A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

O objetivo geral deste procedimento é criar um dispositivo microfluídico revestido com células endoteliais. Isso é feito fabricando primeiro o molde microfluídico. A segunda etapa é criar o canal PDMS.

Em seguida, as células endoteliais são semeadas no dispositivo. A etapa final é cultivar as células dentro do dispositivo. Em última análise, dispositivos microfluídicos revestidos com células endoteliais são usados para mostrar as interações célula a célula in vitro.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que ela fornece ao pesquisador controles rígidos sobre as condições biológicas e biofísicas e é compatível com a microscopia de fluorescência. Embora esse método possa fornecer informações sobre as interações biofísicas das células celulares em doenças hematológicas, ele também pode ser aplicado a fenômenos como biologia leucocitária, metástase de câncer e biologia de células-tronco hematopoiéticas. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque as condições precisam ser rigidamente controladas para o assentamento bem-sucedido das células.

Em preparação para a fabricação, cria uma máscara fotográfica enviando uma imagem de design assistida por computador do dispositivo Microfluid a um fornecedor externo de máscaras. Uma vez recebida, a máscara é composta por uma camada de cromo em vidro sodo-cálcico. Aqui, a largura do canal microfluídico é de 30 mícrons.

Para iniciar a fabricação do dispositivo microfluídico, limpe um wafer de silicone nu com piranha por 15 minutos e depois enxágue com água deionizada por 10 segundos. Em seguida, mergulhe o wafer de silicone em ácido fluorídrico por 30 segundos e enxágue com água deionizada por aproximadamente 10 segundos. Em seguida, usando um spin coter spin micro chem SU 8 20 25 fotorresistente no wafer a uma altura de 30 mícrons usando uma velocidade de rotação de 3000 rotações por minuto.

Coloque o wafer revestido com SU 8 20 25 em uma placa quente regulada a 95 graus Celsius por cinco minutos para remover o excesso de solvente. Um forno não é recomendado para esta etapa. Agora, coloque a máscara fotográfica sobre o wafer e exponha à luz ultravioleta em um forro de máscara para reticular a fotorresistência SU 8 20 25.

Após a reticulação, coloque o wafer de volta na placa quente a 95 graus Celsius por mais cinco minutos. Para acelerar ainda mais a polimerização da fotorresistência SU 8 20 25. Em seguida, mergulhe o wafer no revelador SU oito, que é composto principalmente de PGA por quatro minutos.

Isso removerá a foto SU 8 20 25 não reticulada. Resistir. Enxágue o wafer recém-desenvolvido com álcool isopropílico 100% por 10 segundos e, em seguida, seque usando nitrogênio pressurizado ou deixando o solvente evaporar do wafer em uma capela limpa por vários minutos. Agora, prenda a bolacha seca no centro da placa de Petri, tomando cuidado para colocar a fita nas bordas da bolacha.

Por fim, pipete 500 microlitros de sigma coat no wafer. Cubra a placa de Petri com a tampa e, em seguida, gire a placa para garantir o revestimento completo do wafer. Remova a tampa e deixe o wafer secar por vários minutos até que todo o solvente tenha evaporado.

Depois de misturar o polímero PDMS e o agente de cura em uma proporção de 10 para um peso por peso, remova as bolhas de ar usando um dessecador a vácuo por vários minutos a uma hora, dependendo da força do sistema de vácuo disponível. Depois que todas as bolhas de ar forem removidas, despeje a mistura no prato de forma que o wafer e a superfície do prato fiquem cobertos. Para criar uma folha de PDMS com aproximadamente cinco milímetros de espessura.

Crie também um pedaço fino e sem características de PDMS com um milímetro de espessura. Em seguida, cure a mistura em um forno a 60 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use uma faca ou bisturi para cortar ao redor do wafer e remover vários dispositivos microfluídicos PDMS.

Em seguida, corte a folha para isolar dispositivos individuais. Corte a folha de PDMS um pouco maior que o dispositivo microfluídico. Agora use um torno de pino, unicórnio Harris ou dispositivo semelhante para criar orifícios de entrada e saída no dispositivo microfluídico.

Em seguida, limpe as superfícies do dispositivo microfluídico e da folha usando fita adesiva. Em seguida, use um limpador de plasma para expor as superfícies do dispositivo microfluídico e da folha PDMS ao plasma de oxigênio por 30 segundos. O plasma de oxigênio cria espécies reativas na superfície exposta do PDMS, que se ligam quando colocadas em contato físico.

Em seguida, encha uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de ponta romba de calibre 20 com 50 microgramas por mililitro. A fibronectina do plasma humano em PBS então encaixa um pedaço de tubo sobre a agulha. Insira um pedaço de tubo mais fino no primeiro pedaço de tubo para criar um ajuste de fricção entre os dois pedaços de tubo.

