Uma Abordagem Prática para mapeamento genético induzível Fate: Um Guia Visual para Mark e Track Células In Vivo

Os mapas de destino são gerados marcando e rastreando células in vivo para determinar como os progenitores contribuem para estruturas e tipos de células específicos em tecidos em desenvolvimento e adultos. E o avanço nesse conceito é o mapeamento genético do destino induzível ou GIFM ligando a expressão gênica sulfato e o comportamento celular in vivo para criar mapas de destino com base na linhagem genética. Olá, meu nome é Deborah Ellisor, do Mark Services Laboratory e do departamento de Biologia Molecular, biologia celular e bioquímica da Brown University.

Hoje, meus colegas Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown e eu demonstraremos um procedimento para mapeamento genético do destino induzível. Usamos esse procedimento no laboratório para estudar o desenvolvimento inicial do cérebro. Também podemos aplicar essa técnica a estudos de inativação de genes e modelos animais de doenças humanas.

Então, vamos começar em embriões X cre, E-R-M-G-F-P. MGFP LAE é um alelo repórter presente em todas as células representadas por ovais cinzas X cre, er, onde X representa elementos reguladores de genes. O controle da expressão de C ER é espacialmente restrito ao domínio de expressão do gene X mostrado em azul e a proteína CRE ER é sequestrada no citoplasma por HSP 90.

Na ausência de tamoxifeno, o repórter estará desligado. A administração de tamoxifeno resulta em células mapeadas no destino no domínio X porque o CER é liberado do HSP 90, translocado para o núcleo e remove o de parada do alelo repórter. A combinação do alelo repórter CER e tamoxifeno resulta na marcação quando uma população de células é inicialmente marcada em uma região primordial do cérebro do embrião com base na expressão gênica, essas células mapeadas por destino são rastreadas mesmo após a expressão gênica inicial usada para conduzir o CER ser extinta.

Desta forma. A distribuição final e o destino terminal de uma linhagem celular geneticamente definida podem ser identificados no adulto. Este procedimento começa com a preparação de uma solução de talo de 20 miligramas por mililitro de tamoxifeno, dissolver 200 miligramas de tamoxifeno em 10 mililitros de óleo de milho pré-guerra em um frasco de inalação de vidro.

Em seguida, incubar a solução a 37 graus Celsius por duas horas em um vórtice de Tator. A solução protege intermitentemente a solução estoque de tamoxifeno preparada da luz, envolvendo o frasco com papel alumínio e armazenando a quatro graus Celsius. O estoque pode ser usado por até um mês.

Para experimentos de mapeamento de destino, estabeleça um casal reprodutor consistindo de uma fêmea Swiss Webster do tipo selvagem e um macho carregando um alelo CreER específico do gene e um alelo repórter. Para o propósito desta demonstração, usaremos uma vitória para um homem CreER MG FP. Verifique a fêmea Swiss Webster todas as manhãs quanto ao aparecimento de um tampão vaginal.

Designe a manhã do dia do tampão vaginal como 0,5 dias após o cotus e calcule a data da administração do tamoxifeno. Com base neste ponto de partida neste experimento, o Tamoxifeno será administrado no dia embrionário 8.5. Usando uma seringa de um mililitro com uma agulha de alimentação animal, retire 200 microlitros da solução de talo de tamoxifeno.

Contenha firmemente a fêmea grávida do Webster suíço cronometrada, segurando a soneca do pescoço e das costas para imobilizar a cabeça e virar o mouse para que o lado ventral fique voltado para cima. Segure a cauda entre os dedos livres para manter o corpo em linha reta. Em seguida, coloque a agulha de alimentação no canto da boca e guie suavemente a agulha paralelamente ao céu da boca até que a ponta da agulha de alimentação esteja aproximadamente na posição do olho.

Incline suavemente a cabeça para trás para obter acesso ao esôfago. Guie a agulha pela epiglote e desça pelo esôfago em direção ao estômago. Tenha cuidado para não entrar na traqueia.

Assim que a agulha de alimentação estiver no estômago, administre o tamoxifeno e remova a agulha. Em seguida, devolva a fêmea à gaiola de sua casa até a data da dissecação. Na data da dissecação, os embriões E 12,5 da fêmea grávida cronometrada são dissecados livres e depois avaliados quanto à marcação de GFP.

