Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Este procedimento começa com a preparação de uma larva de drosófila, invertida para expor a superfície das células musculares da parede corporal, associada a neurônios motores e células ggl, combinando coloração fluorescente para terminais neuronais pré-sinápticos, expressão endógena de GFP e DS vermelho, direcionados às membranas gliais e musculares pós-sinápticas, e visualização do espaço pós-sináptico paras utilizando corantes fluorescentes. Uma imagem clara das alterações estruturais que ocorrem na junção neuromuscular glial pode ser observada em uma preparação viva. Olá, sou D Brink do laboratório de Vanessa sobre ELA, no departamento de zoologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Hoje vou mostrar a vocês uma preparação de tecido e duas técnicas de marcação celular para imagens de tecido de larvas de al vivas em microscopia confocal.

Utilizamos este procedimento no laboratório para estudar as células gliais na junção neuromuscular. Agora, para algo completamente diferente, o preparo tecidual de dentro para fora começa com a estagiamento das larvas. Este procedimento será demonstrado em larvas de terceiro estágio vagantes, pois são grandes e fáceis de dissecar; utilize apenas larvas W3 que estejam ativamente rastejando.

Em seguida, limpe a superfície das larvas com um pincel muito macio em uma placa de Petri contendo água duplamente destilada. A limpeza das larvas é importante porque resulta em melhor qualidade óptica e também reduz a presença de bactérias. Após a limpeza das larvas, transfira-as para uma placa de Petri pequena com três mililitros de HL6 gelado contendo glutamato cinco milimolar.

Coloque a placa sobre gelo até que o animal pare de se mover e relaxe, o que geralmente leva cerca de dois minutos. Uma vez que as larvas tenham parado de se mover, você pode iniciar a dissecação do tecido usando um microscópio de dissecação, segurando a tesoura de mola na mão dominante e a pinça de ponta muito fina. Com a outra mão, faça um pequeno orifício na parede corporal com a tesoura para equalizar a pressão através da parede corporal, segurando suavemente o animal no fundo da placa.

Com a pinça, corte os dois segmentos posteriores e dissecque as vísceras. Algum corpo gorduroso provavelmente sairá da cavidade corporal através da incisão. Remova também esse tecido.

Continue segurando suavemente as larvas contra o fundo do recipiente com a pinça fina. Com a outra mão, segure um pino de inseto nº 0 de ponta romba e empurre-o contra as peças bucais das larvas. Empurre as peças bucais através da cavidade corporal, como se estivesse virando uma meia do avesso sobre o punho.

O tecido com o lado interno voltado para fora deve ter esta aparência. Com a tesoura de dissecação fina de mola, dissecar o corpo gorduroso e os traqueus da parede corporal. Remover o máximo possível do corpo gorduroso.

Tente ao máximo não puxar as traqueias nem desconectar o sistema nervoso. Rasgar as traqueias causará furos nos músculos da parede corporal. Quando você terminar a dissecação, o músculo deve estar translúcido e relaxado, não opaco ou contraído.

Se você colocar o músculo em HL seis sem glutamato à temperatura ambiente, ele provavelmente contrairá de forma rítmica. Como os geradores de padrão motor no SNC estão ativos, a parede corporal intacta invertida tende a dobrar ao meio ao longo das linhas médias dorsal e ventral. Assim, o preparado fornece um animal hemi esquerdo ou direito para visualização.

Por fim, monte o tecido em uma lâmina de microscópio com um arranjo de lamínula sustentada por pontes. Os procedimentos para o montagem do tecido serão mostrados posteriormente. Para iniciar a marcação dos bastões neuronais, pipete 30 microlitros de solução do anticorpo primário anti-HRP marcado com fluorescência em HL6 e coloque uma gota em uma placa de Petri.

Em seguida, imergir o preparado da parede do corpo invertido na cuba de coloração. Pode-se observar a marcação dos terminais neuronais após cerca de cinco minutos, mas incubar por 10 a 20 minutos para uma marcação completa e intensa.

Para remover o excesso de marcador de HRP, coloque o tecido em meio mililitro de HL6 por 10 a 30 segundos à temperatura ambiente. O corante não ligado é removido rapidamente, portanto, o ciclo de lavagem não precisa ser longo nem vigoroso. O tecido marcado está agora pronto para ser montado e visualizado por microscopia.

