Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

Um dos objetivos mais importantes da neurociência é entender as pistas moleculares que instruem os estágios iniciais da formação das sinapses. Como tal, tornou-se imperativo desenvolver abordagens objetivas para quantificar as mudanças na conectividade sináptica. Para quantificar o número de sinapses em uma variedade de preparações experimentais, neurônios cultivados ou preparações de tecido cerebral crioseccional são corados com marcadores seletivos pré e pós-sinápticos para rotular pontos de contato sináptico entre os neurônios.

As células ou tecidos são então visualizados em um microscópio fluorescente e imagens de oito bits são necessárias para cada um dos canais correspondentes aos dois marcadores imuno-histoquímicos. As imagens são analisadas usando a imagem J 1.29 com analisador de pontos. Para determinar a extensão da colocalização entre os marcadores pré e pós-sinápticos, os pontos de colocalização podem ser usados para determinar o número de sinapses presentes na preparação.

A principal vantagem da técnica descrita aqui sobre os métodos existentes, como a microscopia eletrônica, é que o ensaio de sinapse permite uma análise de rendimento muito maior e quantificação do número de sinapses. As principais implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico e terapia de distúrbios clínicos, como doença de Alzheimer, epilepsia ou autismo, nos quais anormalidades e conectividade sináptica foram implicadas como base para a patologia subjacente. Essa técnica pode ser utilizada para identificar formas de intervenção que podem reduzir ou melhorar as deficiências que vemos na capacidade dos neurônios afetados de formar sinapses uns com os outros.

Embora esse método seja útil para estudar o desenvolvimento do cérebro, ele também pode ser aplicado a outros organismos modelo ou sistemas de órgãos nos quais você está interessado em estudar ou quantificar o número de contatos célula a célula para os quais você tem a capacidade de rotular seletivamente cada face oposta de cada local de contato. Preparar culturas neuronais por plaqueamento de células ganglionares da retina de rato purificadas da retina de rato, colhidas de P cinco a sete animais em lamínulas de vidro revestidas com poli de licina. Em uma placa de 24 poços, as células podem crescer a 37 graus Celsius por três a cinco dias antes da transfecção.

Após a transfecção, incube as células por mais sete a oito dias para permitir que as sinapses se desenvolvam quando as células plaqueadas estiverem suficientemente maduras. Remova o meio de cultura dos poços e adicione 500 microlitros de formaldeído pré-aquecido a 4% para cada poço fixado por sete minutos. À temperatura ambiente após a fixação, enxágue as células três vezes com solução salina tamponada com fosfato.

É importante garantir que as células nunca sequem nos poços. Uma vez que um buffer é removido de um poço, ele deve ser imediatamente substituído pelo próximo buffer. Prepare o tampão de bloqueio contendo 50% de soro de cabra normal e 0,2% de Triton X 100.

Depois de remover o PBS de cada um, adicione 200 microlitros do tampão de bloqueio a cada poço e bloqueie por 30 minutos. À temperatura ambiente, remova o tampão de bloqueio e enxágue três vezes. Com PBS, prepare uma diluição de anticorpos primários em tampão de anticorpos a 90% e solução de 10% NGS contendo o par de anticorpos pré e pós-sinápticos de sua escolha.

Aqui, um coelho antis sinapsina, um marcador pré-sináptico e um camundongo anti homer. Um marcador pós-sináptico é usado Centrífuga, a diluição do anticorpo primário por cinco minutos na velocidade máxima em uma centrífuga de bancada para remover qualquer anticorpo precipitado e, em seguida, adicionar 200 microlitros de solução de anticorpo primário a cada um. Coloque a placa em um recipiente umidificado para evitar o ressecamento da solução primária.

Incubar durante a noite a quatro graus Celsius após a incubação com anticorpo primário. Enxágue cada um bem três vezes. Com PBS, adicione 200 microlitros dos anticorpos secundários apropriados, diluídos de um a 1000 em tampão de anticorpos contendo 10% de NGS preparado.

Como antes, coloque o prato na câmara umidificada e incube por duas horas em temperatura ambiente no escuro após a incubação com secundários. Enxágue cada poço três a quatro vezes com PBS. Coloque uma gota de meio de montagem de blindagem vetorial com DPI em uma lâmina de vidro.

Em seguida, inverta a lamínula com as células na gota para montar. Por fim, aplique esmalte transparente nas bordas da lamínula. Tome cuidado para evitar cutucar ou mover as lamínulas durante a aplicação.

Como isso compartilhará as células, deixe as lâminas secarem por pelo menos 30 minutos em um local seco e escuro. Aqui, a imagem é realizada usando um microscópio de fluorescência zes axio imager equipado com conjuntos de filtros apropriados e uma objetiva de imersão em óleo de 63 vezes. Coloque uma lâmina contendo células não transfectadas no microscópio stage.

