Name: A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-17T16:04:00.000+00:00
Duration: 21 min 1 s
Description: Aprenda a criar embriões quiméricos de zebrafish por transplante em estágio de blástula ou gástrula. Esta técnica permite estudar a função gênica durante o desenvolvimento vertebrado.

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Graças aos membros do laboratório para a entrada Moens útil durante a escrita deste artigo. HK é pós-doutorado apoiado pelo NIH / NICHD conceder # 5R01HD037909-08. CBM é um investigador com o Howard Hughes Medical Institute.

<ol><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+and+developmental+potential+of+cells+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo.</a> Trends Genet. 4, 68-74 (1988).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ-cell+development%3A+the+zebrafish+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective.</a> Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124, 3157-3165 (1997).</li>
<li>Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+nanos-related+gene+is+essential+for+the+development+of+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells.</a> Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).</li>
<li>Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tissues+and+patterning+events+required+for+distinct+steps+in+early+migration+of+zebrafish+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells.</a> Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).</li>
<li>Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+by+attraction+towards+an+intermediate+target%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target.</a> Development. 129 (1), 25-36 (2002).</li>
<li>Ciruna, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germ-line+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).</li>
<li>Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+zebrafish+pbx+proteins+reveals+a+hindbrain+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state.</a> Dev Cell. 3, 723-733 (2002).</li>
<li>Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dead+end%2C+a+novel+vertebrate+germ+plasm+component%2C+is+required+for+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival.</a> Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).</li>
<li>Blaser, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+non-motile+behaviour+to+directed+migration+during+early+PGC+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish.</a> J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).</li>
</ol>

A facilidade com que o transplante pode ser usado para produzir quimeras alvo é uma das grandes potências do zebrafish como modelo vertebrados. A modificação do presente protocolo não descrito acima permite a análise da função dos genes maternos para a genes com funções essenciais no desenvolvimento zigóticos. Uma vez que estes peixes mutantes não podem sobreviver até a idade adulta, é necessário transferir a linha germinativa mutante em um embrião hospedeiro contrário do tipo selvagem, a criação de &quot;clones da linh...

Reagentes: Receitas para muitos dos reagentes utilizados para estes procedimentos são encontradas em O Livro Zebrafish, que está disponível em on-line completo em <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> . As receitas são, desde que haja para a preparação de peixes de água, Médio Embrião com e sem antibióticos, pronase para dechorionating, dextranos fluorescentes e metil-celulose.

a criação de embriões quiméricos zebrafish por transplante

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

Uma das mais poderosas ferramentas utilizadas para obter insights sobre os complexos processos de desenvolvimento é a análise de embriões quiméricos. Uma quimera é definida como um organismo que contém células de mais de um animal; mosaicos são um tipo de quimera em que as células de mais de um genótipo são misturados, geralmente do tipo selvagem e mutante. No peixe-zebra, quimeras podem ser facilmente feitas por transplante de células de um embrião de doador em um embrião hospedeiro no estágio apropriado embrionárias. Células do doador rotulados são geradas pela injeção de um marcador de linhagem, tal como um corante fluorescente, no embrião estágio de uma célula. Células do doador rotulados são removidos a partir de embriões de doadores e introduzidas em embriões de anfitrião unlabeled usando um óleo controlado pipeta de vidro montada em cada um composto ou um microscópio de dissecação. Células do doador pode, em alguns casos, ser direcionados a uma região específica ou tecido do embrião hospedeiro desenvolvimento blástula ou gástrula palco por escolher um site de transplante no embrião host com base em mapas bem estabelecida destino.

Um guia passo-a-passo para a geração de embriões alvo zebrafish quimérico de transplante em fase de blástula ou gástrula.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

Uma das ferramentas mais poderosas utilizadas para obter insights sobre processos complexos de desenvolvimento é a análise de embriões quiméricos. Uma quimera é definida como um...

