Detecção de Microrganismos Ambientais com Reação em Cadeia da Polimerase e Eletroforese em Gel

A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica biológica fundamental amplamente aplicada na detecção e identificação de microrganismos presentes no solo, água e outras amostras ambientais.

Classicamente, os microrganismos são cultivados em laboratórios usando meios de crescimento especializados. No entanto, muitos micróbios no ambiente natural são "não cultiváveis" - seja porque têm atividade metabólica ou taxa de crescimento muito baixa, ou porque têm requisitos de crescimento muito rigorosos que podem não ser replicáveis em uma placa de cultura. As diferenças na capacidade de cultivo entre os micróbios também significam que, quando os microrganismos de uma amostra ambiental são cultivados, sua abundância relativa em cultura pode não refletir seus níveis reais no ambiente.

O advento da PCR, que pode amplificar especificamente até mesmo pequenas quantidades de DNA presentes em uma amostra mista, torna possível detectar e identificar rapidamente micróbios específicos de interesse, mesmo aqueles que não são cultiváveis, dentro da complexa variedade de organismos presentes em uma amostra ambiental.

Este vídeo apresentará os princípios do PCR. Em seguida, discutirá um protocolo geral para a realização de PCR em DNA isolado de uma amostra ambiental, a fim de detectar a presença de um organismo de interesse. Finalmente, várias aplicações de identificação de micróbios baseada em PCR serão exploradas.

A premissa básica da PCR é usar ciclos repetidos de mudanças sequenciais de temperatura para obter amplificação exponencial do DNA, geralmente com uma máquina conhecida como termociclador para alternar automaticamente entre as diferentes temperaturas. A síntese de DNA é realizada por enzimas DNA polimerase que são obtidas de bactérias que vivem em fontes termais, como Thermus aquaticus ou "Taq". Essas polimerases são estáveis ao calor, permitindo que suportem as altas temperaturas usadas durante a PCR.

A sequência alvo, conhecida como amplicon, é amplificada a partir do molde de DNA usando dois trechos curtos de nucleotídeos conhecidos como "primers". Devido à alta especificidade da ligação de ácidos nucleicos complementares, os primers permitem a amplificação direcionada de sequências muito específicas de interesse. Ao projetar primers que amplificarão apenas uma sequência única, ou uma combinação única de sequências, de um organismo de interesse, a PCR pode ser usada para detectar diferencialmente a presença do DNA desse organismo entre todos os materiais genéticos presentes em uma amostra ambiental complexa.

Cada ciclo de PCR é dividido em três fases. O primeiro, conhecido como "desnaturação", é geralmente definido acima de 92 ? C e dura cerca de 30 s. A desnaturação é usada para quebrar as moléculas de DNA em fitas simples, para permitir que a reação de amplificação prossiga.

A segunda fase, "recozimento", é definida de 2 a 3 ? C abaixo da temperatura de fusão inferior dos dois primers, geralmente entre 50 a 65 ? C, e também dura cerca de 30 s. A temperatura de fusão é a temperatura na qual 50% das moléculas de DNA de fita dupla se separaram em fitas simples e, portanto, a etapa de recozimento permite que os primers se liguem aos seus locais-alvo no molde de DNA.

A terceira fase de um ciclo de PCR é o "alongamento" ou "extensão", quando a DNA polimerase se liga ao duplex do molde de primer e catalisa a síntese das novas fitas. Definido em 72 ? C para a polimerase de PCR mais comumente usada, Taq, a duração desta fase depende do comprimento do amplicon, geralmente 30 s por 500 pares de bases. Após cada ciclo, o DNA amplificado é novamente desnaturado e serve como um novo modelo, levando a um aumento exponencial na quantidade de produtos de PCR.

Uma vez concluída a reação, os produtos de PCR podem ser resolvidos por tamanho em um "gel" geralmente feito do polímero agarose, um processo conhecido como eletroforese. Um campo elétrico é aplicado através do gel, e as cargas negativas na espinha dorsal das moléculas de DNA fazem com que elas migrem para a extremidade positiva do campo. De um modo geral, as moléculas de DNA lineares maiores levarão mais tempo para viajar pela matriz de gel.

Agora que você entende como funciona a PCR, vamos dar uma olhada em como a reação pode ser usada para identificar microrganismos em uma amostra ambiental.

Para começar, calcule o volume de cada reagente necessário com base no número de amostras a serem processadas, mais 10% adicionais para contabilizar erros de pipetagem. Deve ser incluído um modelo de controlo positivo - que contém a região-alvo - para garantir que a reacção está a funcionar; bem como um controle negativo onde nenhum molde de DNA é incluído, a fim de descartar contaminação em qualquer um dos componentes da reação. Mantenha a enzima Taq polimerase no gelo e descongele o restante dos reagentes e as amostras de DNA à temperatura ambiente em uma capela de fluxo laminar designada para evitar contaminação.

Depois que todos os reagentes tiverem descongelado, constitua a "mistura principal" do reagente adicionando o volume calculado de cada reagente em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação, o que minimiza as discrepâncias nas quantidades de reagentes devido à adsorção de moléculas na superfície do tubo. Suavemente vórtice e centrifugue cada reagente antes de adicionar. Uma vez que a mistura principal é preparada, vórtice para misturar e coletar por centrifugação.

Rotule uma tira de PCR de 8 tubos para designar um tubo para cada amostra, incluindo os controles. Dispense a quantidade apropriada de mistura mestre de PCR em cada tubo da tira. Em seguida, adicione cada amostra de DNA ao respectivo tubo.

Coloque a tampa da tira firmemente no tubo da tira e centrifugue brevemente em uma minicentrífuga com um adaptador de tira. Em seguida, coloque o tubo no termociclador e execute a reação de acordo com o programa de PCR apropriado.

