Por Quantificação Matérias: Caracterização de fenótipos na Drosophila Larval Junção Neuromuscular

O objetivo geral desta metodologia é mostrar como realizar análises quantitativas de características anatômicas. A quantificação de fenótipos que afetam a morfologia, tamanho e posição dos núcleos com os músculos estriados das larvas de drosófila é demonstrada. Compreender o mecanismo molecular que controla a morfologia, o tamanho e a distribuição das organelas intracelulares é uma das questões mais importantes da biologia moderna.

No passado, as variações morfológicas entre e dentro dos grupos experimentais eram submetidas apenas à análise qualitativa. Aqui propomos, em análise quantitativa, que combina a genética da drosófila com a análise quantitativa morfométrica para identificar genes que controlam o tamanho, a forma e a distribuição dos núcleos dentro dos músculos. Ajudando na demonstração do procedimento estará Leire Ledahawski, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Depois de dissecar e colorir as junções neuromusculares larvais de acordo com o protocolo de texto, use uma pinça para remover as amostras do tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e coloque-as em uma lâmina de processamento. Usando uma tesoura de microdissecação, corte a cabeça e a cauda dos filés e mantenha suas superfícies internas levantadas. Agora, prepare uma lâmina de montagem enrolando três tiras de fita de celulose em torno de uma lâmina limpa, com um centímetro de distância.

Apoie a lamínula sobre esta lacuna fornecida para que não achate as amostras. Em seguida, deposite cerca de 20 microlitros do meio de montagem entre as tiras de fita de celulose e espalhe o meio com uma pinça limpa. Agora remova o tecido extra das preparações.

Arraste as larvas dissecadas da lâmina de processamento para a corrediça de montagem e para o meio de montagem, mantendo a superfície interna para cima. Em seguida, aplique suavemente uma lamínula, tomando cuidado para evitar prender o ar. Em seguida, sele a lâmina com esmalte transparente e deixe a lâmina secar por pelo menos 10 minutos antes de fazer a imagem.

Para esta análise, use imagens confocais exibindo os músculos da parede corporal larval corados com anticorpos DeVAP, anticorpos lamina e um marcador nuclear. Em seguida, arraste e solte as imagens da pilha Z confocal na arena. Clique duas vezes nas imagens para abri-las automaticamente na visualização Superar

A visualização Superar tem três painéis principais de espaço de trabalho. Área de exibição, lista de objetos e área de propriedades do objeto. Em seguida, clique no ícone Visualização 3D para criar uma imagem de três canais renderizada por volume.

Em seguida, selecione Adicionar novos pontos de medição na barra de ferramentas Objetos e siga o Assistente de criação na área Propriedades do objeto. Selecione a guia Editar primeiro e, em seguida, em Canal específico, selecione o marcador nuclear ou o canal de lamina para destacar os núcleos. Em seguida, defina o ponteiro para o modo Selecionar pressionando a guia Escape e, em seguida, ajuste o tamanho da caixa do cursor 3D com a roda do mouse para conter um determinado núcleo na imagem.

Adicione um ponto de medição segurando a tecla Shift e clicando com o botão esquerdo do mouse no mesmo núcleo. Em seguida, adicione o segundo ponto em um núcleo próximo do mesmo músculo usando a mesma técnica. Uma linha será desenhada automaticamente entre os dois pontos e a distância entre os dois núcleos será exibida e registrada como uma variável estatística.

Repita o procedimento para todos os núcleos ao redor de um determinado núcleo. Em seguida, de todos os pontos de medição coletados, encontrados em Dados detalhados de distância das estatísticas, selecione a distância mais curta. Na área Propriedades do objeto, selecione a opção Exportar estatísticas com exibição de guia para arquivo disponível.

Isso salva os dados em uma planilha. Para esta análise, use imagens confocais dos músculos da parede corporal corados com lamina e um marcador nuclear para visualizar os núcleos. Para avaliar a forma dos mionúcleos, meça sua esfericidade, que compara a área da superfície nuclear com a de uma esfera com o mesmo volume.

Em alternativa, meça a elipticidade que distingue prolatos, oblatos ou elipsóides e esferoides. Abra a imagem conforme descrito anteriormente. Em seguida, clique no ícone da barra de ferramentas Objetos Adicionar novas superfícies.

No Assistente de criação que aparece na área Propriedades do objeto, selecione a coloração do marcador nuclear como o canal de origem para exibir os núcleos. Defina a opção Intensidade absoluta como o limite. Certifique-se de que a maioria dos núcleos mostre uma renderização suave e não sobrecarregada, alterando o valor na curva de limite.

Ao mesmo tempo, evite a presença de orifícios ou máscaras incompletas de quaisquer núcleos. Em seguida, use a ferramenta Filtro para remover o ruído da renderização da superfície. Na guia Editar da camada de superfície recém-criada, divida as superfícies de núcleo que são renderizadas incorretamente.

Outra opção é mesclar as superfícies de núcleos que são renderizadas incorretamente. Os valores de elipticidade e esfericidade dos núcleos renderizados da superfície estão disponíveis na guia Estatísticas. Exporte esses dados para análise.

Para este protocolo, use imagens confocais relatando músculos da parede corporal corados com um marcador nuclear e com anticorpos específicos para lamina e DeVAP. Abra a imagem de interesse no item do Menu Principal Editar e depois Cortar 3D. Siga o Assistente de criação de superfície usando o canal lamina, conforme descrito na seção anterior.

Depois que a superfície for criada, clique em Editar na área Propriedades dos objetos e selecione Mascarar tudo para isolar um sinal dentro do núcleo. Em seguida, selecione o sinal DeVAP. No menu suspenso Selecionar canal, clique na opção Definir voxels fora da superfície e torne esse valor zero.

Isso cria um novo canal mascarado disponível na janela Ajuste de exibição. Para visualizar a presença de sinal dentro do núcleo, crie um plano de contorno clicando no ícone Adicionar novo plano de recorte na barra de ferramentas Objetos. Em seguida, ajuste interativamente o ângulo do plano de recorte e sua posição para visualizar a distribuição do sinal dentro do núcleo.

Mutações missense na proteína B associada à VAMP humana estão implicadas na patogênese da ELA. Usando o método descrito, os músculos estriados que expressam o gene do ortólogo da mosca DeVAP que abriga a mutação V2601 causadora da ALS foram comparados aos controles, expressando níveis comparáveis de DeVAP do tipo selvagem ou níveis mais altos de DeVAP do tipo selvagem. A análise do vizinho mais próximo foi usada para avaliar a distribuição dos núcleos ao longo das fibras musculares.

Em comparação com os músculos de controle que expressam o transgene DeVAP mutado, ou aqueles que expressam a proteína do tipo selvagem, a mutação de interesse causou uma redução dramática na distância média mais curta entre os núcleos. Em seguida, a esfericidade dos núcleos foi examinada. Verificou-se que os transgenes que reduziram o espaçamento dos núcleos também aumentaram o volume dos núcleos.

Reconstruções 3D e renderizações de volume dos núcleos revelaram que os músculos que expressam a mutação de interesse formam aglomerados que foram localizados nos núcleos. Este método também pode ser estendido para a análise quantitativa de características morfológicas associadas a outras organelas, como as mitocôndrias. Mudanças na arquitetura, posição e tamanho nuclear têm sido associadas ao envelhecimento e a uma série de distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Parkinson e a ELA.

Compreender os mecanismos moleculares subjacentes à dispráxis pode levar à identificação de novos alvos farmacológicos para intervenções terapêuticas eficazes.