Usando o conjunto de filtros DPI para visualizar núcleos de células, selecione células que estejam a pelo menos dois diâmetros de células de distância de seus vizinhos mais próximos. O uso de DPI para esta etapa ajudará a evitar vieses e garantir a aleatoriedade da seleção de células. Para cada célula selecionada, obtenha imagens de oito bits usando os conjuntos de filtros apropriados neste caso, GFP e Texas Red.

A imagem pseudocolorida sobreposta deve mostrar marcadores pré e pós-sinápticos em vermelho e verde, respectivamente. Em seguida, coloque uma lâmina contendo células transfectadas no microscópio stage. Aqui, as células foram transfectadas com um vetor de expressão de tomate TD.

Use este marcador para selecionar as células como antes. Para cada célula selecionada, obtenha oito imagens de poço usando os conjuntos de filtros apropriados neste caso, GFP, Texas Red e Sci cinco. A imagem pseudocolorida sobreposta deve ter os marcadores pós-sinápticos em vermelho, verde e azul.

Aqui, o programa analisador de punção é usado para quantificação de punção sináptica colocalizada. O plugin do analisador Puncta foi escrito por Barry Walk e está disponível mediante solicitação na imagem J 1.26. Abra uma das imagens coletadas.

Use a ferramenta de seleção circular para selecionar uma região de aproximadamente um diâmetro de célula radialmente ao redor do SOR de interesse. Com a região de interesse selecionada, vá para o menu de plugins e selecione analisador de punção na janela de opções de análise que aparece Selecione o canal vermelho Canal verde. O primeiro subtrai o plano de fundo e o arquivo de resultados definidos.

Clique em OK. Em seguida, defina um local para salvar os resultados. Esses resultados podem ser exportados para o Excel para análise posterior na janela exibida.

Em seguida, certifique-se de que um raio de bola rolante de 50 esteja selecionado e desmarque a opção de fundo branco. Essa modificação não é necessária, mas geralmente é preferida pelos usuários do aplicativo. Para facilitar a visualização, clique em OK.

Uma nova janela aparecerá ao lado de uma máscara correspondente à imagem do canal vermelho. Ajuste o limite até que a máscara vermelha corresponda o melhor possível com o maior número possível de punções individuais discretas. Sem introduzir muito ruído, clique em concluído.

Defina o tamanho mínimo do ponto para quatro pixels. Não modifique mais nada. Clique em OK.

Repita a etapa anterior desta vez para o canal verde. Depois de repetir isso com o canal verde, o plugin fornecerá a quantificação correspondente aos pontos em cada canal separadamente e um ponto colocalizado entre os dois canais. O ensaio de sinapse mostrado aqui pode ser aplicado a seções criogênicas do cérebro e a qualquer outro tecido do sistema nervoso, como medula espinhal ou retina.

Desde que haja um par de marcadores pré e pós-sinápticos adequados. Comece colhendo tecido cerebral de um camundongo que foi sacrificado por exsanguinação e profusão com PBS. Coloque todo o cérebro em 4% de paraldeído em PBS a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte.

Enxágue o cérebro três vezes com PBS. Cryo protege o cérebro colocando-o em 30% de sacarose. Na PBS.

O tecido inicialmente flutuará a quatro graus Celsius até que o tecido afunde para o fundo. Nessa fase, a proteção criogênica está completa. Em seguida, em uma solução de dois para um de sacarose a 20% para OCT e PBS, incorpore a brainina na orientação desejada para seccionamento.

Por exemplo, sagital ou coronal. Em seguida, coloque uma superfície plana de metal em cima de um balde de gelo seco. Coloque o cérebro embutido nele para congelar depois de congelado, transfira o cérebro para um saco de freezer e coloque-os a 80 graus Celsius negativos por até um ano antes de seccionar.

Usando um criostato, corte o tecido em seções de 12 a 16 mícrons e monte em lâminas de vidro. Em seguida, seque as lâminas colocando-as em um forno a 37 graus Celsius. Em seguida, enxágue-os três vezes com PBS para remover a OCT residual.

Uma caneta de parafina é usada para criar uma barreira hidrofóbica ao redor da lâmina e o tampão de bloqueio é adicionado à lâmina, impedindo que flua da lâmina pela borda de parafina. Coloque as lâminas em soro de cabra normal a 20% em PBS por uma hora em temperatura ambiente para bloquear o próximo local. As seções em anticorpos primários diluídos em PBS com 0,3% de tritão e 10% de soro de cabra normal.

Aqui, antítex de coelho, PSD 95 é usado para rotular compartimentos glutamatérgicos e pós-sinápticos e cobaia anti v glu dois é usado para rotular terminais pré-sinápticos glutamatérgicos. Coloque as lâminas a quatro graus Celsius e incube por 36 a 60 horas após a incubação. Lave o anticorpo primário imergindo as lâminas três vezes em PBS por 15 minutos cada.

