Estimulação cerebral Slice Usando uma Rede microfluídicos e da Câmara de Perfusão padrão

O principal objetivo do projeto que vamos mostrar hoje é ser capaz de controlar espacial e temporariamente a estimulação do corte cerebral. E outro ponto importante é que, usando uma simples modificação na já complicada configuração eletrofisiológica, podemos disseminar esse dispositivo microfluídico entre os vários laboratórios que realmente usam essa estimulação da vida cerebral. Olá, sou Java Chek Mohammad do laboratório de Edington no Departamento de Bioengenharia da Universidade de Illinois em Chicago.

Hoje vou mostrar como vamos aplicar um dispositivo microfluídico simples e microfabricado para estimulação de fatias cerebrais. O dispositivo de fatia de cérebro que vamos demonstrar hoje é muito útil por vários motivos e os principais motivos são que é tão modular que pode se encaixar na configuração eletrofisiológica existente sem novas modificações. E evita o uso de tubos e bombeamentos, o que complica qualquer dispositivo microfluídico.

E como estamos usando o método de bombeamento passivo, não precisamos de tubulações ou bombas. E a terceira coisa é que é apenas uma fina folha de membrana PDMS que fica entre uma lamínula e uma câmara de profusão padrão, que é usada em uma configuração de eletrofisiologia padrão. O procedimento que vou demonstrar hoje começa com um mestre C oito, que é fabricado usando o processo de litografia SV oito padrão.

E o mestre que temos hoje aqui é um mestre de dois níveis com um nível com o design dos canais, os micro canais e outro design para aberturas de RV que vão em cima desses canais para que as soluções que estão fluindo pelos canais possam sair das aberturas de via. Então, fazemos esse mestre, que está em um wafer de silicone, e depois usamos silicone ou o PDMS para despejar na parte superior desse dispositivo e moldar as estruturas que estão em cima desse wafer no PDMS. Então, vamos fazer o PDMS derramar em cima deste dispositivo.

E então vamos pegar a membrana PDMS que é formada após a cura e colada a uma lamínula. E então temos nosso dispositivo microfluídico. E então vamos modificar uma câmara de profusão padrão citando uma fina camada de PDMS no fundo da câmara de perfusão.

E assim que tivermos essa câmara de perfusão modificada, vamos pegar o dispositivo microfluídico que fabricamos anteriormente e ligá-lo à câmara de perfusão. Existem dois pontos críticos na fabricação do dispositivo microfluídico. Uma delas é que antes de colocarmos o PDMS, a placa quente deve ser desligada para que o PDMS não enfileire instantaneamente quando a despejarmos no wafer.

E outro ponto crítico é que os espaçadores que usamos nos quatro cantos do wafer de silício devem ter uma altura menor que a estrutura mais alta do wafer de silício. Isso é para garantir que as aberturas VR possam ser obtidas quando fizermos o processo de cura do PDMS. Aqui estamos nós nesta sala limpa modular de parede macia e este é o mestre que fabricamos usando o padrão um processo de litografia C oito.

E é um mestre de dois níveis, com o primeiro nível tendo o design para os canais com quatro entradas e uma saída. E na região intermediária de todos os quatro canais, existem vias ou pos que estão em cima dos canais. E essas são as marcas de alinhamento que foram criadas durante o processo de fabricação.

E agora vou mostrar como vou removê-lo e fazer a cura do PDMS. Devido ao efeito de cordão de borda, a espessura na periferia externa do wafer é maior do que os dispositivos reais no centro do papel. Então, o que vamos fazer é remover essas marcas de alinhamento usando a lâmina de reserva e, em seguida, para acomodar os pesos, vamos usar esses espaçadores que têm 140 mícrons de altura e vamos colocá-los nos quatro cantos do wafer.

Portanto, você precisa ter certeza de que a lâmina de barbear não chega perto dos dispositivos reais. Agora vou remover essas partículas de SVA usando o espanador de ar e o wafer agora está pronto para a preparação do molde PDMS. Mas antes de fazer isso, precisamos colocar esses espaçadores com 140 mícrons de altura.

Então, vou colocar as quatro fitas nos quatro cantos do wafer. Em seguida, vou me certificar de que a fita está aderindo ao wafer corretamente. Portanto, a razão pela qual a fita tinha 140 mícrons de altura é que o mestre de dois níveis com os canais e o VS tem 150 mícrons de altura.

