Uma Abordagem Prática para mapeamento genético induzível Fate: Um Guia Visual para Mark e Track Células In Vivo

Os mapas de destino são gerados por meio da marcação e rastreamento de células in vivo para determinar como os progenitores contribuem para estruturas específicas e tipos celulares em tecidos em desenvolvimento e adultos. Um avanço nesse conceito é o mapeamento genético induzível de destino, ou GIFM, que associa a expressão gênica e os comportamentos celulares in vivo para criar mapas de destino com base na linhagem genética. Olá, meu nome é Deborah Ellisor do Laboratório Mark Services e do departamento de Biologia Molecular, Biologia Celular e Bioquímica da Universidade Brown.

Hoje, meus colegas Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown e eu demonstraremos um procedimento para mapeamento genético induzível de linhagem. Utilizamos este procedimento no laboratório para estudar o desenvolvimento inicial do cérebro. Também podemos aplicar esta técnica a estudos de inativação gênica e modelos animais de doenças humanas.

Então vamos começar com embriões X cre, E-R-M-G-F-P. O alelo MGFP LAE é um alelo repórter presente em todas as células, representadas pelos ovais cinzentos X cre, er, onde X representa elementos regulatórios do gene. O controle da expressão de C ER é espacialmente restrito ao domínio de expressão do gene X, mostrado em azul, e a proteína CRE ER é sequestrada no citoplasma pela HSP 90.

Na ausência de tamoxifeno, o repórter permanecerá inativo. A administração de tamoxifeno resulta em células marcadas na linhagem no domínio X porque o CER é liberado do HSP 90, transloca-se para o núcleo e remove o cassete de parada do alelo repórter. A recombinação permanente e herdável garante que as células expressem constitutivamente MG FP LA Z. A combinação do alelo repórter CER com tamoxifeno resulta em marcação quando uma população celular é inicialmente marcada em uma região encefálica primordial do embrião com base na expressão gênica; essas células marcadas na linhagem são rastreadas mesmo após a expressão gênica inicial utilizada para ativar o CER ser extinta.

Dessa forma, a distribuição final e o destino terminal de uma linhagem celular geneticamente definida podem ser identificados no adulto. Este procedimento começa com o preparo de uma solução de tamoxifeno de 20 miligramas por mililitro, dissolvendo-se 200 miligramas de tamoxifeno em 10 mililitros de óleo de milho pré-aquecido em um frasco de inalação de vidro.

Em seguida, incubar a solução a 37 graus Celsius por duas horas em um vórtex Tator. Proteger intermitentemente a solução estoque de Tamoxifeno preparada da luz envolvendo o frasco com papel alumínio e armazenar a quatro graus Celsius. O estoque pode ser utilizado por até um mês.

Para experimentos de mapeamento de destino, estabeleça um casal reprodutor composto por uma fêmea selvagem da linhagem Swiss Webster e um macho portador de um alelo CreER específico para o gene e de um alelo repórter. Para fins desta demonstração, utilizaremos um macho win to one CreER MG FP. Verifique diariamente, pela manhã, a presença de tampão vaginal na fêmea Swiss Webster.

Designe a manhã do dia em que o tampão vaginal é observado como 0,5 dia pós-coito e calcule a data de administração do Tamoxifeno. Com base neste ponto inicial, neste experimento, o Tamoxifeno será administrado no 8,5º dia embrionário. Usando uma seringa de um mililitro com uma agulha para alimentação animal, aspire 200 microlitros da solução estoque de Tamoxifeno.

Restrinja firmemente a fêmea Swiss Webster com gestação cronometrada segurando a pele da nuca e das costas para imobilizar a cabeça e vire o camundongo de modo que o lado ventral fique voltado para cima. Segure a cauda entre os dedos livres para manter o corpo em linha reta. Em seguida, coloque a cânula de alimentação no canto da boca e guie suavemente a cânula paralelamente ao palato até que a ponta da cânula esteja aproximadamente na posição do olho.

Incline suavemente a cabeça para trás para obter acesso ao esôfago. Direcione a agulha para além da epiglote e pelo esôfago em direção ao estômago. Tenha cuidado para não entrar na traqueia.

Uma vez que a agulha de alimentação esteja no estômago, administre o tamoxifeno e remova a agulha. Em seguida, devolva a fêmea à sua gaiola de origem até a data da dissecação. Na data da dissecação, embriões E 12,5 da fêmea prenhe com tempo controlado são dissecados e então avaliados quanto à marcação GFP.

