Слой Агар Монтаж: Подготовка живых эмбрионов зебры для долгосрочной визуализации с перевернутым микроскопом

- Начните с чашки Петри, содержащей эмбрионы в E3 medium. Добавьте трикаин для обезболивания эмбрионов и фенилтиурии, раствора ПТУ, чтобы ингибировать образование пигмента.

Используйте стеклянную пипетку, чтобы перенести один из обеченных эмбрионов в небольшую чашку Петри с неглубоким стеклянным дном хорошо в центре и удалить избыток среды. Далее, поместите раствор агарозы в оптимальную концентрацию, чтобы свести к минимуму искажение и подвижность эмбриона в трубку микрофуга и нагреть его.

Налейте первый слой агарозы над эмбрионом, полностью заполнив мелководный колодец. Поместите еще один стакан крышки над колодец и добавьте 1% агарозы поверх этого.

Как только агароза затвердеет, заполните чашку Петри средой E3, содержащей трикаин. Это третий слой и сохраняет агарозу и эмбрион гидратированных. В следующем протоколе, мы будем выполнять слоистых агар монтаж эмбрионов зебры для длительного промежутка времени изображения.

- Незадолго до монтажа нагрейте раствор агарозы до 65 градусов по Цельсию, а затем дайте ему остыть примерно до 30 градусов по Цельсию, чтобы эмбрион не пострадал от жары и добавить трикаин в раствор агарозы. Используйте 35-миллиметровые стеклянные нижние блюда с нулевым количеством покрытого стеклянным дном. Аккуратно поместите дехорионированный эмбрион с одной из боковых сторон к нижней части блюда стеклянной пипеткой или микропипетом. Затем аккуратно удалите оставшийся E3 с помощью микропипетта.

добавлять тем первый агароза решение Кому тем маленький колодец созданный около тем крышка стекло прикомандированный Кому тем дно из тем блюдо Кому крышка тем эмбрион изготовление уверенный тот тем агароза Охватывает тем маленький колодец но делает не переполнение оно. крышка тем маленький колодец ивовый прут тем крышка стекло Кому создавать ля узкий агароза заполненные пространство ивовый прут тем эмбрион между тем Два крышка очки. место ля слой из 1% агароза решение на Вверх из тем крышка стекло все над тем дно из тем блюдо который воля хранить тем крышка стекло в место как оно Затвердевает. тогда заполнять тем остальной часть из тем блюдо ивовый прут E3 Содержащий 0.02% tricaine Кому хранить тем система гидратированный. Кому отождествлять тем оптимальный агароза концентрация для слой Один монтировать тем Эмбрионов в возрастающий Концентрации из агароза и выполнять таймлапс отображение Кому отождествлять тем концентрация тот Минимизирует эмбрион искажение и подвижность тогда тест ля Тоньше диапазон из Концентрации основывающийся на тем Результаты.

- Наиболее важным шагом этого протокола является определение оптимальной концентрации агарозы для слоя один. Тест различных нано концентраций агарозы, таких как 0,030%, 0,032%, и так далее, чтобы найти оптимальную концентрацию.