E quando colocamos o peso em cima do PDMS durante a cura do PDMS, queremos ter certeza de que a folha do PDMS saia plana. Então, estamos usando quatro espaçadores nos cantos com alturas iguais. Agora vou mostrar como vamos codificar o PDMS e curá-lo para fazer os dispositivos.

Mas antes de fazer isso, deixe-me mostrar como preparamos a solução PDMS. Então, pegamos 10 partes da base e uma parte do agente de cura e misturamos bem devido ao processo de mistura. Você vê que geramos muitas bolhas na solução PDMS para remover essas bolhas, vamos colocar o PDMS na dessecação depois de colocar o, depois de colocar o PDMS na dessecação por 10 minutos, não há bolhas.

E agora o PDMS está pronto para ser usado para a cura. Agora vou mostrar como vamos colocar o PDMS no wafer e curá-lo para obter a membrana PDMS. Então, vou colocar o PDMS no wafer e depois usar essa transparência para cobrir o PDMS.

E isso nos ajudará a remover o suporte do dispositivo, separar o dispositivo da transparência e, em seguida, vou colocar os pesos em cima da transparência. E a razão pela qual estamos usando os pesos é para obter uma espessura uniforme do PDMS. E outra questão crítica é obter as aberturas de via.

Então, onde quer que haja vs, não queremos PDMS e os pesos nos ajudarão a fazer isso. Como você pode ver aqui, a placa quente está desligada e a razão para isso é que não queremos que o PDMS cure instantaneamente, então o deixamos desligado. E então você precisa ter certeza de que o wafer está plano antes de portar o PDMS.

E agora podemos portar o PDMS que preparamos anteriormente. Certifique-se de dispensar o PDMS perto o suficiente do wafer para não gerar bolhas. E o ponto mais crítico aqui é a maneira como você coloca a transparência no topo do PDMS.

Você precisa ter certeza de que não gera bolhas devido à colocação da folha. E agora vou colocar um desses laboratórios de vidro e deixar o excesso de PDMS do PDMS sair do caminho. Estou colocando mais três laboratórios de vidro e para garantir que os laboratórios de vidro não se movam para este mestre em particular.

E para esses recursos específicos, descobrimos que colocar esses quatro laboratórios de vidro torna o VS. E para deixar o excesso de PDMS do PDMS sair do caminho entre a transparência e o wafer. Esperamos de um a dois minutos e então podemos iniciar a placa quente para diferentes mestres e para diferentes projetos, pode ser necessário aumentar o número de laboratórios de vidro ou diminuir os laboratórios de vidro para obter as aberturas de via. Agora a placa quente está pronta para ser ligada e vou definir uma temperatura de 75 graus.

E uma vez que a temperatura de 75 graus atinge, podemos definir o cronômetro para uma hora e deixar o PDMS curar. Agora que deixamos o PDMS curar por uma hora, podemos desligar a placa quente e deixá-la esfriar até 50 graus centígrados. A razão para fazer isso é para que o SEA não rache.

Se o removermos imediatamente de 75 graus para a temperatura ambiente, agora podemos desligá-lo e esperar que desça para 50 graus centígrados. Agora que a temperatura da placa quente caiu para 50 graus centígrados, podemos remover os pesos da transparência. Agora podemos remover o wafer do player quente e ele está pronto para ser cortado.

Agora a folha PDMS está pronta para ser removida do mestre C oito e precisamos remover a folha de alumínio. Em seguida, precisamos remover a folha de transparência. Temos aqui a câmara de perfusão padrão.

Nós o modificamos para que possamos alinhá-lo. Os orifícios, portas de entrada e saída do dispositivo microfluídico. Portanto, essas são as quatro portas de entrada e uma porta de saída na membrana PDMS.

E estes devem corresponder às quatro entradas e uma saída na câmara de perfusão. Agora vou deslizar a câmara de perfusão e alinhá-la com os orifícios da membrana PDMS. Agora que eles estão alinhados, está pronto para ser cortado.

Agora você pode remover a câmara e usar uma sonda. Certifique-se de que todas as bordas da membrana PDMS estejam livres para serem removidas. Depois de fazer isso, podemos usar um freezer para remover a membrana PDMS e garantir que, ao remover o PDMS da parte superior do dispositivo, você mova o PDMS bem devagar para não rasgar a membrana PDMS.