Em seguida, conecte a outra extremidade do pedaço mais fino do tubo à entrada do dispositivo microfluídico. Aplique pressão na seringa para encher os canais completamente com solução de fibronectina e para criar uma pequena gota de 100 microlitros na porta de observação para garantir que os canais permaneçam úmidos. Agora, incube o dispositivo microfluídico em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius por 40 a 60 minutos.

Após a incubação, conecte uma seringa nova cheia de PBS à agulha de ponta romba. Aplique pressão para lavar o dispositivo microfluídico com PBS. Prepare 500.000 a 2 milhões de células por mililitro de células endoteliais da veia umbilical humana ou tenha em meios de crescimento endotelial com 8% de dextrana.

A adição de dextrana aumenta a probabilidade de as células aderirem e cultivarem com sucesso dentro do dispositivo microfluídico. Encha a seringa limpa equipada com uma agulha de ponta romba e um tubo mais largo com a suspensão da célula e conecte um comprimento maior de tubo de aproximadamente um metro de comprimento. É fundamental garantir que a tubulação esteja bem ajustada para eliminar vazamentos entre quaisquer conexões.

Prepare o tubo com solução celular, garantindo que não haja bolhas presentes na seringa ou em qualquer tubo Para otimizar o desempenho do sistema. É fundamental neste momento evitar que vazamentos ou bolhas entrem no sistema. Qualquer vazamento de solução ou presença de bolhas no meio impedirá o assentamento bem-sucedido das células endoteliais.

Uma vez que todas as bolhas tenham sido eliminadas e todo o comprimento da tubulação esteja preparado com suspensão celular, coloque a seringa na bomba e conecte a outra extremidade à entrada microfluídica. A bomba de seringa é ajustada na mesma altura que o dispositivo microfluídico. O comprimento longo da tubulação é cuidadosamente enrolado dentro da incubadora para garantir que as células e o meio sejam aquecidos adequadamente antes de entrar em contato com o dispositivo.

Em seguida, a suspensão celular é infundida no dispositivo microfluídico a uma taxa de fluxo volumétrico de 1,23 microlitros por minuto por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em nosso sistema. A taxa volumétrica de gripe de 1,23 microlitros por minuto corresponde a uma velocidade média de um milímetro por segundo nos menores canais. Isso se aproxima de uma tensão de cisalhamento da parede de uma moeda de dez centavos por centímetro quadrado nesses canais usando sangue total.

Quando a infusão da suspensão celular estiver completa, use a mesma bomba de seringa e tubo longo com uma seringa maior para infundir meio de crescimento fresco por dois a oito dias a uma taxa de 1,23 microlitros por minuto. Quando a monocamada celular estiver no nível desejado de confluência, injete sangue ou suspensão celular no sistema para experimentação. Aqui, o dispositivo microfluídico é mostrado antes da endotelização.

O dispositivo microfluídico foi infundido com corante alimentar para ilustrar o tamanho, a escala e o design geral do dispositivo que imita a fisiologia da vasculatura. A microscopia de campo claro revela a endotelização de um dispositivo microfluídico. Esta imagem foi adquirida menos de 48 horas após a semeadura usando o protocolo descrito, a técnica de perfusão otimizada permite que as células endoteliais contrifiquem cultura fluentemente em toda a superfície interna do sistema microfluídico.

Dentro de 24 a 48 horas após a semeadura celular. Como mostrado nesta imagem confocal, o tumor microvascular em um chip com microcanais se aproxima do tamanho de 30 mícrons das células pós-capilares, o local da maioria dos eventos obstrutivos microvasculares falciformes. Neste experimento, o sangue total de pacientes saudáveis é infundido em uma microvasculatura em um dispositivo de chip em condições desoxigenadas.

Este filme mostra que o fluxo de sangue total em nosso sistema microfluídico endotelial é regular, suave e contínuo, sem áreas de obstrução de microcanais. Aqui, o sangue total de pacientes com doença falciforme é infundido em uma microvasculatura em um dispositivo de chip. Em condições desoxigenadas, mudanças significativas no fluxo sanguíneo são observadas com oclusões completas presentes em vários canais.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não introduzir bolhas de ar ao trocar a tubulação. O dispositivo acabado é compatível com microscopia de fluorescência e pode ser adaptado aos ensaios de fluorescência tradicionais. Essa técnica abre caminho para hematologistas experimentais conduzirem experimentos usando células únicas em um ambiente biofísico e hemodinâmico controlado.

Sem bolhas.