Name: A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprenda a criar dispositivos microfluídicos revestidos com células endoteliais para estudar interações celulares em doenças hematológicas. Este método oferece controle preciso das condições biológicas e é compatível com microscopia de fluorescência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos T. Hunt, M. Rosenbluth, eo Laboratório de Lam para os seus conselhos e discussões úteis. Agradecemos o apoio de G. Spinner e do Instituto de Eletrônica e Nanotecnologia do Georgia Institute of Technology. O apoio financeiro para este trabalho foi fornecida por uma subvenção NIH K08-HL093360, prêmio UCSF REAC, um Nanomedicina NIH Desenvolvimento Award Centro PN2EY018244 e financiamento do Centro de Biologia Celular endotelial de Saúde Infantil de Atlanta.

1. Fabricação de microdispositivos o endotelial <ol><li> Criar um fotomáscara enviando um desenho assistido por computador (CAD) do dispositivo micro a um fornecedor máscara fora. A máscara utilizada foi composta de uma camada de cromo em refrigerante de vidro de cal. Neste caso, a largura do canal microfluídico foi de 30 uM. </li><li> Limpar uma bolacha de silício nu com piranha (10:1 proporção de ácido sulfúrico e peróxido de hidrogénio) durante 15 minutos e mergulhar em ácido fluorídrico por 30 segundos. Lavar com água desionizada (DI) durante aproximadamente 10 segundos. </li><li> Utilizando um revestidor de rotação, de spin Microchem SU-8 2025 fotorresiste sobre a bolacha de uma altura de 30 mm. Para SU-8 2025, uma velocidade de centrifugação de 3000 rpm é recomendada. Outros viscosidades de SU-8 estão disponíveis, que irá atingir esta altura. As instruções completas para SU-8 uso estão disponíveis em <a href="http://www.microchem.com" target="_blank">www.microchem.com</a> </li><li> Coloque a bolacha com SU-8 sobre uma placa de aquecimento a 95 ° C durante5 minutos para expulsar o excesso de solvente. Nota: Um forno irá secar a bolacha de modo diferente do que uma placa de aquecimento e não é recomendada. </li><li> Colocar uma máscara com a forma característica desejada sobre a bolacha, e expor à luz UV (160 mJ / cm 2 medido a 365 nm) em um alinhador de máscara (Karl Suss, MA-6). Esta cruz liga o fotorresiste. </li><li> Coloque a bolacha de volta numa placa de aquecimento a 95 ° C durante um período adicional de 5 minutos para acelerar ainda mais a polimerização de SU-8. </li><li> Mergulha-se o bolacha em SU-8 Developer, composto principalmente por PGMEA (propileno glicol metil éter acetato) durante 4 minutos para remover o não-reticulado SU-8. </li><li> Lavar a bolacha recentemente desenvolvido com 100% de álcool isopropílico (IPA) durante 10 s. A bolacha pode então ser seca usando azoto pressurizado ou permitindo a evaporação do solvente da bolacha em uma capa limpa fumos durante vários minutos. </li><li> Fita as bordas da bolacha seca com modelado SU-8 em um prato de petri de prédesabafar movimento. </li><li> Aplicar 1 mL de Sigmacote para a bolacha utilizando uma pipeta, a tampa com o topo da placa de petri, e bolacha redemoinho para assegurar um revestimento completo da bolacha, remover cobrir, e permitir que bolacha para secar durante vários minutos até todo o solvente se ter evaporado. </li></ol> 2. PDMS Preparação (polidimetilsiloxano) <ol><li> Mistura PDMS polímero e agente de cura numa proporção 10:1 (w / w) e remover as bolhas de ar, utilizando um exsicador de vácuo. O período de tempo necessário para desgaseificar a PDMS varia com a força do sistema de vácuo disponível, mas tipicamente varia desde alguns minutos a uma hora. Para uma placa de Petri seis polegadas com nenhuma PDMS anteriormente vertida, num volume total de 60 mL de polímero é recomendada. </li><li> Despeje a mistura sobre a bolacha, a cerca de 5 mm de espessura. Deita-se também um prato de fundo plano