os cientistas realizaram qPCR usando primers contra um gene altamente conservado encontrado em todas as bactérias e quantificaram a comunidade bacteriana total encontrada nas amostras.

Finalmente, como mencionado anteriormente, uma desvantagem da metodologia tradicional de qPCR é que micróbios vivos e mortos não podem ser distinguidos. No entanto, ao adicionar um produto químico conhecido como monoazida de propídio, ou PMA, que só pode entrar nas células mortas onde se liga ao DNA para inibir reações enzimáticas subsequentes, como PCR, os pesquisadores foram capazes de distinguir entre culturas vivas e mortas de E. coli O157: H7, uma cepa patogênica comum encontrada em alimentos e água contaminados.

Você acabou de assistir à introdução de JoVE à quantificação de microrganismos e vírus ambientais usando qPCR. Agora você deve entender como funciona o qPCR, como usar o qPCR para medir a quantidade de um micróbio em uma amostra ambiental e algumas aplicações dessa técnica. Obrigado por assistir!