Em um embrião GFP positivo, observamos que os neurônios derivados do vento contribuem para o mesencéfalo, o cérebro posterior e a medula espinhal. O repórter do MG FP rotula as projeções axonais, que também podem ser vistas transferindo embriões positivos para GFP por montagem doméstica em uma placa de Petri contendo PPS e fotografando-os usando porta-retratos Depois que os embriões forem fotografados, use uma pinça para arrancar um pequeno pedaço de cauda de cada embrião e coloque cada pedaço em um tubo de PCR. Os tecidos serão genotipados usando PCR para ambos os alelos para confirmar os resultados vistos por meio da análise de montagem total.

Os procedimentos a seguir nos permitem analisar como as células marcadas derivadas de regiões embrionárias povoam o cérebro adulto antes de iniciar a craniotomia. Confirmado por uma pitada de dedo do pé que o mouse está totalmente innu. Os ized com nembutal realizam incisões para obter acesso ao coração através da caixa torácica.

Em seguida, coloque uma agulha borboleta no ápice ou ventrículo esquerdo do coração e prenda com o grampo C. Crie um local de saída de fluido no átrio direito com uma tesoura e, em seguida, perfunda com 10 a 15 mililitros de solução salina gelada até que o fluido saia limpo. Seguido por 20 a 25 mililitros de aldeído paraforme a 4%.

Quando a profusão intracardíaca estiver completa, remova a cabeça com uma tesoura cortando a coluna vertebral logo acima dos ombros. Passe um bisturi ao longo da linha média dorsal da cabeça, rostral de cottle para cortar o couro cabeludo e expor o crânio S. Usando o bisturi, raspe qualquer excesso de tecido ou músculo ao longo do lado e posterior do crânio.

Com uma pinça, perfure o crânio na linha média, apenas rostral aos bulbos olfatórios e crie um pequeno orifício para acomodar as pontas de uma tesoura fina. Insira a tesoura fina neste orifício e faça duas incisões bilaterais a partir da linha média seguindo o comprimento dos bulbos olfatórios. Este corte quebrará o crânio na interseção do osso nasal e do osso frontal e fornecerá um bom acesso para a tesoura.

Corte ao longo das suturas sagitais no crânio, certificando-se de manter as pontas da tesoura inclinadas para longe do cérebro para evitar danificar o tecido subjacente. Em seguida, segure suavemente o crânio com uma pinça e retire o osso ao longo da incisão medial para expor o cérebro. O crânio pode lascar em pequenos pedaços ou quebrar em seções maiores.

Continue usando a pinça para remover todos os ossos parietais frontais, interparietais e occipitais. Liberte os olhos localizados ao longo das bordas laterais do cérebro ao nível do cerebelo, beliscando suavemente os ossos esféricos de cada lado. Use uma tesoura para cortar cuidadosamente a parte dorsal do osso que envolve o tronco cerebral.

Insira um lado da tesoura logo abaixo da borda dorsal do osso, começando de onde a medula espinhal foi cortada e cortando em direção ao cerebelo. Para libertar o tronco cerebral e o cerebelo. Remova o osso restante ao redor do tronco encefálico com a pinça.

Afaste suavemente os ossos, vire a cabeça com o lado dorsal para baixo e use a pinça para cortar os nervos cranianos e liberar o cérebro do crânio. Coloque o cérebro em uma placa de Petri com gelo. PPS frio Avalie o cérebro adulto quanto à marcação GFP, usando um escopo de dissecação fluorescente e fotografe usando porta-retratos.

Neste exemplo, o mesencéfalo é marcado por GFP, além de seu uso para análise de linhagem durante a embriogênese e no GIFM adulto pode ser combinado com outras aplicações comumente usadas em biologia do desenvolvimento, como micro dissecação e experimentos de explante de tecidos. Por exemplo, o mesencéfalo ventral é a zona progenitora para o desenvolvimento de neurônios dopaminérgicos que expressam o gene vento. Assim, isolar o mesencéfalo ventral por microdissecção permite que um ambiente in vitro seja estabelecido para investigar melhor seu desenvolvimento.

Isso representa apenas um exemplo de uso do GIFM para isolar uma zona de interesse progenitora definida pela história genética. Para iniciar este procedimento, transfira os embriões positivos para GFP previamente identificados para PBS estéril gelado em uma placa de cultura de células usando uma tesoura fina. Remova a parte da cabeça de um embrião cortando transversalmente mimado em rommy.

Em seguida, remova a porção rostral da cabeça com um corte coronal através do céfalo. Isso exporá uma estrutura semelhante a um tubo na qual o quarto ventrículo através da vesícula mesocefálica forma um conduto entre os tecidos dorsal e ventral. Insira cuidadosamente as pontas da tesoura no quarto ventrículo e corte ao longo da linha média dorsal mimada para rostral abrindo totalmente o tubo, criando uma preparação de livro aberto.