para criar uma folha fina de PDMS, cerca de 1 mm de espessura. Curar a 60 ° C num forno durante a noite. </li><li> Usando uma faca ou bisturi, cortar ao redor do cured dispositivo PDMS e removê-lo a partir da bolacha. Além disso, cortado de uma folha fina de PDMS ligeiramente maior do que o dispositivo. </li><li> Criar entrada e de saída furos no dispositivo PDMS utilizando um furador de 1,0 mm. Isto pode ser conseguido usando um vice-um pino, o dispositivo de Harris Uni-Core, ou similar. </li><li> Limpar as superfícies do dispositivo ea folha usando fita adesiva. </li><li> Usando um limpador de plasma, expor as superfícies do dispositivo PDMS e folha de PDMS ao plasma de oxigénio durante 30 s. O plasma de oxigénio cria espécies reactivas na superfície exposta do PDMS que se ligam quando postos em contacto físico. </li><li> Ligue menor tubagem com um comprimento pequeno (vários centímetros) de tubo de grande, o que por sua vez está ligado a uma seringa com uma agulha romba de ponto, preenchido com 50 fibronectina ug / ml de plasma humano em PBS. A tubagem e da agulha são dimensionados de tal modo que um encaixe de fricção é criado entre o tubo. Insira menor a tubagem para a entrada do PDMS microdispositivo e umplicar pressão para a seringa para encher completamente os canais com uma solução de fibronectina e para criar uma queda de 100 uL pequena na porta de saída, para assegurar que os canais de ficar molhado. Incubar o dispositivo a 37 ° C durante 40-60 min. </li><li> Conecte uma seringa cheia de PBS fresca para a agulha de ponto cego. Aplicar pressão para a seringa para enxaguar o dispositivo com PBS. </li></ol> 3. Semeando a dispositivos microfluídicos com células endoteliais <ol><li> Preparar 1.000.000 células / ml de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) em meios de crescimento endotelial com dextrano 8%. Uma gama de 500.000 a 2.000.000 células / ml foi utilizado com sucesso. A adição de dextrano ao meio de carga célula aumenta a viscosidade do fluido, o que diminui a velocidade de células endoteliais como eles entram no sistema fibronectina revestido microfluídicos. Isto, por sua vez, aumenta a probabilidade de que as células irá aderir e cultura com sucesso dentro do microdispositivo. </li><li> CONECTE a nova seringa e tubagem como no Passo 2,7. mas com um tempo mais tubagem (aproximadamente 1 metro de comprimento). </li><li> Para optimizar o desempenho do presente sistema, é crítica neste ponto para evitar qualquer fuga ou bolhas em todo o sistema de perfusão; qualquer fuga de solução ou a presença de bolhas nos meios de comunicação irá alterar o fluxo e evitar a semeadura bem sucedida de células endoteliais. Portanto, apertadas do tubo é essencial para eliminar vazamentos entre as conexões. Bolhas na seringa e / ou da tubagem devem ser eliminadas antes células são introduzidas no microdispositivo e todo o sistema de perfusão devem ser preparadas com a solução de células antes de prender o tubo à microfluídico para evitar a introdução de bolhas de ar. </li><li> Utilizando uma bomba de seringa, infundir suspensão de células em PDMS dispositivo a uma taxa de fluxo volumétrica de 1,23 ul / min durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Óptimos resultados foram obtidos quando a bomba de seringa estava no<html> mesma altura que o dispositivo de PDMS. Para a entrada, o mais tubos, que pode ser enrolada dentro da incubadora, assegura que as células e meios de comunicação estão adequadamente aquecido antes de entrar em contacto com o dispositivo. No nosso sistema, a taxa de fluxo volumétrica de 1,23 ul / min aproxima uma velocidade midstream de ~ 1 mm / s nos menores microcanais, correspondendo a uma tensão de cisalhamento de parede de ~ 1 dine / cm 2 a esses canais utilizando sangue total. </li><li> Usando a bomba de seringa mesmo e tubagem de comprimento, perfundir