Enquanto a PCR está sendo executada, prepare um gel de agarose para a eletroforese dos produtos da PCR. Pese uma quantidade adequada de pó de agarose para um gel com uma concentração que possa resolver os produtos de PCR com base em seus tamanhos esperados. Adicione a agarose em um frasco de 125 mL e, em seguida, adicione o volume apropriado de tampão de gel no frasco, com base no volume do molde de gel, e agite para misturar. Microondas a solução de agarose em alta potência por 1 min. Quando terminar, verifique se a agarose está totalmente dissolvida girando o frasco e repita o micro-ondas em incrementos de 30 segundos, se necessário.

Fixar bem a tampa no balão e arrefecer a solução de agarose a 50 ? C girando o balão em água fria corrente. Depois de resfriado, adicione 1 ? L de brometo de etídio para a agarose. Como o brometo de etídio é potencialmente cancerígeno, certifique-se de usar equipamentos de proteção individual, como óculos de proteção, jaleco e luvas resistentes ao brometo de etídio.

Despeje a solução de agarose em uma bandeja de fundição em gel de eletroforese, certificando-se de que nenhuma bolha de ar fique presa dentro da agarose. Coloque um pente com o número necessário de poços na solução. Deixe o gel em temperatura ambiente por 20 a 30 min para solidificar. Assim que o gel estiver firme, remova cuidadosamente o pente, certificando-se de não rasgá-lo no processo.

Coloque o gel solidificado na câmara de eletroforese. Adicione o tampão LB na câmara até que o gel esteja submerso. Em um pedaço de Parafilm, pipete um "ponto" de escada de DNA de uma faixa adequada para o tamanho esperado dos produtos de PCR. Recupere os tubos de PCR com as reações completas do termociclador. Colete condensados nos tubos de PCR por centrifugação breve e adicione 8 ? L de cada amostra no Parafilm. Adicionar 2 ? L de 10x carregando corante em cada ponto do produto de PCR, de modo que a concentração final do corante seja 2x.

Carregue as amostras e escada nos poços designados no gel de agarose, tomando cuidado para não cutucar o gel. Quando o carregamento estiver concluído, coloque a tampa na câmara de eletroforese e conecte os eletrodos à fonte de alimentação. Como o DNA é carregado negativamente e migra para o eletrodo positivo, certifique-se de que os poços estejam no lado mais próximo do eletrodo negativo. Ligue a fonte de alimentação e ajuste-a para uma tensão apropriada para o tamanho da câmara de eletroforese e o sistema tampão que está sendo usado. Defina a eletroforese para "executar". Pequenas bolhas subindo pelas laterais da câmara serão observadas se a eletroforese estiver ocorrendo corretamente.

Assim que a frente do corante avançar o suficiente para baixo no gel, desligue a fonte de alimentação. Transporte cuidadosamente o gel para um gerador de imagens de gel para visualizar os produtos eletroforesados. Com um escudo protetor, acenda a luz ultravioleta e visualize as bandas de DNA no gel. Analise a posição das bandas para ver se corresponde ao padrão esperado que indica a presença das espécies de interesse na amostra ambiental.

Agora que você viu como a PCR é realizada, vejamos várias maneiras pelas quais ela é aplicada para detectar microrganismos de interesse no meio ambiente.

Um uso da detecção microbiana ambiental baseada em PCR é identificar organismos causadores de doenças, como a "ameba comedora de cérebro" Naegleria fowleri, um organismo unicelular encontrado em corpos de água doce e piscinas não cloradas que podem atacar o sistema nervoso humano, muitas vezes fatalmente. A presença desse micróbio mortal em amostras de água ou no líquido cefalorraquidiano de pacientes suspeitos pode ser testada realizando PCR usando primers que visam sequências de DNA únicas no genoma da ameba.

Outra aplicação para a identificação microbiana baseada em PCR é testar a presença de bactérias patogênicas em moscas capturadas nas proximidades de estabelecimentos alimentícios, como parte do monitoramento da saúde pública e investigações de surtos de doenças.

Aqui, os pesquisadores procuraram a presença de bactérias patogênicas, como Salmonella e Listeria, primeiro isolando bactérias da superfície corporal e do canal digestivo das moscas e, em seguida, usando condições de cultura específicas da espécie para enriquecer essas espécies de interesse. Depois de extrair o DNA de qualquer bactéria que foi cultivada, kits de PCR de detecção específicos de espécies disponíveis comercialmente foram usados para testar sua identidade.

Finalmente, diferentes cepas de bactérias patogênicas resistentes a antibióticos, como Staphylococcus aureus, que apresentam grandes preocupações de saúde pública, podem ser identificadas e diferenciadas com PCR.

Neste exemplo, os pesquisadores isolaram e cultivaram S. aureus de amostras clínicas, depois extraíram DNA das colônias bacterianas e realizaram PCR. As reações de amplificação aqui foram "multiplexadas", o que significa que vários conjuntos de primers direcionados a diferentes regiões únicas do genoma bacteriano foram combinados na mesma reação. Conjuntos de primers individuais foram projetados para que os produtos de PCR resultem do DNA de apenas algumas cepas, mas não de outras, de modo que, em combinação, padrões exclusivos de bandas de produtos fossem observados para cada cepa.

Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre detecção de microrganismos baseada em PCR. Analisamos os princípios por trás da reação em cadeia da polimerase; um protocolo para a realização de PCR em DNA extraído de microrganismos ambientais; e, finalmente, várias aplicações específicas desta técnica para testar organismos de interesse em diferentes tipos de amostras ambientais ou clínicas. Obrigado por assistir!