Em um embrião positivo para GFP, observamos que os neurônios derivados do ventrículo um contribuem para o mesencéfalo, o rombencéfalo e a medula espinhal. O repórter MG FP marca as projeções axonais, que também podem ser observadas em embriões transferidos. Embriões positivos para GFP são montados em lâmina e colocados em uma placa de Petri contendo PPS e fotografados usando o picture frame. Após a obtenção das fotografias, utilize pinças para pinçar um pequeno pedaço da cauda de cada embrião e coloque cada fragmento em um tubo de PCR. Os tecidos serão genotipados por PCR para ambos os alelos, a fim de confirmar os resultados observados por meio da análise em montagem inteira.

Os seguintes procedimentos permitem-nos analisar como as células marcadas derivadas de regiões embrionárias povoam o cérebro adulto antes de iniciar a craniotomia. Confirmado por um aperto no dedo do pé que o camundongo está completamente anestesiado. Com o nembutal, realize incisões para obter acesso ao coração através da caixa torácica.

Em seguida, posicione uma agulha tipo borboleta no ápice ou no ventrículo esquerdo do coração e fixe com o grampo C. Crie um local de saída do fluido no átrio direito com uma tesoura, depois realize a perfusão com 10 a 15 mililitros de solução salina gelada até que o fluido saia límpido. Em seguida, perfunda com 20 a 25 mililitros de paraformaldeído a 4%.

Quando a perfusão intracardíaca estiver completa, remova a cabeça com uma tesoura cortando a coluna vertebral logo acima dos ombros. Passe um bisturi ao longo da linha média dorsal da cabeça, da região rostral do cottle, para cortar o couro cabeludo e expor o crânio. Com o bisturi, remova cuidadosamente qualquer tecido ou músculo em excesso ao longo dos lados e da região posterior do crânio.

Com pinças, perfure o crânio na linha média, logo cranialmente aos bulbos olfativos, e crie um pequeno orifício para acomodar as pontas de uma tesoura fina. Insira a tesoura fina nesse orifício e faça dois cortes bilaterais a partir da linha média, seguindo o comprimento dos bulbos olfativos. Esse corte irá romper o crânio na interseção entre o osso nasal e o osso frontal, proporcionando bom acesso à tesoura.

Corte ao longo das suturas sagitais no crânio, certificando-se de manter as pontas da tesoura inclinadas para longe do cérebro para evitar danificar o tecido subjacente. Em seguida, segure suavemente o crânio com pinça e retire o osso ao longo da incisão medial para expor o cérebro. O crânio pode se fragmentar em pequenos pedaços ou se soltar em seções maiores.

Continue usando a pinça para remover todos os ossos frontais parietais, interparietais e occipitais. Libere os paraócios localizados ao longo das bordas laterais do cérebro ao nível do cerebelo pinçando suavemente os ossos esféricos de cada lado. Use a tesoura para cortar cuidadosamente a parte dorsal do osso que envolve o tronco encefálico.

Insira um lado da tesoura logo abaixo da borda dorsal do osso, começando no ponto onde a medula espinhal foi cortada e cortando em direção ao cerebelo. Para soltar o tronco encefálico e o cerebelo. Remova o osso remanescente ao redor do tronco encefálico com a pinça.

Retire suavemente os ossos, vire a cabeça com o lado dorsal para baixo e use a pinça para seccionar os nervos cranianos e liberar o cérebro do crânio. Coloque o cérebro em uma placa de Petri com gelo. Avalie o cérebro adulto quanto à marcação com GFP em PPS frio, utilizando um microscópio estereoscópico de fluorescência e fotografe usando um suporte para câmera.

Neste exemplo, o mesencéfalo é marcado pelo GFP, além de seu uso na análise de linhagem durante a embriogênese, e no GIFM adulto pode ser combinado com outras aplicações comumente utilizadas na biologia do desenvolvimento, como microdissecação e experimentos com explantes de tecido. Por exemplo, o mesencéfalo ventral é a zona progenitora para neurônios dopaminérgicos em desenvolvimento, que expressam o gene wind one. Assim, o isolamento do mesencéfalo ventral por microdissecação permite estabelecer um ambiente in vitro para investigar mais a fundo seu desenvolvimento.

Este representa apenas um exemplo do uso de GIFM para isolar uma zona de progenitores de interesse definida pela história genética. Para iniciar este procedimento, transfira os embriões positivos para GFP previamente identificados para PBS estéril gelado em um recipiente de cultura celular usando tesoura fina. Remova a porção cefálica de um embrião cortando transversalmente próximo à região rombóide.

A seguir, remova a porção rostral da cabeça com um corte coronal através do cefalópodo. Isso exporá uma estrutura semelhante a um tubo na qual o quarto ventrículo, através da vesícula mesencefálica, forma um conduto entre os tecidos dorsal e ventral. Insira cuidadosamente as pontas da tesoura no quarto ventrículo e corte ao longo da linha média dorsal, estendendo-se até a região rostral, abrindo completamente o tubo, criando assim uma preparação do tipo "livro aberto".