meios de crescimento fresco para 2-8 dias à razão de 1,23 ul / min. Um dispositivo de sucesso terá uma monocamada de células endoteliais que crescem no interior do dispositivo dentro de 24-48 horas. As experiências anteriores demonstram que monocamadas confluentes apropriadamente expressar VE caderina-a célula-célula junções em todo o dispositivo 14. </li><li> Injectar sangue ou suspensão de células no sistema para a experimentação. </li></ol> 4. Os resultados representativos _content &quot;&gt; Usando este protocolo, técnicas padrão de microfabricação litográficas são usados ​​para criar o molde necessária para produzir os canais microfluídicos que imitam a fisiologicamente sizescale da microvasculatura (Figura 1A). Usando uma técnica de perfusão optimizado, as células endoteliais, em seguida, a cultura de sementes e confluently o superfície interna inteira do sistema microfluídico dentro de 24-48 horas de semeadura de células (Figura 1B). Como o sistema microfluídico é transparente, o microdispositivo inteiro pode ser colocado sobre um campo claro / etapa microscópio de fluorescência para imagiologia e recolha de dados. O nosso sistema pode então ser aplicado para estudar doenças hematológicas que envolvem alteradas as propriedades biofísicas, tais como a doença de células falciformes, em que o aumento da rigidez falciformes células vermelhas e adesão de leucócitos e endotelial aberrante contribuir para a obstrução microvascular. Um medicamento aprovado clinicamente, hidroxiuréia, melhora sintomas, mas a sua direct efeito sobre o fluxo microvascular é desconhecida. Nosso ensaio leva em conta tanto a rigidez e adesão celular, e demonstra que hidroxiureia significativamente melhora o fluxo na doença de células falciformes (Figura 2). A doença falciforme é apenas um exemplo de uma aplicação para a microvasculatura-on-a-chip, como este sistema é ideal para estudar qualquer processo hematológica em que as células do sangue interagem uns com os outros e as células endoteliais da microvasculatura. Outras aplicações clinicamente relevantes incluem distúrbios inflamatórios, sepse / lesão pulmonar, microangiopatias trombóticas, malária e metástase de câncer, enquanto aplicações mais básicas incluem a biologia de leucócitos e da biologia de células estaminais hematopoiéticas, entre muitos outros. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig1.jpg" alt="A Figura 1"/> Figura 1. A) o PDMS inicial dispositivo micro antes endotelização. Aqui, o microdispositivo é injetado a sagacidadeh corante alimentar para ilustrar desenho sizescale e global do sistema. B) microscopia de campo claro mostra o sistema de microfluídico é completamente endothelialized dentro de 48 horas de semeadura célula utilizando o protocolo aqui descrito. <img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig2.jpg" alt="A Figura 2"/> Figura 2. A) A microvasculatura-em-um-chip com microcanais aproxima do tamanho de vénulas pós-capilares (30 mm), o local da maioria das células falciformes eventos obstrutivos microvasculares. Sangue total de pacientes com anemia falciforme que receberam hidroxiuréia e de pacientes que não receberam hidroxiuréia flui através de dois diferentes microvasculatura-on-a-chip dispositivos. B) O sangue total de pacientes com anemia falciforme que recebem fluxos de hidroxiureia com relativa facilidade dentro dos microcanais endothelialized. C) Sob as mesmas condições hemodinâmicas, o sangue total a partir de pacientes com anemia falciforme que não recebem hidroxiureia, no entanto, apresenta fluxo muito mais lento com microchobstrução Annel. O canal de fundo é completamente obstruído com ausência de fluxo e as velocidades do fluxo no microcanais outros endothelialized são significativamente mais baixos do que na condição de hidroxiureia. A barra de escala em todas as três imagens é 30 mm.