Agora vou colocar a membrana PDMS com as cavidades que são formadas com os oito mestres SC no topo e garantir que ela seja plana. E a razão pela qual estamos fazendo isso é que, quando fazemos os furos, as portas de entrada e saída, o PDMS não é áspero na lateral. Isso vai ser colado com a lamínula.

Portanto, precisamos ter certeza de que as cavidades estão na parte superior. Agora podemos fazer as portas de entrada e saída apenas para que possamos ver os furos claramente. Colocamos um fundo preto.

Agora vou fazer com que as portas de entrada e saída precisem se certificar de que não há PDMS deixado na porta. Assim é, remova qualquer PDMS. Agora vamos transferir a membrana PDMS para outra folha de transparência.

Assim, podemos tratar a folha e a lamínula com plasma e colocá-la de forma que, novamente, as cavidades ainda fiquem no topo. Então, uma vez que essa superfície é tratada com plasma e a lamínula é tratada com plasma, podemos unir essas duas superfícies para formar a rede microfluídica para remover as bolhas de ar entre a folha PDMS. E a transparência pode usar uma fita adesiva.

Portanto, isso garantirá que a folha PDMS seja plana e a colagem ocorra muito melhor. E, novamente, use a fita adesiva na superfície superior para remover qualquer poeira da membrana PDMS. Agora podemos colocar a lamínula que vamos colar com a membrana PDMS.

E agora esses dois PDMS e o vidro estão prontos para serem tratados com plasma. Vamos tratar o plasma do PDMS e da lamínula usando este sistema de plasma modificado por micro-ondas, onde você pode ver que esta câmara de vidro nos permite criar o plasma dentro deste micro-ondas. E deixe-me colocar as amostras dentro, criando vácuo dentro da câmara.

Agora posso fluir em oxigênio. Agora o sistema de plasma está pronto para funcionar e vou usar 10% de potência e 10 segundos para esse sistema específico para ajudar a visualizar o plasma. Enquanto o tratamento de plasma está acontecendo, nós ligamos, aumentamos a energia para cem por cento e desligamos as luzes.

E agora você pode ver o plasma imediatamente após o tratamento com plasma. Você precisa unir as duas superfícies, o deslizamento da vaca e o PDMS ou então a superfície do PDMS perderá sua hidrofilicidade devido ao tratamento com plasma. Depois de colocar o deslizamento de vaca, certifique-se de que toda a superfície esteja colada sem bolhas de ar.

Se houver bolhas de ar, você pode removê-las. Agora você o deixa de lado por cinco minutos e o deixa ligar. Então aqui temos a câmara de perfusão modificada onde modificamos a base da câmara com PDMS.

E isso foi feito antes. Então, colocamos uma transparência na placa quente em uma placa quente que estava desligada. E então derramamos o P-D-M-S-P-D-M-S que foi preparado de maneira semelhante à mostrada anteriormente.

E então colocamos a câmara de perfusão em cima do PDMS e, em seguida, colocamos um único peso como mostrado aqui e deixamos curar por 30 minutos ou 75 graus centígrados. E agora vou mostrar que, enquanto esperamos que o PDMS e a colagem da lamínula ocorram, podemos ir em frente e preparar a câmara. Assim, podemos unir a câmara e o dispositivo microfluídico.

Portanto, precisamos remover o excesso de PDMS de onde não precisamos. Remova a transparência e depois o PDMS, então precisamos remover o PDMS das portas de entrada e saída. Agora a câmara está pronta para ser colada com o dispositivo microfluídico que preparamos anteriormente.

Agora que esperamos cinco minutos, o dispositivo microfluídico está pronto para ser separado da transparência, mas você precisa ter certeza de remover a transparência em um ritmo lento. Portanto, o PDMS e a lamínula não se separam. Agora que a câmara de perfusão está pronta, precisamos tratar com plasma a superfície inferior da câmara onde acabamos de citar o PDMS e a superfície superior do dispositivo microfluídico que contém o PDMS.

Então, agora vamos colocar essas duas peças na câmara de plasma e fazer o tratamento de plasma a 10% de potência por 10 segundos. Agora, ambas as superfícies foram tratadas com o plasma e estão prontas para serem coladas. Antes de colar, você precisa se certificar de que as portas de entrada e saída da câmara estão alinhadas com o dispositivo microfluídico.