O mesencéfalo ventral agora será exposto medialmente. Embora as duas metades dorsais do mesencéfalo residam lateralmente, pode ser necessário remover qualquer tecido não neural remanescente sob o mesencéfalo ventral. Para que o explane fique plano, o explane deve agora se assemelhar a uma borboleta em que o mesencéfalo dorsal representa as asas e o trombo apenas uma a cauda.

Para isolar ainda mais o mesencéfalo ventral para análise por fax ou experimentos de cultura de células, remova os aspectos laterais do tecido. Agora vamos mostrar alguns resultados representativos do GIFM. Neste experimento, as células que expressam WINT one marcadas com E 8.5 são visualizadas para determinar como as células diretas do WINT One contribuem para as estruturas neurais ao longo do desenvolvimento.

Por exemplo, embriões C EER MG FP em E 12,5, exibem fluorescência GFP principalmente no mesencéfalo, posterior do cérebro posterior e medula espinhal em alta ampliação, projeções neuronais finas são vistas inervando. As células marcadas da parede do corpo do mesencéfalo e da região craniofacial também podem ser visualizadas e analisadas em nível celular por imuno-histoquímica. Conforme mostrado nesta seção óptica de um micrômetro de espessura de um embrião E 12.5 marcado pela administração de tamoxifeno em E 8.5, a marcação de anticorpos beta galacto nucleares em vermelho e a marcação de anticorpos GFP em verde indicam células mapeadas de destino mostradas no mesencéfalo ventral.

Aqui, as células combinadas são duplamente positivas devido à natureza do repórter MGFP condicional no cérebro adulto. A densidade do tecido maduro pode obscurecer a fluorescência da GFP que emana das estruturas cerebrais internas. Portanto, a microscopia de fluorescência de montagem total revela apenas uma fraca fluorescência de GFP no CUI superior do adulto que avalia a vitória.

Uma linhagem marcada em E 8,5 em seções adultas com microscopia de baixa ampliação revela que a linhagem WIN um dá origem a estruturas do mesencéfalo, incluindo o cui superior e inferior. Nesta imagem de maior ampliação tirada do mesencéfalo ventral nas proximidades de neurônios dopaminérgicos, células nucleares beta cal positivas e um rico plexo axonal positivo para GFP podem ser vistos em contraste, a marcação em E 9,5 resulta em marcação substancial de GFP que é prontamente observada no colo inferior do mesencéfalo por fluorescência de montagem inteira. A linhagem WINT one marcada em E 9,5 em cortes adultos está concentrada no kaulu inferior, como visto com microscopia de baixa ampliação.

Nesta imagem de maior ampliação tirada do mesencéfalo ventral nos neurônios dopaminérgicos, células nucleares beta gel positivas e um rico plexo axonal positivo para GFP podem ser vistos. Assim, enquanto os neurônios derivados de win one marcados para E 8.5 versus E 9.5 são progressivamente impedidos de contribuir para o mesencéfalo dorsal. A linhagem WIN one persiste em contribuir para o mesencéfalo ventral.

Acabamos de mostrar o procedimento para mapeamento genético de destino induzível para marcar e rastrear linhagens celulares in vivo. Isso nos permite marcar as células com base em sua linhagem genética e rastreá-las ao longo do tempo, mesmo após a extinção da expressão gênica. Com o tamoxifeno administrado aos oito anos e meio, mostramos que o domínio sagacidade contribui para o desenvolvimento do mesencéfalo, além de todo o mesencéfalo no adulto.

Em contraste, a administração de tamoxifeno a nove anos e meio quando o domínio sagacidade um se torna restrito, resulta em uma contribuição mais restrita para o mesencéfalo em desenvolvimento durante a embriogênese, que persiste no adulto. Ao fazer este procedimento, é importante considerar que o sistema marca as células em mosaico e, portanto, nem todas as células em uma estrutura específica podem ser rotuladas. Isso provavelmente se deve à linha CRE er ou ao alelo repórter condicional que está sendo usado.

É importante ressaltar que, embora a marcação celular seja um mosaico, o padrão e a distribuição das células mar são altamente reprodutíveis. Descobrimos que a administração de tamoxifeno por gavagem oral é vantajosa em comparação com a administração por injeção interperitoneal porque minimiza a inflamação no espaço interperitoneal, bem como danos mecânicos aos embriões. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.