<ol><li>Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Level+of+Laboratory+Testing+Required+for+Diagnosis+or+Exclusion+of+a+Platelet+Function+Disorder+Using+Platelet+Aggregation+and+Secretion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays.</a> Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).</li>
<li>Young, E. W. K., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+microfluidic+cell+culture+in+controlled+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments.</a> Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).</li>
<li>Young, E. W. K., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macro-+microscale+fluid+flow+systems+for+endothelial+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology.</a> Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).</li>
<li>Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+cell+vasoocclusion+and+rescue+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).</li>
<li>Rosano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li>
<li>Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Technology+in+Vascular+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Technology in Vascular Research.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).</li>
<li>Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+nature+of+extracellular+ATP+as+a+concentration-dependent+platelet+P2X1+agonist+and+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist.</a> Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).</li>
<li>Kotz, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+microfluidics+for+neutrophil+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics.</a> Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).</li>
<li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+cell+mechanics+in+hematologic+diseases+with+microfluidic+biophysical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry.</a> Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).</li>
<li>Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+model+for+single-cell+capillary+obstruction+by+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).</li>
<li>Borenstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+endothelialized+microvascular+networks+with+circular+cross-sections+in+a+tissue+culture+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate.</a> Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).</li>
<li>Nesbitt, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat. Med. 15, 665-673 (2009).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).</li>
<li>Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolytic+uraemic+syndrome%3A+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Laboratory+Haematology%22%5BJournal%5D)">Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors.</a> Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O nosso sistema microdispositivo endothelialized é mais adequada quando usado em conjunção com as experiências in vivo, ea sua abordagem reducionista pode ajudar a elucidar os mecanismos biofísicos de processos hematológicas que são observadas em humanos e em modelos animais. Além disso, nosso sistema não é sem limitações. Por exemplo, os nossos canais microfluídicos são quadrados em corte transversal. Embora tecnicamente microcanais circulares podem ser fabricados 10,11, optou-se por recorr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> agulha ponto sem corte </td><td> OK Internacional </td><td> 920050-TE </td><td> Precision TE agulha calibre 20 x 1/2 &quot;, cor de rosa </td></tr><tr><td> dextrano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 31392 </td><td></td></tr><tr><td> A fibronectina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0895 </td><td></td></tr><tr><td> Furador (morsa pinos) </td><td> Inovações técnicas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> As células endoteliais do cordão umbilical humana (HUVECs) </td><td> Lonza </td><td> CC-2519 </td><td></td></tr><tr><td> Limpador de Plasma </td><td> Plasma </td><td> PDC-326 </td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9285739 </td><td> Sylgard 184 KIT Elastômero de Silicone </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8 2025 </td><td> Microchem </td><td> Y111069 </td><td></td></tr><tr><td> SU-8 Desenvolvedor </td><td> Microchem </td><td> Y020100 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba de seringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-3008 </td><td> PHD-ULTRA </td></tr><tr><td> tubagem (maior) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 06418-02 </td><td> Tygonreg tubulação microboro, 0,020 &quot;x 0,060 ID&quot; OD </td></tr><tr><td> tubagem (menor) </td><td> Cole-Parmer Instrument Company </td><td> 06417-11 </td><td> PTFE tubulação microboro, 0,012 &quot;x 0,030 ID&quot; OD </td></tr></tbody></table>

