Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Este procedimento começa com a preparação de uma larva de drosófila para que ela seja virada do avesso para expor a superfície celular muscular da parede do corpo a neurônios motores associados e células ggl, combinando coloração fluorescente para terminais de neurônios pré-sinápticos, expressão endógena de GFP e vermelho DS, direcionada às membranas celulares musculares gliais e pós-sinápticas e visualização do espaço sináptico paras Usando corantes fluorescentes, Uma imagem clara das mudanças estruturais que ocorrem na junção neuromuscular glial pode ser observada em uma preparação viva. Olá, sou D Brink no laboratório de ELA de Vanessa na Universidade da Colúmbia Britânica, no departamento de zoologia. Hoje vou mostrar uma preparação de tecido e duas técnicas de marcação de células para imagens de tecido de larvas de al vivo para microscopia confocal.

Usamos esse procedimento no laboratório para estudar as células gliais na sinapse do músculo nervoso. Então, agora, para algo completamente diferente, a preparação do tecido de dentro para fora começa com o estadiamento das larvas. Este procedimento será demonstrado em terceiras larvas errantes porque são grandes e fáceis de dissecar, use apenas três larvas W que estão rastejando ativamente.

Em seguida, limpe a superfície das larvas com um pincel bem macio em uma placa de Petri com água bidestilada A limpeza das larvas é importante porque resulta em melhor óptica e também reduz as bactérias. Depois que as larvas forem limpas, transfira-as para uma pequena placa de Petri com três mililitros de HL seis gelados com cinco milimolares de glutamato.

Coloque o prato no gelo até que o animal pare de se mover e relaxe, o que geralmente leva cerca de dois minutos. Uma vez que as larvas pararam de se mover, você pode começar a dissecção do tecido usando um microscópio de dissecção segurando a tesoura de mola em sua mão dominante e a pinça de ponta muito fina. Por outro lado, faça um pequeno orifício na parede do corpo com a tesoura para equilibrar a pressão na parede do corpo enquanto segura o animal suavemente no fundo do prato.

Com a pinça, corte os dois segmentos posteriores, disseque as vísceras. Algum corpo gordo provavelmente sairá da cavidade corporal através da incisão. Corte esse tecido também.

Continue a segurar as larvas suavemente contra o fundo do prato com a pinça fina. Com a outra mão, segure um alfinete de inseto número zero de ponta cega e empurre-o contra as partes da boca das larvas. Empurre as partes da boca através da cavidade do corpo como se estivesse virando uma meia do avesso em seu punho.

O tecido de dentro para fora deve ficar assim. Com a tesoura de mola de dissecação ultrafina, disseque o corpo gordo e as traqueias da parede do corpo. Remova o máximo de corpo gordo que puder.

Tente muito não puxar as traqueias ou desconectar o sistema nervoso. Rasgar as traqueias fará buracos no músculo da parede do corpo. Quando você terminar a dissecção, o músculo deve estar translúcido e relaxado, não opaco ou contraído.

Se você colocar o músculo em HL seis sem glutamato à temperatura ambiente, ele provavelmente se contrairá ritmicamente. Como os geradores de padrão motor no SNC estão ativos, a parede corporal intacta de dentro para fora tende a se dobrar ao meio ao longo das linhas médias dorsal e ventral. Portanto, a preparação dá um hemi animal esquerdo ou direito para visualizar.

Por fim, monte o tecido em uma lâmina de microscópio com um arranjo de lamínula em ponte. Os procedimentos para montar o tecido serão mostrados posteriormente. Para começar a marcar os bastões neuronais, pipete 30 microlitros de solução primária de anticorpo anti-HRP marcada com fluorescência em HL seis e coloque uma gota em uma placa de Petri.

Em seguida, mergulhe a preparação da parede do corpo de dentro para fora. No banho de matriz. Você pode ver a rotulagem do terminal do neurônio após cerca de cinco minutos, mas incube por 10 a 20 minutos para obter um rótulo completo e brilhante.

Para enxaguar o excesso de rótulo HRP, coloque o tecido em meio mililitro de HL seis por 10 a 30 segundos em temperatura ambiente. O corante não ligado é enxaguado rapidamente, de modo que o ciclo de enxágue não precisa ser longo ou vigoroso. O tecido marcado agora está pronto para ser montado e visualizado por microscopia.

