Name: Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 11 s
Description: Aprenda a quantificar sinapses em culturas neuronais e secções cerebrais usando imunocitoquímica com marcadores pré e pós-sinápticos. Este método permite análise de alta produtividade para estudos de conectividade sináptica.

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Puncta Analyzer Plug-in para o Image J foi escrito por Barry Wark (endereço atual: Consultoria Physion) no laboratório de Ben A. Barres (Stanford University). Financiamento; <ul><li> Alfred P. Sloan Foundation </li><li> O A. Esther e José Klingenstein Fund, Inc. </li><li> Fundação de Pesquisa Biomédica ampla </li><li> Cura para a Iniciativa de Huntington s Disease </li></ul>

<ol><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.</li>
<li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synapse+number+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li>
<li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li>
<li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+retinotopic+connections%3A+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li>
<li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li>
<li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li>
<li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length%2C+branching+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Moll.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ensaio sinapse descrito acima é baseado no contexto de nossos objetivos experimental, no qual nos concentramos principalmente em projeções excitatórias do RGCs, seja na cultura ou purificada na seção cérebro. Nós fornecemos uma referência anticorpos tabela listando que funcionam bem para rotulagem sinapses excitatórias (Tabela 1). Este ensaio sinapse pode ser adaptado para a quantificação do número sinapse de uma população neuronal ou qualquer outro subtipo sináptico para o qual existe um ...

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Antígeno </td><td> Espécies </td><td> Monoclonais / policlonais </td><td> Vendedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Diluição </td><td> Trabalha em Cultura </td><td> Obras nas Seções </td></tr><tr><td rowspan="10"> Pré-sináptica </td><td> Sinapsina </td><td> Coelho </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 106004 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Sinapsina </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 106001 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagote </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Designs ensaio </td><td> VAM-PS003F </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Fagote </td><td> Cobaia </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 141004 </td><td> 1:1000 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Sinaptotagmina 1 </td><td> Coelho </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 105002 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> Sinaptobrevina 2 (C1.69.1) </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 104211 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Sinaptofisina (C1.7.2) </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 101011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Millipore </td><td> MAB5502 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut1 </td><td> Cobaia </td><td> Policlonal </td><td> Millipore </td><td> AB5905 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> VGlut2 </td><td> Cobaia </td><td> Policlonal </td><td> Millipore </td><td> AB2251 </td><td> 1:2500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td rowspan="6"> Pós-sinápticos </td><td> PSD-95 (6G6 1C9-clone) </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Afinidade Bio Reagentes </td><td> MA1-045 </td><td> 1:750 </td><td> Y </td><td> N </td></tr><tr><td> PSD-95 </td><td> Coelho </td><td> Policlonal </td><td> Zymed </td><td> 51-6900 </td><td> 1:500 </td><td> N </td><td> Y </td></tr><tr><td> Pombo-correio </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 160011 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> ND </td></tr><tr><td> Pombo-correio </td><td> Rato </td><td> Policlonal </td><td> Millipore </td><td> AB5875 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Coelho </td><td> Policlonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 147003 </td><td> 1:500 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr><tr><td> Gephyrin </td><td> Mouse </td><td> Monoclonal </td><td> Sistemas Synaptic </td><td> 147 </td><td> 1:200 </td><td> Y </td><td> Y </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Lista de exemplos de bons marcadores pré-e pós-sinápticos que temos utilizado com sucesso em nosso ensaio sinapse. Estar ciente de que esta não é uma lista exaustiva de todos os marcadores disponíveis. Y = Sim, N = Não, ND = não determinado. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Gato. Não. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 20012-027 </td></tr><tr><td> poli-d-lisina </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Cultrex </td><td> 3400-010-01 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Roche Diagnostics Gmbh </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Soro normal de cabra </td><td> Gibco </td><td> 16210 </td></tr><tr><td> VectaShield com DAPI </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> Outubro </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Tris-Base (50 mM) </td><td> Pescador </td><td> BP152-5 </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> l-lisina </td><td> Sigma </td><td> L-1137 </td></tr><tr><td> 16% de solução PFA </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 15711 </td></tr><tr><td> PFA granular </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 19210 </td></tr><tr><td> 24 poços placa de cultura </td><td> Falcão </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> Anticorpos de cabra anti-camundongo conjugado Alexa </td><td> Invitrogen </td><td> --- </td></tr><tr><td> Fornecimento </td><td> Companhia </td><td> Gato. Não. </td></tr><tr><td> 12mm, n º 0 lamínulas de vidro </td><td> Karl Hecht Gmbh </td><td> 1105209 </td></tr><tr><td> No. 1,5 vidro lamela (para fatias) </td><td> VWR Scientific </td><td> 48393241 </td></tr><tr><td> Lâminas de vidro </td><td> VWR Scientific </td><td> 48311-703 </td></tr></tbody></table>

sinapses quantificar: um ensaio baseado em imunocitoquímica para a quantificação do número synapse

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

Um dos objetivos mais importantes da neurociência é entender os sinais moleculares que instruem estágios iniciais da formação de sinapses. Como tal, tornou-se imperativo para desenvolver abordagens objetivo de quantificar alterações na conectividade sináptica. A partir de fixação da amostra, este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores. O número dessas colocalizations é quantificado através de um plug in puncta Analyzer (escrito por Bary Wark, disponível mediante solicitação, c.eroglu cellbio.duke.edu @), sob a plataforma de software de análise de ImageJ. O ensaio sinapse descritos neste protocolo pode ser aplicado a qualquer preparação de tecidos e cultura neural para o qual você tem seletiva marcadores pré-e pós-sináptica. Este ensaio sinapse é uma ferramenta valiosa que pode ser amplamente utilizada no estudo do desenvolvimento sináptica.