a microfluídica endothelialized para estudo das interacções microvasculares em doenças hematológicas

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Os avanços nas técnicas de microfabricação permitiram a produção de baixo custo e reprodutível sistemas microfluídicos para a realização de experiências biológicas e bioquímicas no 1,2 micro e nanoescala. Além disso, microfluídica também têm sido usados ​​especificamente para analisar quantitativamente processos hematológicas e microvascular, devido à sua capacidade para controlar facilmente o ambiente dinâmico fluídica e condições biológicas 3-6. Como tal, os investigadores têm utilizado sistemas mais recentemente microfluídicos para estudar deformabilidade de células do sangue, a agregação de células sanguíneas, o fluxo sanguíneo microvascular, e sangue interacções célula-célula endotelial 6-13. No entanto, estes sistemas microfluídicos quer não incluem células endoteliais cultivadas ou eram maiores do que a correspondente sizescale para microvasculares processos patológicos. Uma plataforma microfluídica com cultura de células endoteliais que recapitula com precisão o celular, físico e hemodynambiente âmico da microcirculação é necessário para promover nossa compreensão da fisiopatologia subjacente biofísico de doenças hematológicas que envolvem a microvasculatura. Aqui, apresentamos um método para criar uma &quot;endothelialized&quot; modelo in vitro da microvasculatura, usando um processo simples de microfabricação única máscara em conjunto com as técnicas de cultura de células endoteliais, estudar as interações patológicas microvasculares biofísicos que ocorrem na doença hematológica. Este &quot;microvasculatura-on-a-chip&quot;, prevê o pesquisador, com um teor robusto que controla rigidamente biológica, bem como condições biofísicas e é operado através de uma bomba de seringa padrão e de campo claro / microscopia de fluorescência. Parâmetros como condições hemodinâmicas da microcirculação, tipo de célula endotelial, o tipo de células sanguíneas (s) e concentração (s), drogas / concentração inibitória etc, tudo pode ser facilmente controlada. Como tal, a nossa microsistema forneceum método para investigar quantitativamente processos de doença no qual o fluxo microvascular é prejudicada devido a alterações na adesão celular, agregação e deformação, uma capacidade disponível com os ensaios existentes.

Um método para a cultura de uma monocamada de células endoteliais em toda a superfície interior 3D inteiro de um dispositivo micro com microvascular de tamanho canais (= 30 mm) é descrito. Este<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo microvasculatura permite o estudo das interacções entre as células biofísicas do sangue, células endoteliais, e factores solúveis em doenças hematológicas.

A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

Avanços nas técnicas de microfabricação permitiram a produção de sistemas microfluídicos reprodutíveis e de baixo custo para a realização de estudos biológicos e...

