Name: Estimulação cerebral Slice Usando uma Rede microfluídicos e da Câmara de Perfusão padrão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 27 min 58 s
Description: Aprenda a fabricar um dispositivo microfluídico para estimulação de fatias cerebrais em eletrofisiologia. Este método modular elimina tubulações complexas e permite controle espacial e temporal preciso de neurotransmissores.

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O financiamento foi fornecido pelo NIH MH-64611 e Investigator Award NARSAD Young. Os autores gostariam também de agradecer Adam Beagley, Mark Dikopf, e Ben Smith para sua assistência técnica.

SU-8 de fabricação de moldes Preparação mestre <ol><li> O mestre SU-8 em silício substrato wafer é preparado usando um dois-passo processo de litografia padrão negativo resistir. </li><li> As marcas de alinhamento no wafer de silício são removidas utilizando uma lâmina de barbear como a altura destas estruturas (localizado ao longo da periferia do wafer) é mais do que as estruturas dispositivo real. </li><li> O wafer de silício é então limpo usando álcool isopropílico e seca em um fluxo de N 2. Pilares de sustentação feita de fita com espessura menor do que a mais alta estrutura do dispositivo substituir as marcas de alinhamento em quatro lados da bolacha. Nota: Se o apoio de altura pilares é mais do que as estruturas mais altas do dispositivo, os buracos não são formadas através no molde PDMS. </li><li> O wafer de silício mestre é colocado em uma placa quente à temperatura ambiente. </li></ol> PDMS preparação da solução <ol><li> Quatro gramas de polidimetilsiloxano solução (PDMS) é preparado através de uma profunda mistura de 10 partes de elastômero de silicone com 1 parte de agente de cura. Nota: Certifique-se que as duas soluções são misturadas uniformemente para obter propriedades físicas semelhantes em todo o molde PDMS. </li><li> As bolhas geradas na solução PDMS durante o processo de mistura são removidas usando um exsicador de vácuo. </li></ol> PDMS revestimento e cura <ol><li> A bolha sem solução PDMS é lentamente dispensada na mestre SU-8 certificando-se que as bolhas não são gerados durante o processo de distribuição. </li><li> Uma extremidade de um filme de transparência escrever-on é então colocado sobre a chapa quente e, lentamente, colocado na solução PDMS para espalhar uniformemente o PDMS para o mestre-8 SU. As bolhas geradas durante esse processo precisa ser removido através de uma sonda. [Nota: Não levante a transparência para evitar a geração de bolhas mais.] </li><li> Uma laje Borofloat é colocado em cima da folha de transparência para aplicar pressão uniforme. Uma leve pressão é aplicada sobre a superfície superior das mais altas estruturas circulares (localizado a meio caminho dos comprimentos de canal e centrada ao longo da largura dos canais) de tal forma que há pouca ou nenhuma PDMS imprensado entre a transparência ea superfície SU-8 da circular estruturas. </li><li> Três lajes mais Borofloat são colocados em cima do sanduíche de silício wafer Borofloat-laje para aplicar pressão constante sobre a superfície superior das estruturas abertura circular antes e durante o processo de cura. </li><li> A temperatura da placa quente é então aumentada para 75 ° C ea PDMS é curado a esta temperatura por 1 hora. A placa quente é levado a uma temperatura de 50 ° C. </li><li> As lajes são removidos ea transparência é suavemente retirada deixando para trás o mestre ea folha de PDMS fina revestido em cima dela. </li></ol> Construção do dispositivo micro Remoção da folha de PDMS de mestre <ol><li> O limite exterior da câmara de perfusão é esculpido na folha de PDMS utilizando uma lâmina de barbear após o alinhamento dos portos na câmara de perfusão com as portas do SU-8 master. </li><li> A folha de PDMS é então delicadamente removidos do mestre, puxando ao longo do comprimento dos canais para evitar rompimento do PDMS. A folha de PDMS é colocado sobre uma folha de transparência com a superfície da rede microfluídicos para cima. </li><li> As portas de entrada e saída são, então, feito com uma sonda. </li></ol> Colagem de folhas de vidro para PDMS lamela <ol><li> A superfície de colagem da folha de PDMS (a superfície contendo a rede microfluídicos) e uma lamela de vidro são, então, suavemente limpo com uma fita adesiva 3M, colocado sobre uma folha de transparência, e, finalmente, colocado na câmara O plasma 2. </li><li> As superfícies de ligação são tratados com 165 Watts de plasma de 10 s. A superfície tratada plasma da lamela de vidro é imediatamente colado à superfície tratada plasma da folha de PDMS. Nota: Aplique uma leve pressão na superfície do vidro para remover quaisquer bolhas de ar aprisionadas entre as superfícies de ligação. </li><li> Permitir 5 minutos para obter uma boa ligação entre o PDMS e vidro. Após 5 minutos retire cuidadosamente a transparência em que a folha de PDMS foi