drosófila Quantificação da Junção Neuromuscular (NMJ): Um Método para Avaliar a Morfologia e Função Sináptica

- Primeiro, imunocorar larvas de Drosophila com marcadores que destacam diferentes aspectos das JNMs ou junções neuromusculares. Esta é a região onde a terminação de um axônio do neurônio motor entra em contato com um músculo, e sua morfologia é usada como uma leitura da função sináptica.

O axônio termina em vários ramos que formam protuberâncias chamadas botões. Os neurotransmissores são liberados dos botões e causam contração muscular. As áreas de liberação de neurotransmissores são chamadas de zonas ativas. Aqui, um marcador é específico para uma proteína sináptica que delineia a NMJ, e o outro marcador é para uma proteína presente em zonas ativas.

Em seguida, adquira imagens NMJ usando microscopia e avalie quantitativamente sua morfologia com um software de análise de imagem semiautomatizado. Aplique uma série predefinida de comandos de software às imagens. Os arquivos de saída contêm imagens NMJ analisadas e resultados de morfologia. As características que podem ser medidas incluem número e área de superfície de botões, comprimento NMJ e número de ramificações, número de compartimentos NMJ não conectados e número de zonas ativas.

No exemplo a seguir, analisaremos a morfologia de Drosophila NMJs coradas com DLG1, um marcador pós-sináptico, e BRP, um marcador de zona ativa.

- Para este protocolo, gere pilhas de imagens de NMJs e salve-as como arquivos TIFF individuais onde o canal 1 mostra a coloração DLG1 ou marcador semelhante e o canal 2 mostra a coloração BRP. Para começar, crie projeções Z e hyperstacks dos arquivos de imagem NMJ. Abra as opções do plugin e selecione Drosophila NMJ morphometrics.

Agora, identifique a string de arquivo exclusiva que o microscópio atribuiu à série de imagens ao armazená-las como TIFF. Isso estará no final do nome da imagem. Copie e cole a string fornecida ao plano e número de canal mais baixos na janela de configuração de string de arquivo exclusiva. Em seguida, selecione a submacro 'Converter em pilha' e escolha o diretório ou pasta onde as imagens estão localizadas.

Para cada arquivo de imagem, dois novos arquivos são criados com os nomes padrão stack e flat stack, seguidos pelo nome da imagem original. Os arquivos originais podem ser excluídos para economizar espaço de armazenamento. Em seguida, na interface morfométrica Drosophila NMJ, selecione a submacro ROI definida e escolha o diretório do arquivo de imagem.

Quando a primeira projeção for aberta, selecione a ferramenta de seleções à mão livre e use o mouse para definir uma região contendo um terminal NMJ completo de interesse. Uma vez selecionado, clique em OK na janela de terminal definida. Continue fazendo isso até que os terminais NMJ sejam definidos em todas as projeções. A macro avança o processo automaticamente. Para cada arquivo de imagem, um novo arquivo é feito com os nomes padrão ROI seguidos pelo nome da imagem original.

Para quantificar as características NMJ, primeiro vá para a interface morfométrica Drosophila NMJ e defina a escala. Por exemplo, se um pixel da imagem corresponder a 0,72 mícrons, defina os pixels de escala como 1 e a distância de escala como 0,072. Em seguida, selecione a submacro Analisar e, se houver duas imagens de canal, alterne também Aguarde. Pressione OK e, quando solicitado, selecione o diretório do arquivo de imagem. O tempo de processamento pode ser de vários minutos por sinapse.

Após a análise, novos arquivos de imagem para cada sinapse analisada são armazenados na pasta pai e as medições quantitativas estão no arquivo results.txt. Inspecione todas as imagens e exclua imagens com erros de segmentação.

Por exemplo, partes do terminal sináptico podem não estar incluídas no contorno amarelo. Partes do plano de fundo podem ser incluídas no terminal sináptico. Uma linha de esqueleto azul pode se estender além do terminal sináptico. Pode haver muitas zonas ativas ou algumas zonas ativas podem permanecer não detectadas.