O objetivo geral deste procedimento é criar um dispositivo microfluídico revestido com células endoteliais. Isso é realizado primeiramente fabricando o molde microfluídico. O segundo passo é criar o canal de PDMS.Em seguida, as células endoteliais são semeadas no dispositivo. O passo final é cultivar as células dentro do dispositivo. Em última análise, dispositivos microfluídicos revestidos com células endoteliais são utilizados para demonstrar interações célula a célula in vitro.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela oferece ao pesquisador um controle rigoroso sobre as condições biológicas e biofísicas e é compatível com microscopia de fluorescência. Embora este método possa fornecer informações sobre as interações biofísicas entre células em doenças hematológicas, ele também pode ser aplicado a fenômenos como a biologia de leucócitos, metástase do câncer e biologia de células-tronco hematopoiéticas. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentarão dificuldades, pois as condições precisam ser rigorosamente controladas para um sucesso no assentamento celular.Em preparação para a fabricação, cria-se uma máscara fotográfica enviando uma imagem de design assistido por computador do dispositivo microfluídico a um fornecedor externo de máscaras. Após recebida, a máscara é composta por uma camada de cromo sobre vidro de soda-cálcica. Aqui, a largura do canal microfluídico é de 30 mícrons.Para iniciar a fabricação do dispositivo microfluídico, limpe uma placa de silício com solução piranha por 15 minutos, depois enxágue com água desionizada por 10 segundos. Em seguida, imerja a placa de silício em ácido fluorídrico por 30 segundos e enxágue com água desionizada por aproximadamente 10 segundos. A seguir, utilizando um spin coater, aplique o fotoresiste SU 8 20 25 micro chem sobre a placa até uma altura de 30 micrômetros, usando uma velocidade de rotação de 3000 rotações por minuto.Coloque a pastilha revestida com SU 8 20 25 sobre uma placa aquecida ajustada a 95 graus Celsius por cinco minutos para eliminar o solvente em excesso. Não é recomendado o uso de forno nesta etapa. Agora, posicione a máscara fotográfica sobre a pastilha e exponha à luz UV em um alinhador de máscaras para promover a reticulação do fotoresiste SU 8 20 25.Após a reticulação, coloque a pastilha novamente sobre a placa aquecedora a 95 graus Celsius por mais cinco minutos, para acelerar ainda mais a polimerização do fotoresiste SU 8 20 25. Em seguida, imerja a pastilha no revelador SU eight, composto principalmente de P-G-M-E-A, por quatro minutos.Isso removerá o fotoresiste SU 8 20 25 não reticulado. Enxágue a pastilha recém-desenvolvida com álcool isopropílico a 100% por 10 segundos, em seguida seque utilizando nitrogênio pressurizado ou permitindo que o solvente evapore da pastilha em uma capela limpa por vários minutos. Agora, fixe a pastilha seca no centro da placa de Petri, tomando cuidado para colocar a fita nas bordas da pastilha.Finalmente, pipete 500 microlitros do revestimento sigma sobre a pastilha. Cubra a placa de Petri com a tampa e, em seguida, agite suavemente o recipiente para garantir a cobertura completa da pastilha. Remova a tampa e deixe a pastilha secar por vários minutos até que todo o solvente tenha evaporado.Após misturar o polímero PDMS e o agente de cura na proporção de 10 para 1 em peso por peso, remova as bolhas de ar utilizando um dessecador a vácuo por vários minutos a uma hora, dependendo da intensidade do sistema de vácuo disponível. Após a remoção de todas as bolhas de ar, despeje a mistura na placa de modo que a pastilha e a superfície da placa fiquem cobertas. Para obter uma lâmina de PDMS com aproximadamente cinco milímetros de espessura.Também crie um pedaço fino e sem características de PDMS com um milímetro de espessura. Em seguida, cure a mistura em um forno a 60 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use uma faca ou bisturi para cortar ao redor da pastilha e remover múltiplos dispositivos microfluídicos de PDMS.Em seguida, corte a folha para isolar os dispositivos individuais. Corte a folha de PDMS ligeiramente maior do que o dispositivo microfluídico. Agora, use uma broca manual Harris Unicorn ou dispositivo semelhante para criar orifícios de entrada e saída no dispositivo microfluídico.Em seguida, limpe as superfícies do dispositivo microfluídico e da lâmina utilizando fita adesiva. Depois, utilize um limpador de plasma para expor as superfícies do dispositivo microfluídico e da lâmina de PDMS ao plasma de oxigênio por 30 segundos. O plasma de oxigênio cria espécies reativas na superfície exposta do PDMS, que se ligam quando colocadas em contato físico.Em seguida, encha uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha romba de calibre 20 com 50 microgramas por mililitro. Fibronectina