Olá, sou Hillary Kemp do Laboratório de Cecilia Owens. E eu sou Cecilia Owens. Hillary e eu estamos na divisão de ciências básicas do Centro de Pesquisa sobre Câncer Fred Hutchinson, em Seattle.Hoje vamos mostrar uma técnica para produzir embriões de peixe-zebra quiméricos, também conhecidos como mosaicos genéticos. Este procedimento permite avaliar a base celular da função gênica durante o desenvolvimento. Podemos investigar se um determinado gene exerce sua função dentro das células com fenótipo mutante, denominada função autônoma celular, ou no ambiente dessas células, denominada não autonomia celular.Nós produzimos esses mosaicos transplantando células entre embriões selvagens ou mutantes em estágio de blástula ou início de gástrula. Posteriormente, avaliamos a função gênica observando o fenótipo e o genótipo de células derivadas do doador no ambiente do hospedeiro. Então, vamos começar.Nesta parte do protocolo, um corante de linhagem é injetado no embrião doador para que os destinos das células derivadas do doador possam ser acompanhados após o transplante. Qualquer variedade de ácidos nucleicos também pode ser injetada usando esta técnica; no entanto, omita a etapa de decoraç

generating-chimeric-zebrafish-embryos-by-transplantation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zebrafish transplante de células permite a combinação de genética e da embriologia para gerar quimeras tecidos específicos. Este vídeo demonstra gástrula encenado transplantes de células que têm permitido o nosso laboratório para investigar o papel das populações astroglial e pistas de orientação específica durante a formação da comissura no prosencéfalo.

Tecido alvo quimeras embrionárias: Zebrafish celular Gástrula Transplante

Demonstramos um protocolo para gerar embriões quiméricos zebrafish para o comportamento imagens ao vivo do celular durante a embriogênese.

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Devido ao córion duro e macio embriões, manipulação de embriões medaka está mais envolvido do que em zebrafish. Este vídeo mostra passo-a-passo os procedimentos de como manipular embriões medaka, incluindo dechorionation, montagem em agarose para a imagem latente e transplante de células para a produção de quimeras. Estes procedimentos são essenciais para a utilização medaka zebrafish e em um laboratório para tirar o máximo proveito de seus recursos complementares para a análise genética de...

Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

Este protocolo fornece instruções passo a passo sobre como gerar embriões de peixe-zebra parabióticos de diferentes origens genéticas. Quando combinado com os recursos de imagem incomparáveis do embrião de peixe-zebra, esse método fornece um meio excepcionalmente poderoso para investigar funções autônomas e não autônomas de células para genes candidatos de interesse.

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

acompanhamento ao vivo de células progenitoras da retina WT individuais em fundos genéticos distintos permite a avaliação da contribuição das células de sinalização não autónomo durante a neurogênese. Aqui, uma combinação de silenciamento de genes, através de transplante de geração quimera embrião e na imagiologia de lapso de tempo in vivo confocal foi utilizada para este propósito.

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

Aqui, mostramos o processo de criação de uma linha de zebrafish do repórter de tensão elétrica celular para visualizar o desenvolvimento embrionário, movimento, e células de tumor de peixe em vivo.

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Manipulações embriológicas como extirpação e transplante de células são ferramentas importantes para estudar o desenvolvimento precoce. Este protocolo descreve um dispositivo de transplante simples e eficaz para realizar essas manipulações em embriões de zebrafish.

Um dispositivo de transplante simples e eficaz para embriões de zebrafish

Aqui apresentamos um protocolo para transplantar células com alta resolução espacial e temporal em embriões e larvas de peixe-zebra em qualquer estágio entre pelo menos 1 e 7 dias após a fertilização.

Transplante de células de alta resolução em peixe-zebra embrionário e larval

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Microinjeção é um método bem estabelecido e eficaz para a introdução de substâncias estranhas em embriões de peixe-zebra fertilizado. Aqui, nós demonstramos uma técnica de microinjeção robusta para a realização de superexpressão do mRNA, e oligonucleotídeos morfolino estudos gene knockdown no zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

Aprenda a criar embriões quiméricos de zebrafish por transplante em estágio de blástula ou gástrula. Esta técnica permite estudar a função gênica durante o desenvolvimento vertebrado.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

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