Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

Um dos objetivos mais importantes da neurociência é compreender os sinais moleculares que orientam as fases iniciais da formação de sinapses. Assim, tornou-se essencial desenvolver abordagens objetivas para quantificar alterações na conectividade sináptica. Para quantificar o número de sinapses em diversos preparos experimentais, neurônios cultivados ou cortes crioseccionados de tecido cerebral são corados com marcadores seletivos pré e pós-sinápticos para identificar pontos de contato sináptico entre neurônios.

As células ou o tecido são então imagiados em um microscópio fluorescente, obtendo-se imagens de oito bits para cada um dos canais correspondentes aos dois marcadores imuno-histoquímicos. As imagens são analisadas usando o ImageJ 1.29 com o analisador de pontos. Para determinar o grau de colocalização entre marcadores pré e pós-sinápticos, os pontos de colocalização podem ser utilizados para determinar o número de sinapses presentes na preparação.

A principal vantagem da técnica descrita aqui em comparação com métodos existentes, como a microscopia eletrônica, é que o ensaio de sinapse permite uma análise e quantificação de alto rendimento do número de sinapses. As principais implicações dessa técnica estendem-se para o diagnóstico e terapia de distúrbios clínicos, como a doença de Alzheimer, epilepsia ou autismo, nos quais anormalidades e conectividade sináptica têm sido implicadas como base da patologia subjacente. Esta técnica pode ser utilizada para identificar formas de intervenção que possam reduzir ou atenuar as deficiências observadas na capacidade dos neurônios afetados de formar sinapses entre si.

Embora este método seja útil para estudar o desenvolvimento cerebral, ele também pode ser aplicado a outros organismos modelo ou sistemas de órgãos nos quais você tenha interesse em estudar ou quantificar o número de contatos célula a célula, desde que seja possível rotular seletivamente cada face oposta de todos os sítios de contato. Prepare culturas neuronais semeando células ganglionares da retina de rato purificadas a partir da retina de rato, coletadas de animais P5 a P7, em lamínulas de vidro revestidas com poli-L-lisina. Em uma placa de 24 poços, as células são mantidas em crescimento a 37 °C por três a cinco dias antes da transfeção.

Após a transfeção, incubar as células por mais sete a oito dias para permitir o desenvolvimento de sinapses, quando as células cultivadas já tiverem atingido maturação suficiente. Remover o meio de cultura dos poços e adicionar 500 microlitros de paraformaldeído a 4%, previamente aquecido, a cada poço, fixando por sete minutos. À temperatura ambiente, após a fixação, lavar as células três vezes com solução salina tamponada com fosfato.

É importante garantir que as células nunca sequem nos poços. Assim que um tampão for removido de um poço, ele deve ser imediatamente substituído pelo próximo tampão. Prepare o tampão bloqueador contendo 50% de soro normal de cabra e 0,2% de Triton X-100.

Após remover o PBS de cada poço, adicione 200 microlitros do tampão bloqueador a cada poço e realize o bloqueio por 30 minutos. À temperatura ambiente, remova o tampão bloqueador e lave três vezes com PBS. Prepare uma diluição do anticorpo primário no tampão de anticorpo a 90%, solução de NGS a 10%, contendo o par de anticorpos pré e pós-sinápticos de escolha.

Aqui, utiliza-se um anticorpo antissinapsina de coelho, um marcador pré-sináptico, e um anticorpo anti-homer de camundongo, um marcador pós-sináptico. Centrifugue a diluição do anticorpo primário por cinco minutos na velocidade máxima em uma centrífuga de bancada para remover qualquer anticorpo precipitado, então adicione 200 microlitros da solução de anticorpo primário a cada poço. Coloque a placa em um recipiente umidificado para evitar a secagem da solução primária.

Incubar durante a noite a quatro graus Celsius após a incubação com o anticorpo primário. Enxaguar cada poço três vezes. Com PBS, adicionar 200 microlitros dos anticorpos secundários apropriados, diluídos na proporção de um para 1000 em tampão de anticorpos contendo NGS a 10% preparado.

Como antes, coloque a placa na câmara umidificada e incube por duas horas à temperatura ambiente no escuro, após a incubação com os anticorpos secundários. Enxágue cada poço três a quatro vezes com PBS. Coloque uma gota de meio de montagem Vector Shield com DPI sobre uma lâmina de vidro.

Em seguida, inverta a lamínula com as células sobre a gota para montagem. Por fim, aplique esmalte incolor ao redor das bordas da lamínula. Tenha cuidado para evitar empurrar ou mover as lamínulas durante a aplicação.

Como isso irá compartilhar as células, deixe as lâminas secarem por pelo menos 30 minutos em um local seco e escuro. Aqui, a imagem é obtida usando um microscópio de fluorescência Zeiss Axio Imager equipado com conjuntos de filtros apropriados e uma objetiva de imersão em óleo de 63 vezes. Coloque uma lâmina contendo células não transfectadas sobre a platina do microscópio.

