Detecção de Microrganismos Ambientais com Reação em Cadeia da Polimerase e Eletroforese em Gel

1. Coleta de Amostras

1. Colete o solo usando um auger ou pá até uma profundidade determinada. Se coletar o solo da rizosfera (a região estreita do solo ao redor e influenciada pelas raízes das plantas e seus micróbios associados), basta coletar diretamente do entorno das raízes da planta, atingindo o solo em um barril de coleta.
2. Colete a amostra de água mergulhando uma garrafa de plástico estéril na água enquanto segura a ponta do bastão de mergulho.

2. Extração e Preparação de Ácidos Nucleicos

1. Coletar organismos e vírus da amostra, e extrair DNA e RNA deles. Para obter detalhes, consulte o vídeo da JoVE Science Education sobre extração de ácido nucleico comunitário.
2. Armazene o DNA extraído em tubos de microfudão rotulados. Se o DNA precisar ser armazenado durante a noite ou por períodos mais longos de tempo, congele-o a -20 °C e descongele os tubos à temperatura ambiente quando estiver pronto para uso.
3. Se o material genético a ser avaliado for RNA (seja o genoma dos vírus RNA, ou o RNA transcrito de organismos celulares), realize transcrição reversa (RT) na amostra para criar DNA complementar (cDNA) antes de prosseguir para pcr. Para obter detalhes, consulte o vídeo da JoVE Science Education no RT-PCR.

3. Reação em cadeia de polimerase

1. Coloque a enzima PCR (por exemplo,polímerase de Taq) no gelo e descongele os outros reagentes (tampão PCR, dNTPs, primers) dentro de um capô "limpo" designado à temperatura ambiente. A enzima é armazenada a -20 °C, mas nunca congela. É sensível à temperatura, e por isso deve ser mantido frio e sua exposição à temperatura ambiente minimizada
2. Calcule o volume de cada reagente necessário para fazer uma "mistura mestre" de todos os reagentes que são constantes entre todas as reações(Tabela 1). Certifique-se de contabilizar controles positivos (por exemplo,um modelo conhecido por conter a região alvo) e negativos(por exemplo,sem modelo) nos cálculos. Adicione um adicional de 10% ao volume final para explicar o erro de pipetação. Os volumes de primer dependem de ensaios para organismos específicos; referem-se à literatura publicada para os valores apropriados.
3. Usando um tubo de microfuça de baixa ligação, que minimiza a adesão de moléculas de reagente às paredes plásticas, adicione os volumes calculados de cada reagente para montar a mistura mestre. Vórtice suavemente e centrífuga cada reagente antes de adicionar. Uma vez que a mistura mestre é preparada, vórtice para misturar e coletar por centrifugação
4. Prepare tiras PCR de 8 tubos. Designe um tubo para cada amostra, incluindo controles positivos e negativos
5. Dispense o volume apropriado da mistura PCR em cada tubo da tira
6. Adicione o volume apropriado de modelo de DNA das amostras, bem como 5 μL do modelo positivo e 5 μL de água de grau molecular como controle negativo, nos respectivos tubos PCR.
7. Coloque a tampa com segurança na tira de 8 tubos e centrífuga por alguns segundos usando uma minicentrifuge
8. Coloque a tira de 8 tubos em um termociclador
9. Defina o programa PCR apropriado para ser executado no termociclador. Um programa típico consiste no seguinte
   1. Denaturação a 94 °C por 3 min.
   2. 30-40 ciclos de amplificação: desnaturação a 94 °C para 30 s, ressarem a temperatura específica do primer (geralmente entre 50-60 °C) para 30 s, e extensão a 72 °C para 30 s / 500 bp.
   3. Prorrogação final a 72 °C para 7-10 min.