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

Um dos objetivos mais importantes na neurociência é compreender as pistas moleculares que orientam os estágios iniciais da formação da sinapse. Como tal, tornou-se...

Um dos objetivos mais importantes da neurociência é compreender os sinais moleculares que orientam as fases iniciais da formação de sinapses. Por isso, tornou-se essencial desenvolver abordagens objetivas para quantificar alterações na conectividade sináptica. Para quantificar o número de sinapses em diversos preparos experimentais, neurônios cultivados ou cortes crioseccionados de tecido cerebral são corados com marcadores seletivos pré e pós-sinápticos para identificar os pontos de contato sináptico entre neurônios.As células ou o tecido são então imagiados em um microscópio fluorescente, obtendo-se imagens de oito bits para cada um dos canais correspondentes aos dois marcadores imunohistoquímicos. As imagens são analisadas usando o ImageJ 1.29 com o analisador de pontos. Para determinar o grau de colocalização entre marcadores pré e pós-sinápticos, os pontos de colocalização podem ser utilizados para determinar o número de sinapses presentes na preparação.A principal vantagem da técnica descrita aqui em comparação com métodos existentes, como a microscopia eletrônica, é que o ensaio de sinapse permite uma análise e quantificação de alto rendimento do número de sinapses. As princ

quantifying-synapses-an-immunocytochemistry-based-assay-to-quantify

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A abundância de receptores de neurotransmissores nas sinapses cluster influencia fortemente a força sináptica. Este método quantifica receptores de neurotransmissores fluorescente-etiquetados em três dimensões com um único sinapse resolução...

Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Este vídeo demonstra imagens de células vivas da topologia de sinapses imunológicas, investigando as interações entre linfócitos T e células epiteliais que carregam antígenos fluorescentes. A microscopia de fluorescência revela deslocamento do citoplasma vermelho e anéis de membrana amarela nas células endoteliais, indicando a formação de sinapses imunológicas.

Avaliação da topologia imunológica de sinapses por meio de imagens de células vivas

Este vídeo demonstra a coloração por imunofluorescência de uma fatia de cérebro de camundongo para quantificar a distribuição de uma proteína pré-sináptica específica. O processo envolve o bloqueio de locais inespecíficos, a aplicação de anticorpos primários para a proteína-alvo e um marcador de referência, seguido pela marcação de anticorpos secundários e contracoloração nuclear. O marcador de referência garante uma quantificação precisa, fornecendo uma linha de base consistente, e a...

Quantificando a distribuição de uma proteína pré-sináptica no cérebro de camundongos usando imunofluorescência

Fonte: McLeod, F., et al. Avaliação da densidade de sinapses em fatias de cérebro de roedores hipocampais. J. Vis. Exp. (2017). Este vídeo demonstra um método para visualizar marcadores sinápticos em fatias cerebrais do hipocampo usando análise de imunofluorescência confocal. As fatias são imunomarcadas com anticorpos primários direcionados a marcadores pré-sinápticos e pós-sinápticos, seguidos por anticorpos secundários conjugados com fluoróforo. Os marcadores marcados são então visualizados...

Análise microscópica de sinapses em fatias de hipocampo de camundongos usando imunofluorescência

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho completo para a análise qualitativa e quantitativa das sinapses imunes entre primárias células T humanas e células apresentadoras de antígeno. O método baseia-se na imagem citometria de fluxo, que permite a aquisição e a avaliação de várias imagens de milhares de células dentro de um período relativamente curto de tempo.

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

Um protocolo para com precisão, identificando e analisando as sinapses em fatias hippocampal usando a imunofluorescência é descrito neste artigo.

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

Aqui, descrevemos uma abordagem quantitativa para determinar a distribuição de uma proteína sináptica em relação uma proteína de marcador usando a mancha da imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseada em computador.

Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

Este protocolo images a formação imunológica da sinapse e o tráfego polarizado subseqüente do secretry para a sinapse imunológica. Conjugados celulares foram formados entre uma célula Raji com pulso de superantígeno (agindo como uma célula de apresentação de antígeno) e um clone de Jurkat (agindo como um linfocito auxiliar de efetoreto T).

Imagem da Sinapse Imunológica Humana

DetectSyn é um ensaio fluorescente rápido e imparcial que mede mudanças no número de sinapse relativa (engajamento pré e pós-sináptico) entre os estados de tratamento ou doença. Esta técnica utiliza uma técnica de ligadura de proximidade que pode ser usada tanto em neurônios cultivados quanto em tecido fixo.

DetectSyn: um método fluorescente rápido e imparcial para detectar alterações na densidade da sinapse

Aqui apresentamos dois protocolos para quantificar o engolfamento microglial de sinapses positivas para vGLUT1 e sinaptossomos brutos marcados com pHRodo Red usando citometria de fluxo.

Quantificação do engolfamento microglial de material sináptico usando citometria de fluxo

Aprenda a quantificar sinapses em culturas neuronais e secções cerebrais usando imunocitoquímica com marcadores pré e pós-sinápticos. Este método permite análise de alta produtividade para estudos de conectividade sináptica.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

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