Usando o conjunto de filtros DPI para visualizar os núcleos celulares, selecione células que estejam a pelo menos dois diâmetros celulares de distância de seus vizinhos mais próximos. O uso do DPI nesta etapa auxiliará na eliminação de viés e garantirá a aleatoriedade na seleção das células. Para cada célula selecionada, obtenha imagens de oito bits utilizando os conjuntos de filtros apropriados, neste caso, GFP e Texas Red.

A imagem sobreposta com cores falsas deve mostrar os marcadores pré e pós-sinápticos em vermelho e verde, respectivamente. Em seguida, coloque uma lâmina contendo células transfectadas sobre a platina do microscópio. Aqui, as células foram transfectadas com um vetor de expressão de tomate TD.

Use este marcador para selecionar células como antes. Para cada célula selecionada, obtenha oito imagens de pits usando os conjuntos de filtros apropriados, neste caso, GFP, Texas Red e Sci cinco. A imagem pseudocolorida sobreposta deve apresentar os marcadores pós-sinápticos em vermelho, verde e azul.

Aqui, o programa analisador de pontuações é utilizado para a quantificação de pontuações sinápticas co-localizadas. O plugin Puncta Analyzer foi desenvolvido por Barry Walk e está disponível mediante solicitação no ImageJ 1.26. Abra uma das imagens coletadas.

Use a ferramenta de seleção circular para selecionar uma região com aproximadamente um diâmetro celular em torno radial do SOR de interesse. Com a região de interesse selecionada, vá ao menu de plugins e selecione o analisador de perfuração na janela de opções de análise que aparece; selecione Canal Vermelho Canal Verde. Primeiro subtraia o fundo e defina o arquivo de resultados.

Clique em OK. Em seguida, defina um local para salvar os resultados. Esses resultados podem ser exportados para o Excel para análises adicionais na janela que aparecer.

Em seguida, certifique-se de selecionar um raio de esfera rolante de 50 e desmarque a opção de fundo branco. Essa modificação não é obrigatória, mas é frequentemente preferida pelos usuários do aplicativo. Para facilitar a visualização, clique em OK.

Uma nova janela aparecerá ao lado de uma máscara correspondente à imagem do canal vermelho. Ajuste o limiar até que a máscara vermelha corresponda o melhor possível com o maior número de perfurações individuais discretas. Sem introduzir ruído excessivo, clique em concluído.

Defina o tamanho mínimo do ponto como quatro pixels. Não modifique mais nada. Clique em OK.

Repita o passo anterior desta vez para o canal verde. Após repetir isso com o canal verde, o plugin fornecerá a quantificação correspondente aos pontos em cada canal separadamente e aos pontos colocalizados entre os dois canais. O ensaio de sinapse mostrado aqui pode ser aplicado a seções criostáticas do cérebro e a qualquer outro tecido do sistema nervoso, como medula espinhal ou retina.

Desde que haja um par adequado de marcadores pré e pós-sinápticos. Comece colhendo o tecido cerebral de um camundongo que tenha sido eutanasiado por exsanguinação e perfusão com PBS. Coloque todo o cérebro em paraformaldeído 4% em PBS a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte.

Lave o cérebro três vezes com PBS. Proteja o cérebro para criopreservação colocando-o em sacarose a 30% em PBS.

O tecido inicialmente flutuará; mantenha-o a quatro graus Celsius até que o tecido afunde até o fundo. Nesse estágio, a crioproteção está completa. Em seguida, em uma solução na proporção de dois para um de sacarose 20% para OCT e PBS, incorpore o cérebro na orientação desejada para o corte.

Por exemplo, sagital ou coronal. Em seguida, coloque uma superfície metálica plana sobre um recipiente com gelo seco. Coloque o cérebro embutido sobre ela para congelar; uma vez congelado, transfira o cérebro para um saco congelador e armazene a -80 graus Celsius por até um ano antes do corte.

Usando um criostato, corte o tecido em seções de 12 a 16 mícrons e monte-as em lâminas de vidro. Em seguida, seque as lâminas colocando-as em uma estufa a 37 graus Celsius. Depois, lave-as três vezes com PBS para remover o OCT residual.

Uma caneta de parafina é usada para criar uma barreira hidrofóbica ao redor da lâmina, e o tampão bloqueador é adicionado à lâmina, impedindo que escorra devido à borda de parafina. Coloque as lâminas em soro normal de cabra a 20% em PBS por uma hora à temperatura ambiente para o bloqueio; em seguida, coloque as seções em anticorpos primários diluídos em PBS com 0,3% de triton e 10% de soro normal de cabra.

Aqui, o anticorpo de coelho anti-PSD 95 é usado para marcar compartimentos pós-sinápticos glutamatérgicos e o anticorpo de porquinho-da-índia anti-VGLUT2 é usado para marcar terminais pré-sinápticos glutamatérgicos. Coloque as lâminas a quatro graus Celsius e incube por 36 a 60 horas após a incubação. Lave o anticorpo primário imergindo as lâminas três vezes em PBS, durante 15 minutos cada.