Uma variação no protocolo de marcação com anticorpos vivos mostrado anteriormente consiste em usar uma dextrina conjugada com fluoróforo para destacar os espaços extracelulares preenchidos por fluido. Para iniciar este procedimento, dilua o corante de dextrina conjugada com fluoróforo em HL6 a 0,001 miligramas por mililitro. Pode ser necessário variar a concentração da dextrina se você não estiver preocupado com o momento exato da entrada do eixo di no espaço extracelular.

Pipete uma gota de 20 microlitros de corante sobre uma lamínula com ponte e transfira a preparação do tecido para o banho de corante. Se o tecido invertido não precisar ser perfundido ou se o volume de HL seis precisar ser mantido pequeno, ele pode ser montado em uma lâmina com dupla ponte. Comece colando com supercola duas lamínulas quadradas de 18 milímetros sobre uma lâmina de microscópio muito limpa.

Deixe uma lacuna de dois milímetros entre as bordas das lamínulas e centralize a lacuna, aproximadamente no meio da lâmina. Deixe a cola secar completamente, caso contrário, ela formará uma película sobre o meio aquoso ao redor da sua preparação tecidual.

Em seguida, coloque uma gota de 30 microlitros de HL seis no espaço entre as lamínulas. Posicione o tecido com o lado interno voltado para cima na gota de HL seis. Pode ser necessário posicionar o tecido em diagonal se a larva for grande e o seu sistema de aquisição de imagens tiver uma matriz de pixels limitada.

Aplicar uma pequena quantidade de vaselina nas bordas de um terceiro lamínula de 18 milímetros e colocá-lo com a face untada voltada para baixo sobre os dois lamínulas colados, cobrindo o tecido, pressionando suavemente. Abaixo estão os resultados obtidos com nossos dois métodos de marcação fluorescente aguda da preparação de larva invertida, obtidos com um microscópio confocal de disco giratório. A primeira é uma imagem em pilha óptica de uma sinapse nervo-muscular glial com terminais de botão marcados com anti-HRP vivo.

Na superfície da célula muscular, podemos observar terminais do tipo botão neuronal intensamente marcados, coloridos artificialmente em azul. No meio da pilha de imagens, encontramos extensões gliais marcadas com GFP, mostradas em verde, bem como botões marcados com HRP azul. Ao circular os botões, podemos ver seções transversais da SSR semelhante a bolsos, as retículas subsinápticas, que são coloridas em vermelho, sendo que, também no meio da pilha e mais profundamente na pilha, estão a SSR marcada em vermelho DS.

As SSR são regiões sinápticas especializadas da célula muscular. Os bns se alojam nos bolsos das células musculares, assim como algumas partes das extensões gliais verdes. As extensões das células gliais se intercalam ao redor dos BNS e SSR, mas não cobrem a superfície da sinapse como um cobertor nas camadas mais profundas da pilha.

Encontramos extensões gliais verdes e a SSR vermelha, mas não tantos terminais em botão. Também é possível observar secções transversais do nervo motor que inerva o músculo. As células gliais envolvem o nervo motor, portanto ele também é verde.

O segundo resultado da marcação fluorescente aguda do preparo larval invertido é a sinapse marcada com dextrina fluorescente. Aqui, o fluido no espaço parasináptico ou fenda sináptica é marcado em vermelho. Nas camadas superficiais da imagem da pilha óptica, há uma camada de fluido de corante de dextrina vermelha, e é possível observar onde ela se acumula nas depressões onduladas da membrana plasmática muscular.

Em camadas mais profundas da pilha de imagens, o corante fluorescente de dextrina penetrou nas fendas sinápticas, formando pequenos anéis em forma de rosca de corante entre os terminais neuronais e os bolsos SSR marcados em azul. Esta é a fenda sináptica destacada com corante. A lâmina glial verde não impede a penetração do corante na fenda nas camadas mais profundas da pilha de imagens.

As características mais proeminentes são a SSR ou região sináptica do músculo marcada em azul e as extensões gliais achatadas, que são verdes. Da mesma forma, a bainha glial ao redor dos axônios desnervados vista em camadas profundas é verde. A bainha glial parece excluir o corante dextrina.

Acabo de mostrar a vocês um método inovador para visualizar a sinapse glio-neuromuscular em um preparo tecidual invertido de larvas de drosófila. Ao preparar o tecido, é importante lembrar-se de manipulá-lo com cuidado e garantir que o músculo esteja relaxado e que os nervos periféricos não sejam danificados. Gostaria de concluir com uma citação de Marx.

O tempo voa como uma flecha. O medo voa como uma banana.