colocado para o processo de colagem. </li><li> O dispositivo micro é colocado no sistema de plasma de oxigênio para fazer os canais hidrofílicos. O tratamento de plasma é feito em 165 Watts por 1 minuto. </li></ol> Integração do dispositivo micro e câmara de perfusão Preparação da câmara de perfusão <ol><li> Uma câmara de perfusão off-the-shelf foi ordenado, e as portas de entrada e saída foram perfurados de modo que quando o dispositivo micro ea câmara estão ligados, as portas da câmara e do dispositivo estão alinhados. A superfície inferior da câmara de perfusão é revestido com PDMS para obter uma boa vedação entre a câmara eo dispositivo micro. </li><li> A gravação na folha de transparência é colocada sobre uma placa quente à temperatura ambiente. </li><li> Um grama PDMS solução é preparada em um processo semelhante ao descrito anteriormente. A bolha sem solução PDMS é depois, lentamente, dispensada na geração de folha de transparência evitando bolhas. </li><li> A câmara de perfusão é então colocado sobre a solução PDMS. </li><li> Uma laje Borofloat é então colocada em cima da câmara para aplicar pressão uniforme e para obter uma fina camada de PDMS na superfície inferior da câmara. </li><li> A temperatura da placa quente é então aumentada para 75 ° C ea PDMS é curado a esta temperatura por 1 hora. </li></ol> Colagem de dispositivo micro e câmara de perfusão <ol><li> A laje é removido ea transparência é suavemente retirada deixando para trás a câmara de perfusão e revestido folha fina PDMS em sua superfície inferior. PDMS indesejada é removida com uma lâmina de barbear e uma sonda de ponta afiada para PDMS remoção das portas de acesso. </li><li> A superfície de PDMS do dispositivo micro e PDMS na superfície inferior da câmara são, então, suavemente limpo com uma fita da 3M, colocado sobre uma folha de transparência, e, finalmente, colocado na câmara de plasma de oxigênio. </li><li> As superfícies são tratadas com 165 Watts de plasma de 10 s. A superfície de PDMS revestido da câmara é imediatamente colado à superfície do PDMS dispositivo micro. Nota: Aplique uma leve pressão na superfície do vidro para remover quaisquer bolhas de ar aprisionadas entre as superfícies de ligação. </li><li> Imediatamente antes do uso, o dispositivo é colocado no sistema de plasma de oxigênio para fazer os canais hidrofílicos. O tratamento de plasma é feito em 165 Watts por 1 minuto. </li></ol> Expondo fatias do cérebro para microambiente neuroquímicos usando o dispositivo micro <ol><li> Os microcanais hidrofílica do (dispositivo micro) - (câmara de perfusão) combinação são preenchidos com padrão ACSF (Fluid Cerebral Artificial Spinal) solução. </li><li> Dispense pequenas gotas de solução ACSF nos portos de entrada e deixe a solução a ser perverso até para os canais. Remover quaisquer bolhas de esquerda usando uma seringa da porta de saída. Dispense uma grande queda de solução ACSF na porta de saída para permitir passiva bombeamento de fluidos entre a entrada para as portas de saída do dispositivo micro. Nota: Cuidados devem ser tomados para remover todas as bolhas dos canais para permitir o fluxo de fluidos e utilizando o método de bombeamento passivo. </li><li> Corrigir o (dispositivo micro) - (câmara de perfusão) de combinação na plataforma simples e corrigir a plataforma comum na placa do microscópio. </li><li> Conecte a entrada padrão e saída (sucção) tubos para a câmara de perfusão para a perfusão contínua da fatia do cérebro com solução padrão ACSF. A solução é continuamente aspirado ACSF com 95% de O2-5% CO 2. Nota: Ajuste a posição da tubulação de sucção para manter o nível constante de ACSF no banho da câmara de perfusão. </li><li> Uma vez que a câmara de perfusão é preenchido com solução ACSF, coloque uma fatia do cérebro na câmara de perfusão com um conta-gotas. Usando uma sonda, posição a fatia do cérebro acima das aberturas circulares no dispositivo micro. Uma vez que a fatia do cérebro é na posição desejada sobre as aberturas circulares, use uma âncora para imobilizar fatia a fatia do cérebro. </li><li> O dispositivo microfluídicos agora pode ser usada para expor as fatias de cérebro (colocado na câmara de perfusão e em cima da rede microfluídicos) para vários neurotransmissores usando passiva bombeamento de líquidos. </li></ol>

<ol><li>Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+PDMS+microfluidic+chamber+for+controlling+brain+slice+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment.</a> Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).</li>
<li>Walker, G. M., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+passive+pumping+method+for+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A passive pumping method for microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).</li>
</ol>

Os autores estão abertos a colaborações envolvendo a tecnologia demonstrou microfluídicos para diferentes campos da biologia.

