Detecção de Microrganismos Ambientais com Reação em Cadeia da Polimerase e Eletroforese em Gel

A reação em cadeia de polimerase, ou PCR, é uma técnica biológica fundamental que é amplamente aplicada à detecção e identificação de microrganismos presentes no solo, água e outras amostras ambientais.

Classicamente, os microrganismos são cultivados em laboratórios usando mídia especializada de crescimento. No entanto, muitos micróbios no ambiente natural são “não culturable” – seja porque eles têm atividade metabólica muito baixa ou taxa de crescimento, ou porque eles têm requisitos de crescimento muito rigorosos que podem não ser replicáveis em um prato de cultura. As diferenças na culturabilidade entre micróbios também significam que, quando os microrganismos de uma amostra ambiental são cultivados, sua relativa abundância na cultura pode não refletir seus níveis reais no ambiente.

O advento da PCR, que pode especificamente amplificar até mesmo pequenas quantidades de DNA presentes em uma amostra mista, possibilita detectar e identificar rapidamente micróbios específicos de interesse, mesmo aqueles que não são culturais, dentro da complexa variedade de organismos presentes em uma amostra ambiental.

Este vídeo introduzirá os princípios do PCR. Em seguida, discutirá um protocolo geral para a realização de PCR no DNA isolado de uma amostra ambiental, a fim de detectar a presença de um organismo de interesse. Finalmente, várias aplicações de identificação de micróbios baseadas em PCR serão exploradas.

A premissa básica do PCR é usar ciclos repetidos de mudanças de temperatura sequenciais para alcançar a amplificação exponencial do DNA, geralmente com uma máquina conhecida como termociclador para pedalar automaticamente através das diferentes temperaturas. A síntese de DNA é realizada por enzimas de polimerase de DNA que são obtidas de bactérias que vivem em fontes termais, como Thermus aquaticus ou “Taq”. Estas polimerases são estáveis em calor, permitindo-lhes suportar as altas temperaturas utilizadas durante a PCR.

A sequência de destino, conhecida como amplicon, é amplificada a partir do modelo de DNA usando dois pequenos trechos de nucleotídeos conhecidos como “primers”. Devido à alta especificidade da ligação de ácido nucleico complementar, os primers permitem a amplificação direcionada de sequências de interesse muito específicas. Ao projetar primers que só amplificarão uma sequência única, ou uma combinação única de sequências, a partir de um organismo de interesse, o PCR pode ser usado para detectar diferencialmente para a presença do DNA desse organismo entre todos os materiais genéticos presentes em uma amostra ambiental complexa.

Cada ciclo pcr é dividido em três fases. O primeiro, conhecido como “desnaturação”, é geralmente definido acima de 92 °C e dura cerca de 30 s. A desnaturação é usada para quebrar moléculas de DNA em fios únicos, para permitir que a reação de amplificação prossiga.

A segunda fase, “ressarida”, é fixada de 2 a 3 °C abaixo da temperatura de fusão dos dois primers, geralmente entre 50 a 65 °C, e também dura cerca de 30 s. A temperatura de fusão é a temperatura em que 50% das moléculas de DNA de duplar encalhadas se separaram em fios únicos, e assim o passo de ressarem permite que os primers se liguem aos seus locais alvo no modelo de DNA.

A terceira fase de um ciclo PCR é “alongamento” ou “extensão”, quando a polimerase de DNA se liga ao duplex de modelo de primer e catalisa a síntese dos novos fios. Fixada em 72 °C para a polimerase PCR mais utilizada, Taq, a duração desta fase depende do comprimento da amplicon, geralmente 30 s por 500 pastas base. Após cada ciclo, o DNA amplificado é mais uma vez desnaturado e serve como um novo modelo, levando a um aumento exponencial na quantidade de produtos PCR.

Uma vez que a reação esteja completa, os produtos PCR podem ser resolvidos pelo tamanho de um “gel” geralmente feito da agarose do polímero, um processo conhecido como eletroforese. Um campo elétrico é aplicado através do gel, e as cargas negativas na espinha dorsal das moléculas de DNA fazem com que elas migrem para o lado positivo do campo. De um modo geral, moléculas de DNA linear que são maiores levarão mais tempo para viajar através da matriz de gel.

Agora que você entende como funciona o PCR, vamos dar uma olhada em como a reação pode ser usada para identificar microrganismos em uma amostra ambiental.

Para começar, calcule o volume de cada reagente necessário com base no número de amostras a serem processadas, mais 10% adicionais para contabilizar erros de pipetação. Um modelo de controle positivo – que contém a região alvo – deve ser incluído para garantir que a reação esteja funcionando; bem como um controle negativo onde nenhum modelo de DNA está incluído, a fim de excluir a contaminação em qualquer um dos componentes de reação. Mantenha a enzima de polimerase Taq no gelo, e descongele o resto dos reagentes e as amostras de DNA à temperatura ambiente a uma coifa designada para evitar contaminação.

Uma vez que todos os reagentes tenham descongelado, constitua o reagente “mix mestre” adicionando o volume calculado de cada reagente em um tubo de microfuça de baixa ligação, o que minimiza discrepâncias em quantidades de reagente devido à adsorção de moléculas à superfície do tubo. Vórtice suavemente e centrífuga cada reagente antes de adicionar. Uma vez que a mistura mestre é preparada, vórtice para misturar e coletar por centrifugação.

Rotule uma tira PCR de 8 tubos para designar um tubo para cada amostra, incluindo os controles. Dispense a quantidade apropriada de mistura mestre pcr em cada tubo da tira. Em seguida, adicione cada amostra de DNA ao respectivo tubo.