Após esta etapa, certifique-se de proteger os slides da luz direta. Aplique anticorpos secundários diluídos de um a 200 em PBS com 0,3% de triton e 10% de soro de cabra normal. Aqui, cabra anti-cobaia.

Alexa 4 8 8 e cabra anti coelho. Alexa 5 9 4 são usados. Incube por duas horas em temperatura ambiente no escuro.

Lave as lâminas mergulhando-as quatro vezes em PBS por 15 minutos cada para montar. Adicione pequenas gotas de meio de montagem de escudo vetorial com dappy e cubra as lâminas com lamínulas. Aplique esmalte para inibir os movimentos das lamínulas.

A imagem da seção de tecido deve ser realizada usando um microscópio confocal com lasers apropriados usando uma objetiva de imersão em óleo de 63 vezes para cada imagem de seção, seções ópticas seriais em intervalos de 0,33 mícron em uma profundidade total de cinco mícrons para um total de 15 seções ópticas. Pelo menos três seções de cada animal devem ser fotografadas e pelo menos três animais devem ser incluídos de uma determinada condição experimental. Gere projeções de intensidade máxima a partir de grupos de três seções consecutivas, produzindo cinco projeções representando um mícron de profundidade cada.

Estes são quantificados usando a Imagem J, conforme descrito para RG Cs com uma ROI modificada para determinar o número de sinapses formadas na ausência de astrócitos. A imunoquímica foi realizada em rgc dissociado tratado com meio de crescimento basal usando anticorpos contra fagote mostrados em vermelho e homer mostrados em verde, conforme esperado. Muito poucos pontos de colocalização sináptica são observados para determinar o efeito das moléculas secretadas por astrócitos no número de sinapses formadas in vitro RG Cs dissociados foram tratados com meio condicionado de astrócitos de camundongo a cada três dias por um total de 12 dias após a coloração.

Numerosas sinapses eram evidentes neste neurônio, mas logo é mostrado em vermelho. Homer é mostrado em RDCs dissociados verdes transfectados com tomate TD expresso em Lee citoplasmático foram tratados apenas com crescimento basal. Sinapses médias não são vistas.

O tomate TD é visto em azul e a sinapse em vermelho. Há muito pouco sinal visto para o marcador pós-sináptico homer mostrado em verde. Quando as mesmas células são tratadas cronicamente com meio condicionado de astrócitos de rato, muitas sinapses são vistas.

O tomate TD está em azul, a sinapsina em vermelho e o homer em verde aqui. Mostra-se um RGC purificado que foi tratado com meio condicionado de astrócitos e foi corado para pré-sinapse em vermelho e marcadores verdes homer pós-sinápticos As máscaras de limiar geradas usando o analisador de punção correspondem aos dois canais presentes. Ao identificar pontos de colocalização, o analisador Puncta produz uma representação gráfica desses pontos.

Uma saída numérica é fornecida pelo analisador de pontos que indica o número de pontos discretos identificados em ambos os canais e para pontos de colocalização. Os dados produzidos pela análise deste neurônio ilustram a capacidade das moléculas secretadas pelos astrócitos de promover a formação de sinapses mostradas aqui como um ensaio de sinapse no qual a colocalização da marcação imuno-histoquímica pré e pós-sináptica foi quantificada para demonstrar a potencialização da formação de sinapses induzida por astrócitos por superexpressão do receptor neuronal para a importante molécula gênica de sinapse secretada por astrócitos trombo espondo. Nesta figura é mostrado o número médio de sinapses por neurônio cronicamente tratado com meio de crescimento basal, gm, ou com meio condicionado de astrócitos.

A-C-M-A-C-M promove mais fortemente a formação de sinapses nas células ganglionares da retina sobre a expressão do receptor trombo spon em comparação com as células que expressam um vetor vazio. Para quantificar a densidade sináptica no colículo superior de camundongo, os compartimentos pré e pós-sinápticos foram marcados separadamente usando marcadores imuno-histoquímicos específicos do compartimento. Como mostrado aqui, houve um aumento no número de sinapses do sétimo dia pós-natal para o P 14.

Isso ilustra o aumento do número de sinapses no ulo superior durante essa janela de tempo de desenvolvimento. Uma vez dominado, este protocolo pode ser concluído em cerca de dois dias para culturas neuronais dissociadas e em cerca de cinco dias para seções cerebrais da colheita do animal após este procedimento. Outros métodos, como eletrofisiologia e microscopia eletrônica, são utilizados para verificar se as mudanças no número de sinapses refletem mudanças nas sinapses funcionais e nas sinapses ultraestruturalmente normais, respectivamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aplicar a imuno-histoquímica à sua preparação experimental para quantificar o número de sinapses. Este protocolo detalha como usar anticorpos específicos do compartimento para rotular seletivamente os compartimentos pré e pós-sinápticos. Nesse contexto, definimos sinapses como pontos de colocalização entre os sinais obtidos de cada um desses marcadores.