4. Preparação do Gel Agarose

1. Com base no volume de gel desejado e concentração de gel(Tabela 2),pesa a quantidade apropriada de pó de agarose em um frasco de Erlenmeyer de 125 mL.
2. Adicione o volume apropriado de tampão de gel no frasco e gire o frasco à mão.
3. Aqueça a mistura tampão-agarose em um forno de micro-ondas em alta potência por 1 min.
4. Remova o frasco do micro-ondas e gire à mão para garantir que toda a agarose tenha dissolvido. Se a agarose não tiver se dissolvido completamente, repita a microwaving em incrementos de 30 s.
5. Depois de fixar firmemente a tampa no frasco, esfrie-a a 50 °C girando sob água fria.
6. Adicione 1 μL de brometo de etídio (EtBr) à mistura de agarose usando uma micropippette designada para EtBr. EtBr é um corante que une ácidos nucleicos de dupla vertente e laranja fluoresces quando iluminado com luz UV. Observe que o EtBr é potencialmente cancerígeno, por isso devem ser usados equipamentos de proteção individual (óculos, jaleco, luvas resistentes ao EtBr).
7. Despeje o gel derretido em uma bandeja de fundição de gel de eletroforese. Certifique-se de que nenhuma bolha está presa dentro da agarose. Coloque um pente no gel e aperte com segurança. Espere aproximadamente 20-30 min para o gel se solidificar.
8. Uma vez que o gel tenha solidificado, remova o pente cuidadosamente sem causar lágrimas no gel. O pente cria poços no gel para carregar as amostras.

5. Eletroforese de gel

1. Coloque o gel de agarose solidificado na câmara de eletroforese.
2. Adicione o buffer de corrida apropriado na câmara até que o gel mal esteja submerso.
3. Em um pedaço de Parafilm, manchas de pipeta de concentrado de corante de carga. Inclua também uma escada de DNA de uma gama adequada para os tamanhos esperados dos produtos PCR. Alternativamente, use um conjunto fresco de tubos de microfuge, um para cada amostra.
4. Uma vez que o PCR esteja concluído, recupere essa tira de 8 tubos do termociclador e centrífugas brevemente para coletar quaisquer condensados. Adicione um volume apropriado de produto de DNA ao corante de carregamento e pipeta para cima e para baixo para misturar. Por exemplo, 2 μL de corante de carregamento de 10x é misturado com 8 μL de amostra para dar um volume final de 10 μL, com o corante em 1x.
5. Pipeta cada mistura de amostra de corante nos poços designados no gel de agarose, tomando cuidado para não perfurar os poços.
6. Ligue os eletrodos à câmara de eletroforese. O DNA é carregado negativamente, por isso "corre" em direção ao eletrodo positivo. Portanto, conecte o eletrodo positivo ao lado oposto da câmara, onde os poços foram carregados. Defina a fonte de alimentação para uma tensão apropriada para o sistema tampão e o tamanho da câmara de gel e ajuste-a para funcionar. Pequenas bolhas devem ser visíveis movendo-se para os lados da câmara se a eletroforese estiver procedendo corretamente.
7. Uma vez que a frente de corante tenha avançado o suficiente para baixo do gel, desligue a fonte de alimentação. Transporte cuidadosamente o gel para o transilluminador ou imagem visual e ligue a luz UV para visualizar as bandas de DNA no gel.
8. Analise o tamanho da banda e as posições do gel. Compare as posições de banda das amostras com o controle positivo para determinar se o DNA do organismo de interesse está presente na amostra (Figura 1).

Componente	Volume por tubo(μL)	Volume para 5 tubos(μL)	Concentração Final
Tampão 10x Ex Taq	5.0	25	1x
DNTPs de 2,5 mM	4.0	20	0,2 mM
Primer forward*	2.0	10	400 nM
Primer reverso*	2.0	10	400 nM
Molecular H2O	31.75	158.75	-
Ex Taq	0.25	1.25	2.5 U
Mistura PCR	45	225

Mesa 1. Volumes de reagentes para mix mestre pcr. *Os volumes do primer variam dependendo do ensaio do organismo. Ajuste o volume de água de grau molecular para fazer o volume final 45 μL. Os volumes de outros componentes não devem variar.

% recomendado de Agarose	Resolução ideal para fragmentos lineares de DNA (pares de base)
0.5	1,000-30,000
0.7	800-12,000
1.0	500-10,000
1.2	400-7,000
1.5	200-3,000
2.0	50-2,00

Mesa 2. O tamanho do fragmento de DNA varia idealmente resolvido por diferentes porcentagens de gel de agarose.