Após esta etapa, certifique-se de proteger as lâminas da luz direta. Aplique anticorpos secundários diluídos na proporção de um para 200 em PBS com 0,3% de triton e 10% de soro normal de cabra. Neste caso, anticorpo secundário de cabra anti-cobaia.

Alexa 488 e anticorpo secundário de cabra anti coelho. Alexa 594 são utilizados. Incubar por duas horas à temperatura ambiente no escuro.

Lave as lâminas imergindo-as quatro vezes em PBS durante 15 minutos cada para montagem. Adicione pequenas gotas de meio de montagem Vector Shield com DAPI e cubra as lâminas com lamínulas. Aplique esmalte para evitar movimentos das lamínulas.

A imagem de cortes de tecido deve ser realizada usando um microscópio confocal com lasers apropriados e um objetivo de imersão em óleo de 63 vezes para cada imagem de corte, com seções ópticas em série a intervalos de 0,33 mícron ao longo de uma profundidade total de cinco mícrons, perfazendo um total de 15 seções ópticas. Pelo menos três cortes de cada animal devem ser analisados, e pelo menos três animais devem ser incluídos por condição experimental. Gere projeções de intensidade máxima a partir de grupos de três cortes consecutivos, obtendo cinco projeções que representam um mícron de profundidade cada.

Esses são quantificados usando o Image J conforme descrito para RGCs, com uma ROI modificada para determinar o número de sinapses formadas na ausência de astrócitos. A imunoquímica foi realizada em RGCs dissociadas tratadas com meio de crescimento basal, utilizando anticorpos contra bassoon, mostrado em vermelho, e homer, mostrado em verde, conforme esperado. São observados pouquíssimos pontos de colocalização sináptica para determinar o efeito de moléculas secretadas por astrócitos sobre o número de sinapses formadas in vitro; RGCs dissociadas foram tratadas com meio condicionado por astrócitos de camundongo a cada três dias, durante um total de 12 dias, seguindo-se a coloração.

Inúmeras sinapses eram evidentes nesse neurônio, mas logo é mostrado em vermelho. Homer é mostrado em verde em CDRs dissociadas transfectadas com tomate TD expresso no citoplasma, que foram tratadas apenas com crescimento basal. As sinapses médias não são vistas.

O tomate TD é visto em azul e a sinapse é vista em vermelho. Há um sinal muito fraco para o marcador pós-sináptico homer mostrado em verde. Quando as mesmas células são tratadas cronicamente com meio condicionado de astrócitos de rato, muitas sinapses são observadas.

O tomate TD está em azul, a sinapsina em vermelho e a homer em verde aqui. É mostrado um RGC purificado que foi tratado com meio condicionado por astrócitos e corado para pré-sinapse em vermelho e marcadores verdes pós-sinápticos de homer; as máscaras de limiar geradas usando o analisador de pontuações correspondem aos dois canais presentes. Após identificar pontos de colocalização, o analisador de pontuações gera uma representação gráfica desses pontos.

O analisador de pontos fornece uma saída numérica que indica o número de pontos discretos identificados em ambos os canais e nos pontos de colocalização. Os dados produzidos pela análise deste neurônio ilustram a capacidade de moléculas secretadas por astrócitos de promover a formação de sinapses, mostrada aqui como um ensaio de sinapse no qual a colocalização da marcação imunohistoquímica pré e pós-sináptica foi quantificada para demonstrar a potencialização da formação de sinapses induzida por astrócitos por meio da superexpressão do receptor neuronal para a importante molécula sinaptogênica secretada por astrócitos, trombospondina. Apresentado nesta figura está o número médio de sinapses por neurônio tratado cronicamente com meio de crescimento basal, gm, ou com meio condicionado por astrócitos.

A-C-M-A-C-M promove mais fortemente a formação de sinapses em células ganglionares da retina que superexpressam o receptor trombospondina em comparação com células que superexpressam um vetor vazio. Para quantificar a densidade sináptica no colículo superior de camundongos, os compartimentos pré e pós-sinápticos foram rotulados separadamente utilizando marcadores imuno-histoquímicos específicos para cada compartimento. Como mostrado aqui, houve um aumento no número de sinapses do sétimo ao 14º dia pós-natal.

Isso ilustra o aumento no número de sinapses no lobo superior durante esse período de desenvolvimento. Uma vez dominado, este protocolo pode ser concluído em cerca de dois dias para culturas neuronais dissociadas e em aproximadamente cinco dias para seções cerebrais, a partir da coleta do animal após este procedimento. Outros métodos, como eletrofisiologia e microscopia eletrônica, são utilizados para verificar se as alterações no número de sinapses refletem mudanças tanto nas sinapses funcionais quanto nas sinapses ultraestruturalmente normais, respectivamente.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aplicar a imuno-histoquímica em sua preparação experimental para quantificar o número de sinapses. Este protocolo detalha como usar anticorpos específicos para compartimentos a fim de rotular seletivamente os compartimentos pré e pós-sinápticos. Neste contexto, definimos sinapses como pontos de colocalização entre os sinais obtidos a partir de cada um desses marcadores.