E como os recursos que estamos alinhando são grandes o suficiente, não precisamos de nenhum equipamento especial e podemos fazer isso a olho nu. Depois de alinhar e colocar em cima da câmara, certifique-se de que todas as superfícies estejam em contato e, em seguida, deixe-a descansar por cinco minutos. Portanto, a ligação é boa o suficiente para os experimentos depois de esperar cinco minutos.

Agora que o dispositivo microfluídico se ligou à câmara, vamos tornar os canais na superfície do canal hidrofílicos. Então, quando realmente fluímos a solução A CFS ou qualquer outro neurotransmissor, as soluções podem fluir mais facilmente. Então, o que vou fazer é colocar todo esse dispositivo no plasma e no plasma, tratá-lo por um minuto a 10% para que todas as superfícies do canal interno se tornem hidrofílicas.

E então eu vou enchê-lo com água e depois levá-lo para a configuração de eletrofisiologia para que possamos fazer os experimentos reais. Ok, agora estamos prontos para ir para a configuração de eletrofisiologia e realmente usar este dispositivo com a fatia do cérebro. Oi, meu nome é uo.

Estou trabalhando com o Dr. Arrington e o Dr. Fall, do Departamento de Bioengenharia da Universidade de Illinois. E agora vou trabalhar com o micro dispositivo gratuito que trouxe e acabou de comer sobre esta plataforma. De um lado, podemos ver a tubulação de profusão.

Do outro lado, podemos ver a tubulação de sucção. Portanto, o dispositivo será perfundido com uma solução de LCR, que é borbulhada com 95% de oxigênio e 5% de CO2. Agora que o dispositivo micro V está pronto, vou obter a licença do cérebro e depois colocá-la sobre o microdispositivo.

Agora vou colocar a fatia do cérebro, eh, no topo das aberturas circulares, e então vou usar a âncora para imobilizar a fatia do cérebro. Agora que a fatia do cérebro está sendo imobilizada, vou usar neurotransmissores eh para estimulá-la. Aqui temos quatro entradas, então vou colocar neurotransmissor em cada entrada usando o bombeamento passivo dessas quatro entradas até essa saída.

E agora o Dr.Fall vai falar sobre esse dispositivo. O que é tão importante para nós? Olá, sou Chris Fall e fazemos fisiologia cerebral.

E a razão pela qual precisamos usar fatias de cérebro é para acesso com microeletrodos e tecnologia de imagem. E até agora, a única maneira de mudar o ambiente de neurotransmissores para essas fatias cerebrais é mudar o fluxo sobre toda a fatia ou soprar neurotransmissores diretamente usando uma micropipeta muito pequena. Portanto, estamos muito entusiasmados por trabalhar com o Eddington's Group.

Essa nova tecnologia nos permitirá abordar grandes áreas do cérebro e mudar localmente o ambiente dos neurotransmissores. E então, simultaneamente, agora podemos entrar com nossos, com nossos eletrodos e nossa tecnologia de imagem e talvez eventualmente construir dispositivos de gravação de vários eletrodos na mesma unidade. Ok, então aqui você vê uma fatia de entorse de rato de rato no dispositivo microfluídico.

E você pode notar até mesmo a olho nu que o cérebro é composto de muitas regiões diferentes. Essas regiões fazem coisas diferentes. E no animal vivo, essas diferentes regiões do cérebro teriam diferentes tons neuromoduladores e neurotransmissores.

E queremos ser capazes de replicar isso em nossa câmara de fatias enquanto fazemos gravações eletrofisiológicas e de imagem. E por isso é realmente ótimo poder abordar essas diferentes áreas com diferentes neurotransmissores em diferentes concentrações e com diferentes cursos de tempo. E embora não possamos realmente visualizar neurotransmissores, podemos mostrar aqui um exemplo de corante fluorescente que está sendo bombeado para a fatia do cérebro em diferentes regiões.

Aqui você vê um filme em que estamos fluindo corante fluorescente através dos canais do dispositivo e apenas visualizando-o saindo dos poros que foram feitos. E mesmo neste protótipo inicial, você pode ver como a resolução espacial é precisa com o fluxo. Enquanto assistimos ao filme, você verá o corante fluindo para os canais e depois para fora dos orifícios, e então vamos lavar esse corante, dando a você uma ideia de qual é a resolução temporal do fluxo.

Obrigado por se juntar a nós hoje. Acho que fomos capazes de demonstrar como a microfluídica e, de fato, as micromáquinas podem ser casadas com técnicas fisiológicas tradicionais para nos ajudar a entender como o cérebro funciona. Obrigado.