Macroescala existentes ou micro câmaras de perfusão cerebral fatia são limitados em termos da resolução espacial que eles fornecem para expor fatias de cérebro com neurotransmissores. A tecnologia de dispositivos microfluídicos demonstrado aqui supera esta limitação utilizando técnicas simples bioMEMS. Prevê-se que a simplicidade na fabricação do dispositivo micro ea facilidade de integração com as configurações existentes eletrofisiologia permitirá a aplicação generalizada da tecnologia de dispositivos demonstrados. Experiências interessan...

<table><tbody><tr><td>RC-26GPL</td><td>Ferramenta</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0236</td><td>Câmara de gravação de baixo perfil e grande banho RC-26GLP</td></tr><tr><td>SHD-26GH/10</td><td>Ferramenta</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0253</td><td>Suporte de aço inoxidável para fatias para RC-26G, espaçamento de rosca de 1,0 mm</td></tr><tr><td>PDMS (polidimetilsiloxano)</td><td>Reagente</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Kit de elastômero de silicone</td></tr><tr><td>Plasma Preen-II 862</td><td>Ferramenta</td><td>Plasmatic Systems, Inc.</td><td></td><td>Sistema de plasma por micro-ondas</td></tr><tr><td>Modelo P-1</td><td>Ferramenta</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0277</td><td>Plataforma lisa série 20, modelo P-1</td></tr><tr><td>SA-NIK</td><td>Ferramenta</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0291</td><td>Adaptador para Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK</td></tr><tr><td>ACSF (fluido cerebroespinhal artificial) oxigenado e aquecido</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td>A composição exata variará conforme a aplicação</td></tr></tbody></table>

estimulação cerebral slice usando uma rede microfluídicos e da câmara de perfusão padrão

Brain Slice Stimulation Using a Microfluidic Network and Standard Perfusion Chamber

Nós demonstramos a fabricação de um dispositivo de dois níveis microfluídicos que pode ser facilmente integrado com instalações existentes eletrofisiologia. O dispositivo de dois níveis de microfluídica é fabricado usando um padrão de duas etapas negativas resistir um processo de litografia. O primeiro nível contém microcanais com admissão e de escape em cada extremidade. O segundo nível contém micro furos circular localizado a meio caminho do comprimento do canal e centrado, juntamente com a largura do canal. Método de bombeamento passivo é usado para bombear fluidos da porta de entrada para a porta de saída 2. O dispositivo micro é integrada com off-the-shelf câmaras de perfusão e permite uma integração perfeita com a configuração de eletrofisiologia. Os fluidos introduzido no fluxo de portas de entrada através dos microcanais para os portos de saída e também fugir através das aberturas circular localizado na parte superior dos microcanais para o banho da perfusão. Assim, a superfície inferior da fatia do cérebro colocado no banho de câmara de perfusão e acima do dispositivo micro podem ser expostos com diferentes neurotransmissores. A espessura microescala do dispositivo micro ea transparência dos materiais [lamela de vidro e PDMS (polidimetilsiloxano)] usado para fazer o dispositivo micro permitir microscopia da fatia do cérebro. O dispositivo micro permite a modulação (espacial e temporal) dos estímulos químicos introduzidos no microambientes fatia do cérebro.

Nós demonstramos a fabricação de um dispositivo simples microfluídicos que podem ser integrados com configurações padrão eletrofisiologia para expor superfícies microescala de uma fatia do cérebro de uma maneira bem controlada para diferentes neurotransmissores.

Estimulação cerebral Slice Usando uma Rede microfluídicos e da Câmara de Perfusão padrão

Demonstramos a fabricação de um dispositivo microfluídico de dois níveis que pode ser facilmente integrado a montagens de eletrofisiologia existentes. O ...

