Подготовка фиксированных drosophila Oocytes для иммуностиминга: метод высокой пропускной способности для исправления и удаления внешней мембраны

- Начните с пульсирующей анестезии Drosophila вместе с буфером в блендере, чтобы разбить мух на мелкие кусочки. Фильтр смеси через сетку, чтобы удалить большие части тела. Затем, дайте яйцам утонуть в то время как большие фрагменты остаются на поверхности и могут быть удалены.

Повторите этот процесс с помощью меньшей сетки для удаления дополнительного мусора. Соберите яйца во флаконе, и если яйца должны быть обработаны препаратом, сделайте это в этой точке. Далее, удалите жидкость и замените ее фиксатором.

Затем смойте фиксатор с PBS. Чтобы испачкать яйцеклетки, удалите защитные внешние мембраны, чтобы обеспечить проникновение антител. Pipette oocytes на матовую часть стеклянной горки. Поместите крышку над яйцами и аккуратно свернуть крышку в спину и вперед движение механически отделить хорион и вителлин мембраны от яйцеклетки.

В примере протокола мы будем готовить яйцеклетки при мейозе I для окрашивания и визуализации шпиндельного аппарата.

- Для начала, precut внутри 5-миллилитровой трубки и Пастер пипетки с ПТБ, чтобы предотвратить oocytes прилипания к поверхностям. Добавить 100 миллилитров буфера Роба в блендер, а затем добавить от 100 до 300 анестезированных мух и пульс три раза в течение одной секунды.

Фильтр в результате суспензии в 250-миллилитровый стакан через большую сетку с порами около 1500 микрометров. Пусть фильтруйте поселиться в течение примерно двух минут, а затем аспирировать верхний слой, удаляя как можно больше больших частей тела, как это возможно. Фильтр суспензии снова в 250-миллилитровый стакан через меньшую сетку с поры размером 300 микрометров.

Промыть первый стакан с помощью дополнительного буфера в покрытием пипетки для сбора оставшихся яйцеклеток. Пусть суспензии поселиться в течение трех минут, а затем аспирировать все, кроме нижней 10 миллилитров. Налейте как можно больше из 10 миллилитров, как это возможно в покрытием 5-миллилитровую трубку. Пусть суспензии урегулировать около двух минут, а затем тщательно удалить жидкость.

Добавить оставшуюся часть 10 миллилитров суспензии и дайте смеси осесть еще раз, прежде чем удалить жидкость. Промыть все оставшиеся яйцеклетки из стакана с помощью дополнительного буфера в покрытием пипетки. Пусть промыть поселиться в 5-миллилитровой трубки в течение трех-пяти минут.

Чтобы исправить яичники, во-первых, аспирировать всю жидкость из тканей, и сразу же добавить 1 миллилитр исправить смесь. Поместите ткани на nutator в течение двух с половиной минут. Далее, добавить 1 миллилитр гептана, вихрь трубки в течение одной минуты, а затем позволить яйцеклетки поселиться еще на минуту.

Удалить всю жидкость из оседлой ткани, затем добавить 1 миллилитр 1x PBS. Vortex трубки в течение 30 секунд, а затем позволить яйцеклетки, чтобы поселиться в течение одной минуты. После этого, удалить всю жидкость из трубки и заполнить его с пятью миллилитров 1x PBS.

Используя трубу с покрытием, добавьте примерно от 500 до 1000 яйцеклеток в матовое стекло слайд. Удалить любые посторонние части тела или материала с помощью щипцы. Поместите крышку на верхней части ткани, и осторожно ролл ооцитов, пока все мембраны удаляются. Dragging края крышки через oocytes работает хорошо.