de plasma humano em PBS e, então, acople um trecho de tubo à agulha. Insira um pedaço de tubo mais fino dentro do primeiro trecho de tubo para criar um encaixe por fricção entre os dois tubos.Em seguida, conecte a outra extremidade do trecho mais fino da tubulação à entrada do dispositivo microfluídico. Aplique pressão à seringa para preencher completamente os canais com a solução de fibronectina e para formar uma pequena gota de 100 microlitros na saída, garantindo que os canais permaneçam úmidos. Agora, incube o dispositivo microfluídico em uma estufa umidificada a 37 graus Celsius por 40 a 60 minutos.Após a incubação, conecte uma seringa nova cheia com PBS à agulha de ponta romba. Aplique pressão para lavar o dispositivo microfluídico com PBS. Prepare de 500.000 a 2 milhões de células por mililitro de células endoteliais da veia umbilical humana, ou hve, em meio de crescimento endotelial com 8% de dextrana.A adição de dextrana aumenta a probabilidade de as células aderirem e cultivarem com sucesso dentro do dispositivo microfluídico. Encha uma seringa limpa com agulha de ponta romba e tubo mais largo com a suspensão celular e conecte um trecho mais longo de tubo com aproximadamente um metro de comprimento. É fundamental garantir que o tubo se encaixe firmemente para eliminar vazamentos entre quaisquer conexões.Priminga a tubulação com a solução celular, assegurando que não haja bolhas presentes nem na seringa nem em qualquer parte da tubulação para otimizar o desempenho do sistema. Neste ponto, é fundamental impedir que vazamentos ou bolhas entrem no sistema. Qualquer vazamento da solução ou presença de bolhas no meio impedirá a correta adesão das células endoteliais.Uma vez eliminadas todas as bolhas e após toda a extensão do tubo estar preenchida com a suspensão celular, coloque a seringa na bomba e conecte a outra extremidade à entrada microfluídica. A bomba de seringa é posicionada na mesma altura do dispositivo microfluídico. O tubo longo é cuidadosamente enrolado dentro do incubador para garantir que as células e o meio sejam adequadamente aquecidos antes de entrarem em contato com o dispositivo.Em seguida, a suspensão celular é infundida no dispositivo microfluídico a uma taxa de fluxo volumétrico de 1,23 microlitros por minuto durante duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em nosso sistema. A taxa de fluxo volumétrico de 1,23 microlitros por minuto corresponde a uma velocidade no eixo central de um milímetro por segundo nos canais menores. Isso aproxima uma tensão de cisalhamento na parede de um dina por centímetro quadrado nesses canais utilizando sangue total.Após a conclusão da infusão da suspensão celular, utilize a mesma bomba de seringa e o mesmo tubo longo com uma seringa maior para infundir meio de crescimento fresco por dois a oito dias, a uma taxa de 1,23 microlitros por minuto. Quando a monocamada celular atingir o nível desejado de confluência, injete sangue ou suspensão celular no sistema para experimentação. Aqui, o dispositivo microfluídico é mostrado antes da endotelialização.O dispositivo microfluídico foi infundido com corante alimentício para ilustrar o tamanho, escala e design geral do dispositivo que imita a fisiologia da vasculatura. A microscopia de campo claro revela a endotelialização de um dispositivo microfluídico. Esta imagem foi obtida em menos de 48 horas após o semeadura utilizando o protocolo descrito; a técnica de perfusão otimizada permite que as células endoteliais cultiveem de forma confluente toda a superfície interna do sistema microfluídico.Entre 24 e 48 horas após o semeadura celular. Conforme mostrado nesta imagem confocal, o tumor microvascular em um chip com microcanais aproxima-se do tamanho de 30 mícrons dos vênulas pós-capilares, local onde ocorrem a maioria dos eventos obstrutivos microvasculares na anemia falciforme. Neste experimento, sangue total de pacientes saudáveis é infundido em uma microvasculatura em um dispositivo em chip sob condições desoxigenadas.Este vídeo mostra que o fluxo de sangue total em nosso sistema microfluídico endotelial é regular, suave e contínuo, sem áreas de obstrução nos microcanais. Aqui, sangue total de pacientes com anemia falciforme é infundido em uma microvasculatura em um dispositivo em chip. Em condições desoxigenadas, observam-se alterações significativas no fluxo sanguíneo, com obstruções completas presentes em vários canais.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de não introduzir bolhas de ar ao trocar os tubos. O dispositivo final é compatível com microscopia de fluorescência e pode ser adaptado a ensaios tradicionais de fluorescência. Esta técnica abre caminho para que hematologistas experimentais realizem experimentos utilizando células individuais em um ambiente biomecânico e hemodinâmico controlado.Sem bolhas.