O mesencéfalo ventral agora estará exposto medialmente. Embora as duas metades dorsais do mesencéfalo permaneçam localizadas lateralmente, pode ser necessário remover qualquer tecido não neural remanescente sob o mesencéfalo ventral. Para que o explante fique plano, ele agora deve assemelhar-se a uma borboleta, na qual o mesencéfalo dorsal representa as asas e o rombo mesencefálico representa a cauda.

Para isolar ainda mais o mesencéfalo ventral para análises por fax ou experimentos de cultura celular, remova as regiões laterais do tecido. Agora mostraremos alguns resultados representativos de GIFM. Neste experimento, células que expressam WINT uma marcadas em E 8,5 são visualizadas para determinar como as células direcionadas por wint uma contribuem para estruturas neurais ao longo do desenvolvimento.

Por exemplo, embriões C EER MG FP em E 12,5, expostos ao Tamoxifeno em E 8,5, exibem fluorescência GFP principalmente no mesencéfalo, no hindbrain posterior e na medula espinhal; em alta ampliação, observam-se finas projeções neuronais inervando essas regiões. Células marcadas no mesencéfalo, parede corporal, membros e região craniofacial também podem ser visualizadas e analisadas ao nível celular por imuno-histoquímica. Conforme mostrado nesta seção óptica de um micrômetro de espessura de um embrião em E 12,5 marcado pela administração de Tamoxifeno em E 8,5, a marcação com anticorpo contra beta-galactosidase no núcleo em vermelho e a marcação com anticorpo GFP em verde indicam células mapeadas no destino, observadas no mesencéfalo ventral.

Aqui, as células combinadas são duplamente positivas devido à natureza do repórter condicional MGFP no cérebro adulto. A densidade do tecido maduro pode obscurecer a fluorescência GFP proveniente de estruturas cerebrais internas. Portanto, a microscopia de fluorescência em preparação inteira revela apenas uma fraca fluorescência GFP na CUI superior do adulto ao avaliar o resultado.

Uma linhagem marcada no E 8,5 em cortes de adultos com microscopia de baixa ampliação revela que a linhagem WIN dá origem a estruturas do mesencéfalo, incluindo os colículos superior e inferior. Nesta imagem de maior ampliação obtida do mesencéfalo ventral na proximidade de neurônios dopaminérgicos, células positivas para beta cal nuclear e um denso plexo axonal positivo para GFP podem ser observadas. Em contraste, a marcação no E 9,5 resulta em rotulagem substancial com GFP, facilmente observada no colículo inferior do mesencéfalo por meio de fluorescência em montagem inteira. A linhagem WINT marcada no E 9,5 em cortes de adultos está concentrada no colículo inferior, conforme visto com microscopia de baixa ampliação.

Nesta imagem de maior aumento obtida a partir do mesencéfalo ventral de neurônios dopaminérgicos, podem ser observadas células positivas para beta-gal nuclear e um rico plexo axonal positivo para GFP. Assim, enquanto os neurônios derivados de WIN um marcados do E 8,5 ao E 9,5 são progressivamente restritos de contribuir para o mesencéfalo dorsal, a linhagem WIN um persiste contribuindo para o mesencéfalo ventral.

Acabamos de mostrar o procedimento para mapeamento genético induzível de destino celular, que permite marcar e rastrear linhagens celulares in vivo. Isso nos permite marcar células com base em sua linhagem genética e rastreá-las ao longo do tempo, mesmo após a expressão gênica ter sido interrompida. Com a administração de tamoxifeno aos oito meses e meio, demonstramos que o domínio wit um contribui para o desenvolvimento do mesencéfalo, além de compor todo o mesencéfalo no adulto.

Em contraste, a administração de tamoxifeno em nove dias e meio, quando o domínio wit1 torna-se restrito, resulta em uma contribuição mais limitada para o mesencéfalo em desenvolvimento durante a embriogênese, a qual persiste até a fase adulta. Ao realizar este procedimento, é importante considerar que o sistema marca as células de forma mosaicista, e, portanto, nem todas as células em uma estrutura específica podem ser marcadas. Isso provavelmente ocorre devido à linhagem CRE-er ou ao alelo repórter condicional que está sendo utilizada.

Importante: embora a marcação celular seja mosaicica, o padrão e a distribuição das células marcadas são altamente reprodutíveis. Descobrimos que a administração de tamoxifeno por gavagem oral é vantajosa em comparação com a administração por injeção intraperitoneal, pois minimiza a inflamação no espaço intraperitoneal, bem como danos mecânicos aos embriões. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.