O principal objetivo do projeto que vamos mostrar a vocês hoje é poder controlar espacial e temporalmente a estimulação cerebral. E outro ponto importante é que, com uma simples modificação no já complexo arranjo eletrofisiológico, podemos disseminar este dispositivo microfluídico entre os diversos laboratórios que utilizam atualmente essa estimulação cerebral in vitro. Olá, sou Java Chek Mohammad do laboratório Edington, do Departamento de Bioengenharia da Universidade de Illinois em Chicago.Hoje vou mostrar como aplicamos um dispositivo microfluídico microfabricado simples para estimulação de fatias cerebrais. O dispositivo para fatias cerebrais que vamos demonstrar hoje é muito útil por diversas razões, sendo a principal delas sua modularidade, que permite adaptá-lo facilmente a uma configuração eletrofisiológica existente sem necessidade de modificações adicionais. Além disso, evita o uso de tubos e bombas, o que normalmente complica qualquer dispositivo microfluídico.E como estamos utilizando o método de bombeamento passivo, não precisamos de tubos nem de bombas. E a terceira coisa é que se trata apenas de uma fina lâmina de membrana de PDMS colocada entre uma lamínula e uma c

brain-slice-stimulation-using-microfluidic-network-standard-perfusion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aplicando a microfluídica Eletrofisiologia

Este artigo apresenta uma abordagem que combina a fotostimulação com varredura a laser e gravações em célula inteira em camundongos transgênicos que expressam GFP em populações limitadas de neurônios inibitórios. A técnica permite o mapeamento extensivo e a análise quantitativa de circuitos sinápticos locais de neurônios corticais inibitórios específicos.

Mapeamento Inibitória Circuitos Neuronal por Laser Scanning fotoestimulação

Este vídeo descreve um método para obter imagens e registrar simultaneamente a atividade elétrica de fatias cerebrais transgênicas que contêm proteínas fluorescentes específicas de neurônios. O procedimento envolve a manutenção da fatia do cérebro em uma câmara de perfusão com líquido cefalorraquidiano artificial aerado, usando uma fonte de luz para excitar células marcadas com fluorescência e registrando os sinais elétricos com uma sonda multicanal e um grampo de remendo.

Monitoramento óptico e eletrofisiológico simultâneo de células neuronais em fatias cerebrais

Nós desenvolvemos um modelo de fatia de cérebro que podem ser utilizados para examinar os mecanismos moleculares envolvidos na lesão cerebral mediada por excitotoxicidade. Esta técnica gera tecido cerebral maduro viável e reduz o número de animais necessários para a experimentação, mantendo o circuito neuronal, interações celulares e compartimentos pós-sinápticos em parte intacta.

Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de AVC

Registros de patch-clamp e preenchimento simultâneo de biocitina intracelular de neurônios sinapticamente acoplados em fatias cerebrais agudas permitem uma análise correlacionada de suas propriedades estruturais e funcionais. O objetivo deste protocolo é descrever as etapas técnicas essenciais do registro eletrofisiológico a partir de microcircuitos neuronais e sua posterior análise morfológica.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

Este protocolo descreve a estabilização do nível de oxigênio em um pequeno volume de tampão reciclado e aspectos metodológicos da plasticidade sináptica dependente de atividade de gravação em fatias hippocampal agudas submersas.

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Ilustramos como executar gravação e elétrica de modulação da atividade epileptiforme 4-aminopiridina-induzida em fatias de cérebro de roedor usando matrizes de microeletrodos. Uma câmara de gravação personalizada mantém a viabilidade do tecido durante prolongadas sessões experimentais. Viver o mapeamento de eletrodo e seleção de pares estimulantes são executadas por uma interface de usuário gráfica personalizada.

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Microglia, as residentes células imunes do cérebro, responder rapidamente com alterações morfológicas às modificações do seu ambiente. Este protocolo descreve como usar dois fotões microscopia para estudar a atração dos processos microglial em direção a serotonina ou ATP em fatias aguda do cérebro de ratos.

Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias

Este protocolo descreve a preparação de fatias horizontais do córtex hipocampal-entorhinal (HEC) de camundongos que exibem atividade espontânea de ondulação de ondas afiadas. As fatias são incubadas em uma câmara de realização de interface simplificada e as gravações são realizadas em condições submersas com fluido cerebrospinal artificial de fluxo rápido para promover a oxigenação tecidual e o surgimento espontâneo da atividade em nível de rede.

Corte cerebral aguda do rato para investigar atividade espontânea da rede hipocampal

Aqui, descrevemos um protocolo para o uso de sistemas complementares de matriz de microeletrodos de alta densidade de semicondutores de óxido metálico (CMOS-HD-MEAs) para registrar a atividade semelhante a convulsões de fatias cerebrais ex vivo .

Atividade semelhante a convulsões de alta qualidade de fatias cerebrais agudas usando um sistema complementar de matriz de microeletrodos de alta densidade com semicondutor de óxido metálico

Aprenda a fabricar um dispositivo microfluídico para estimulação de fatias cerebrais em eletrofisiologia. Este método modular elimina tubulações complexas e permite controle espacial e temporal preciso de neurotransmissores.

Estimulação cerebral Slice Usando uma Rede microfluídicos e da Câmara de Perfusão padrão

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