A Multi-Parametric Sistema Perifusion Islet dentro de um dispositivo Perifusion microfluídicos

Nesta apresentação, apresentaremos um sistema de perfusão palpebral baseado em microfluídica para medição simultânea da secreção dinâmica de insulina, influxo de cálcio e alterações potenciais mitocondriais dos ilhós pancreáticos em resposta aos cães secretores de insulina. O sistema de perfusão é composto por um dispositivo microfluídico de três camadas, bombas de seringa e um coletor de frações de insulina. O influxo de cálcio induzido por secretagogos e os potenciais mitocondriais são visualizados usando a configuração do microscópio fluorescente.

Olá, meu nome é Ola, um Waller do laboratório do Dr. Val Holter no Departamento de Cirurgia de Transplante da Universidade de Illinois em Chicago. Olá, sou Don Lee, também do Laboratório de Outubro. Olá, sou Tricia Hart, também do laboratório de Dr.Al Holster.

Hoje mostraremos um procedimento para imagem simultânea das pálpebras usando um gradiente linear de glicose. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar o visual e a função dos ilhós. Então vamos começar.

O dispositivo microfluídico usado para este procedimento é montado a partir de três camadas de PDMS curado gerado por fotolitografia padrão. A primeira camada gerada a partir de um mestre de silicone tem os poços do dispositivo microfluídico que manterá suavemente os ilhós no lugar, com 150 micrômetros de profundidade e 500 micrômetros de diâmetro. A segunda camada tem canais de 500 micrômetros de altura e dois milímetros de largura.

O meio do canal é expandido para espalhar o fluxo para melhor troca de solução Dentro do dispositivo, em troca bem é feito perfurando um furo de três milímetros de altura e sete milímetros de largura no meio da camada. A terceira camada é uma laje espessa de PDMS. Para preparar esta camada, faça pequenos orifícios em ambos os lados que se alinhem com a entrada e saída do canal.

Na segunda camada, uma vez que todas as três camadas tenham sido geradas, a primeira camada é colada a uma lâmina de vidro com os poços voltados para cima. A segunda camada é então ligada à primeira camada com o espaçamento do canal para cima. Finalmente, a terceira camada é ligada à segunda camada.

Uma vez que as camadas tenham sido coladas, o dispositivo está pronto para uso em experimentos. Usando uma seringa de 10 mililitros cheia de etanol a 70% e conectada à porta de entrada do dispositivo com Tai na tubulação, esterilize o dispositivo microfluídico fluindo o etanol através dos canais do dispositivo. Em seguida, usando o mesmo fluxo de configuração, água deionizada para lavar o etanol.

Uma vez que o dispositivo tenha sido esterilizado, coloque-o em um microscópio aquecido stage usando tubo de tigon, conecte as bombas de seringa contendo soluções de glicose alta e baixa a um conector Y. Em seguida, conecte-se à entrada do dispositivo microfluídico. Conecte a saída do dispositivo microfluídico a um coletor de frações.

Certifique-se de que a tubulação esteja apoiada em uma placa quente de 37 graus Celsius. É muito importante manter as soluções em temperatura fisiológica durante todo o experimento. Em seguida, use o programa de visualização de laboratório para iniciar o gradiente de glicose que será perfundido através da rede microfluídica durante o experimento.

Este software varia a taxa de fluxo de duas soluções de glicose. Ao controlar as bombas de seringa, vários perfis de gradiente de glicose podem ser criados aqui, perfis de gradiente de glicose lineares, em forma de sino e quadrados. Em comparação com os valores esperados calculados mostrados neste experimento, o gradiente linear de glicose de dois milimolares a 25 milimolares será usado com uma taxa de fluxo variável de 0,01 mililitros por minuto das duas soluções de glicose e uma taxa de fluxo constante de 0,25 mililitros por minuto entrando no dispositivo após as soluções serem misturadas.

Depois que o perfil de gradiente apropriado for selecionado, teste a estabilidade do gradiente. Primeiro, inicie o sistema de gradiente. Em seguida, inicie o coletor de frações e colete perfuse oito em tubos de um mililitro eend orph.

Em seguida, usando um glicosímetro, teste a concentração de glicose em cada tubo usando o Excel. Analise os resultados obtidos com o glicosímetro. Em seguida, substitua a seringa de alta glicose por uma seringa contendo solução de 0,5% BSA em tampão de campainha Krebs PERFUSE 50 mililitros através do dispositivo a uma taxa de um mililitro por minuto.

Isso evitará a absorção inespecífica de insulina nas paredes do microcanal para garantir a precisão ao medir posteriormente os níveis de insulina secretada após a perfusão com BSA. Substitua-o pela solução de alto teor de glicose reus. Suspenda 25 a 30 ilhós de rato escolhidos a dedo em um tampão de Krebs de glicose de dois mili molares contendo o corante indicador de cálcio fira 2:00 AM e o indicador de potenciais mitocondriais corante rumina 1 2 3, incube por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Após a incubação, desconecte o dispositivo do sistema de perfusão e carregue cuidadosamente os ilhós no dispositivo microfluídico inserindo a ponta da pipeta, contendo as ilhotas na porta de entrada e, dispensando lentamente as ilhotas após o carregamento, reconecte o dispositivo ao sistema de perfusão. Tomando cuidado para não introduzir bolhas. Em seguida, ligue a bomba de seringa para começar a perfundir os ilhós com KRB contendo dois milimolares de glicose.

Esta etapa lavará o excesso de corante do meio, designará os conjuntos de filtros de excitação e emissão e os tempos de exposição a serem usados durante o experimento. Em seguida, defina o coletor de frações para coletar em intervalos de um minuto enquanto para usando os ilhós com a solução de baixa glicose. Use a ferramenta de região de interesse ou ROI do software de imagem PCI simples para definir as áreas ou ilhós que você deseja visualizar.

Além disso, circule a área de fundo que será subtraída após as células terem sido lavadas por 10 minutos, inicie o coletor de fração de gradiente de glicose e inicie a imagem de lapso de tempo. Após 30 minutos, desligue o software e a bomba de seringa de glicose alta. Continue perfundindo com glicose baixa para eliminar o efeito da glicose alta.

Após 10 minutos, interrompa o fluxo de glicose baixa desligando a bomba da seringa. Após a perfusão, exporte os dados para o Excel para análise. A quantidade de insulina secretada no perfu oito pode ser determinada por ilhós de camundongo ELA.

Foram perfundidos com um gradiente linear de glicose de dois a 25 milimolares, como mostrado aqui. O influxo de cálcio e a secreção de insulina são desencadeados após cerca de 13 minutos de perfusão, correspondendo a seis milimolares. Glicose. Mudanças nos potenciais mitocondriais são vistas mais cedo, como esperado em cerca de 11 minutos.

Esses dados demonstram a vantagem de usar essa rede microfluídica para caracterizar a fisiologia do ilhó. Acabamos de mostrar como usar nosso dispositivo de parafusão microfluídica para o estudo da fisiologia dos ilhós. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de garantir que não haja bolhas no dispositivo, pois isso pode fazer com que os ilhós se movam durante um experimento.

Além disso, a enxurrada pode ser ajustada em até um ml por minuto sem perturbar os ilhós. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.