endothelialized-microfluidics-for-studying-microvascular-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Aqui, descrevemos uma metodologia para entregar cabo de sangue humano derivado do endotélio formadoras de colônias de células (ECFCs) e derivadas da medula óssea de células-tronco mesenquimais (CTMs), incorporado em um gel de colágeno / fibronectina, por via subcutânea em ratos imunodeficientes. Esta combinação de células / gel gera uma rede vascular humano que se conecta com a vasculatura mouse.

Bioengenharia Humanos Networks microvascular em camundongos imunodeficientes

Câmaras de fluxo microfluídicos gravados por fotolitografia e fabricada a partir de PDMS são aplicados para sondar os resultados funcionais associados com disfunção CE e inflamação. Numa experiência representativa, a capacidade de tensão de cisalhamento diferencial para modular a adesão celular monocítica a citocina activado CE monocamadas é demonstrada.

On-Chip fenotipagem endotelial Inflamatória

Uma plataforma de microcanais-on-a-chip foi desenvolvido pela combinação da técnica fotolitográfica refluído fotossensível, litografia macia, e microfluidos. A plataforma de microcanais reendotelizados imita a geometria tridimensional (3D) de microvasos in vivo, é executado sob fluxo de perfusão contínua controlada, permite a imagem de alta qualidade e em tempo real, e pode ser aplicado para a pesquisa microvascular.

Procedimento para o Desenvolvimento da Multi-profundidade Circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip

A transfusão de plaquetas e hemostasia foi modelada usando reconstituição sanguínea e câmaras de fluxo microfluídico para investigar a função dos bancos de plaquetas de sangue. Os dados demonstram as consequências da lesão de armazenamento plaquetário na hemostasia, in vitro.

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

As células endoteliais primárias da veia umbilical humana (HUVECs) foram cultivadas até a confluência dentro de um dispositivo de rede microfluídica. A junção celular endotelial e as distribuições de F-actina foram ilustradas e as mudanças na concentração de cálcio intracelular e na produção de óxido nítrico em resposta ao trifosfato de adenosina (ATP) foram quantificadas em tempo real em níveis celulares individuais.

Desenvolvimento e Caracterização de<em&gt; In Vitro</em&gt; Rede de microvasos e medições quantitativas de endotelial [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E óxido nítrico Produção

Este manuscrito apresenta um método de moldagem por injeção para engenheiro microvasos que recapitulam propriedades fisiológicas de endotélio. O processo baseado em microfluídico cria redes vasculares 3D patente com condições tailorable, tais como fluxo, composição celular, geometria e gradientes bioquímicos. O processo de fabricação e exemplos de aplicações potenciais são descritos.

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

Apresentamos um modelo de doença vascular in vitro para investigar interações sanguíneas inteiras com o endotélio derivado do paciente. Este sistema permite o estudo de propriedades trombogênicas das células endoteliais primárias em várias circunstâncias. O método é especialmente adequado para avaliar em trombogenicidade situ e terapia anticoagulação durante diferentes fases de coagulação.

Modelo de doença microfluida in vitro para estudar interações endoteliais de sangue inteiro e dinâmica do coágulo sanguíneo em tempo real

Aqui, fornecemos um chip microfluido e um sistema microfluido de circulação de circulação automaticamente controlado e altamente eficiente que recapitula o microambiente inicial da neovascularização, permitindo que as células endoteliais (CE) sejam estimuladas pelo alto estresse da cisalhamento luminal, nível fisiológico de fluxo transendelial e distribuição de vários fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente.

Modelo microfluido para imitar evento inicial de neovascularização

Neste protocolo, um ensaio biomimético de microfluido, que pode reproduzir um ambiente microvascular fisiologicamente relevante e reproduzir toda a cascata de adesão/migração leucócito, é empregado para estudar interações células leucócitos-endoteliais em doenças inflamatórias.

Um sistema microfisiológico para estudar a interação das células leucócitos-endoteliais durante a inflamação

A função plaquetária sob fluxo pode ser avaliada e a ressuscitação hemostática simulada pode ser modelada usando um dispositivo microfluídico, que tem aplicações em trauma e medicina transfusional.

Microfluídica na avaliação da função plaquetária

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar e operar um sistema microfluídico que expõe células endoteliais à hiperglicemia oscilatória sincronizada e ao estresse de cisalhamento pulsátil. Essa abordagem fornece um modelo in vitro fisiologicamente relevante para estudar a disfunção endotelial diabética. Esse protocolo permite a medição quantitativa do estresse oxidativo e das respostas das células endoteliais.

Um Sistema Microfluídico para Modelagem de Disfunção Endotelial sob Estresse Fisiológico Combinado de Cisalhamento Pulsátil e Hiperglicemia Oscilatória

Aprenda a criar dispositivos microfluídicos revestidos com células endoteliais para estudar interações celulares em doenças hematológicas. Este método oferece controle preciso das condições biológicas e é compatível com microscopia de fluorescência.

A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

Explorar mais vídeos