Uma variação do protocolo de marcação de anticorpos vivos que acabamos de mostrar é usar uma dextrina conjugada fluorescente para destacar espaços extracelulares cheios de líquido. Para iniciar este procedimento, dilua o corante dextrina conjugado fluorescentemente em HL seis a 0,001 miligramas por mililitro. Pode ser necessário variar a concentração de dextrina se você não estiver preocupado com o tempo exato do eixo di no espaço extracelular.

Pipete uma gota de 20 microlitros de corante em uma lamínula em ponte e transfira a preparação do tecido para o banho de corante. Se o tecido de dentro para fora não precisar ser perfundido ou o volume de HL seis deve ser mantido pequeno, ele pode ser montado em uma lâmina de ponte dupla. Comece colando duas lamínulas quadradas de 18 milímetros em uma lâmina de microscópio muito limpa.

Deixe um espaço de dois milímetros entre as bordas das lamínulas e centralize a lacuna. Mais ou menos no meio do slide. Deixe a cola secar completamente ou ela formará uma película sobre o meio aquoso ao redor da preparação do tecido.

Em seguida, coloque uma gota de 30 microlitros de HL seis no espaço entre as lamínulas. Posicione o tecido de dentro para fora na gota de HL seis. Pode ser necessário posicionar o tecido na diagonal se a larva for grande e seu sistema de aquisição de imagens tiver uma matriz de pixels limitada.

Aplique uma pequena quantidade de vaselina nas bordas de uma terceira lamínula de 18 milímetros e coloque-a com o lado da graxa voltado para baixo nas duas lamelas coladas sobre o tecido, pressione suavemente. Aqui estão os resultados de nossos dois métodos de marcação fluorescente aguda da preparação de larva de dentro para fora obtida com um microscópio confocal de disco giratório. A primeira é uma imagem de pilha óptica de uma sinapse do músculo do nervo glial com terminais Buton anti-HRP ao vivo.

Na superfície da célula muscular, podemos ver terminais do tipo buton de neurônio brilhantemente marcados, pseudocoloridos em azul. No meio da pilha de imagens, encontramos extensões gliais rotuladas com GFP mostradas em verde, bem como bastões rotulados com HRP azul. Ao circular os bastões, podemos ver seções transversais do bolso como SSR, os subs, retículos sinápticos, que são coloridos de vermelho também no meio da pilha e no fundo da pilha são o DS rotulado de vermelho SSR.

Os SSR são as regiões sinápticas especializadas da célula muscular. Os bns aninham-se dentro das bolsas nas células musculares, assim como algumas partes das extensões gliais verdes. As extensões das células gliais se intercalam em torno do BNS e SSR, mas não cobrem a superfície da sinapse como um cobertor nas camadas mais profundas da pilha.

Encontramos extensões gliais verdes e o SSR vermelho, mas não tantos dos terminais buton. Também podemos encontrar seções transversais do nervo motor que inerva o músculo. As células gliais envolvem o nervo motor, portanto, ele também é verde.

O segundo resultado da marcação fluorescente aguda da preparação larval de dentro para fora é a sinapse marcada com dextrina fluorescente. Aqui, o fluido no espaço sináptico paras ou fenda sináptica é rotulado em vermelho. Nas camadas superficiais da imagem da pilha óptica, há uma camada fluida de corante de dextrina vermelha, e você pode ver onde ela se acumula nas depressões de ondulação na membrana plasmática do músculo.

Nas camadas mais profundas da pilha, o corante fluorescente de dextrina se infiltrou nas fendas sinápticas, pequenos anéis em forma de rosquinha de corante de piscina se formam entre os terminais dos neurônios e os bolsos SSR rotulados em azul. Esta é a fenda sináptica destacada com corante. A lamela glial verde não bloqueia a penetração do corante na fenda nas camadas mais profundas da pilha de imagens.

As características mais proeminentes são a SSR ou região sináptica do músculo rotulada em azul e as extensões gliais planas que são verdes. Da mesma forma, a bainha glial ao redor dos axônios enervantes vistos em camadas profundas é verde. A bainha glial parece excluir o corante dextrina.

Acabei de mostrar a você uma nova maneira de visualizar a sinapse do músculo do nervo glial em uma preparação de tecido de dentro para fora de larvas de drosófila. Ao preparar o tecido, é importante lembrar de se esforçar para manusear o tecido com cuidado e garantir que o músculo esteja relaxado e que os nervos periféricos não sejam danificados. Gostaria de concluir com uma citação de Marx.

O tempo voa como uma flecha. O medo voa como uma banana.