Coloque a tampa da tampa com segurança no tubo de tira e centrífugue brevemente em uma mini centrífuga com um adaptador de tira. Em seguida, coloque o tubo no termociclador e execute a reação de acordo com o programa PCR apropriado.

Enquanto o PCR está sendo executado, prepare um gel de agarose para a eletroforese dos produtos PCR. Pese uma quantidade apropriada de pó de agarose para um gel com uma concentração que pode resolver os produtos PCR com base em seus tamanhos esperados. Adicione a agarose em um frasco de 125 mL, em seguida, adicione o volume apropriado de tampão de gel no frasco, com base no volume do molde de gel, e redemoinho para misturar. Micro-ondas a solução agarose em alta potência por 1 min. Quando estiver concluído, verifique se a agarose se dissolveu totalmente girando o frasco e repita a micro-ondas em incrementos de 30 s, se necessário.

Segure firmemente a tampa no frasco e esfrie a solução agarose a 50 °C girando o frasco sob água fria. Uma vez resfriado, adicione 1 μL de brometo de ethidium à agarose. Como o brometo de ethidium é potencialmente cancerígeno, certifique-se de usar equipamentos de proteção individual, como óculos, jaleco e luvas resistentes ao brometo de ethidium.

Despeje a solução agarose em uma bandeja de fundição de gel de eletroforese, certificando-se de que nenhuma bolha de ar está presa dentro da ágarose. Coloque um pente com o número necessário de poços na solução. Deixe o gel em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos para solidificar. Uma vez que o gel esteja definido, remova cuidadosamente o pente, certificando-se de não rasgar o gel no processo.

Coloque o gel solidificado na câmara de eletroforese. Adicione o tampão LB na câmara até que o gel esteja submerso. Em um pedaço de Parafilm, pipeta um “ponto” de escada de DNA de uma faixa adequada para o tamanho esperado dos produtos PCR. Recupere os tubos PCR com as reações completas do termociclador. Colete condensados nos tubos PCR por breve centrifugação e adicione 8 μL de cada amostra ao Parafilm. Adicione 2 μL de corante de carga de 10x em cada ponto do produto PCR, de modo que a concentração final do corante seja de 2x.

Carregue as amostras e a escada nos poços designados no gel de agarose, tomando cuidado para não perfurar o gel. Uma vez que o carregamento esteja completo, coloque a tampa na câmara de eletroforese e conecte os eletrodos à fonte de alimentação. Como o DNA é carregado negativamente e migra para o eletrodo positivo, certifique-se de que os poços estão do lado mais próximo do eletrodo negativo. Ligue a fonte de alimentação e coloque-a em uma tensão apropriada para o tamanho da câmara de eletroforese e o sistema tampão que está sendo utilizado. Coloque a eletroforese para “correr”. Pequenas bolhas movendo-se pelos lados da câmara serão observadas se a eletroforese estiver procedendo corretamente.

Uma vez que a frente de corante tenha avançado o suficiente para baixo do gel, desligue a fonte de alimentação. Transporte cuidadosamente o gel para um imager de gel para visualizar os produtos eletroforesados. Com um escudo protetor, ligue a luz UV e visualize as bandas de DNA no gel. Analise a posição das bandas para ver se corresponde ao padrão esperado que indica a presença da espécie de interesse na amostra ambiental.

Agora que você viu como o PCR é realizado, vamos olhar para várias maneiras que é aplicada para detectar microrganismos de interesse no meio ambiente.

Um uso da detecção microbiana ambiental baseada em PCR é identificar organismos causadores de doenças, como a “ameba comedora de cérebro” Naegleria fowleri, um organismo unicelular encontrado em corpos de água doce e piscinas não cloloradas que podem atacar o sistema nervoso humano, muitas vezes fatalmente. A presença deste micróbio mortal em amostras de água ou no fluido cefalorraquidiano de pacientes suspeitos pode ser testada através da realização de PCR usando primers que visam sequências de DNA únicas no genoma da ameba.

Outro pedido de identificação microbiana baseada em PCR é testar a presença de bactérias patogênicas em moscas presas nas proximidades de estabelecimentos alimentares, como parte de investigações de monitoramento de saúde pública e surtos de doenças.

Aqui, os pesquisadores procuraram a presença de bactérias patogênicas como Salmonella e Listeria,isolando primeiro bactérias da superfície do corpo e do canal digestivo das moscas, e depois usando condições culturais específicas das espécies para enriquecer para essas espécies de interesse. Depois de extrair DNA de qualquer bactéria que fosse cultivada, kits pcR de detecção específicos de espécies disponíveis comercialmente foram usados para testar sua identidade.

Finalmente, diferentes cepas de bactérias patogênicas resistentes a antibióticos, como o Staphylococcus aureus, que apresentam grandes preocupações com a saúde pública, podem ser identificadas e diferenciadas com a PCR.

Neste exemplo, os pesquisadores isolaram e cultivaram S. aureus a partir de amostras clínicas, depois extraíram DNA das colônias bacterianas e realizaram PCR. As reações de amplificação aqui foram “multiplexadas”, o que significa que vários conjuntos de primer visando diferentes regiões únicas do genoma bacteriano foram combinados na mesma reação. Conjuntos de primer individuais foram projetados para que os produtos PCR resultem de DNA de apenas algumas cepas, mas não outras, de modo que, em combinação, padrões únicos de banda de produto foram observados para cada cepa.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre detecção de microrganismos baseados em PCR. Nós olhamos para os princípios por trás da reação em cadeia de polimerase; um protocolo para a realização de PCR no DNA extraído de microrganismos ambientais; e, finalmente, várias aplicações específicas dessa técnica para testar organismos de interesse em diferentes tipos de amostras ambientais ou clínicas. Obrigado por assistir!