A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

Olá, sou Hillary Kemp, do Laboratório de Cecilia Owens. E eu sou Cecilia Owens. Hillary e eu estamos na divisão de ciência básica do Centro de Pesquisa do Câncer Fred Hutchinson, em Seattle.

Hoje vamos mostrar a vocês uma técnica para fazer embriões quiméricos de peixe-zebra, também conhecidos como mosaicos genéticos. Este procedimento nos permite avaliar a base celular da função gênica durante o desenvolvimento. Podemos perguntar se um determinado gene funciona dentro das células com um fenótipo mutante conhecido como função autônoma celular, ou dentro desse ambiente celular conhecido como não autonomia celular.

Fazemos esses mosaicos transplantando células entre embriões mutantes do tipo selvagem em uma blástula ou estágio gastro inicial. Posteriormente, avaliamos a função gênica observando o fenótipo e o genótipo das células derivadas do doador em seu ambiente hospedeiro. Então vamos começar.

Nesta parte do protocolo, um corante de linhagem é injetado no embrião do doador para que o destino das células derivadas do doador possa ser seguido após o transplante. Qualquer variedade de ácidos nucléicos também pode ser injetada usando esta técnica, no entanto, omita a etapa de decoração ao injetar DNA antes de trabalhar com os embriões, prepare uma placa de injeção inserindo uma lâmina de vidro em um ângulo de 45 graus na parte mais larga de uma placa de Petri. Três quartos cheios de 1,2% de aros em meio embrionário estreptocócico em caneta.

Remova o slide após o agro endurecer para fazer uma calha chanfrada. Encha o cocho com meio embrionário estreptocócico de caneta. Agora prossiga com a decoração enzimática de embriões em estágio de uma célula.

Incube os embriões no estágio de uma célula por um a cinco minutos em 0,5 miligrama por mililitro. Solução Pronase. Monitore a decoração de perto.

Assim que o córion começar a entrar em colapso visivelmente, mergulhe os embriões na água do sistema E isso está derramando todo o cório e os embriões ficam para trás na parte inferior da curva do bico. E é muito importante que os embriões não atinjam a superfície da água apenas mais uma vez, e a maioria deles está com o córion desligado. Há alguns girando do lado de fora que não.

Se alguma coisa ainda estiver em seu córion, o ato de pipetá-los assim os tirará e liberará os embriões para que nunca atinjam a superfície da água. É importante manusear embriões revestidos com uma pipeta polida para alisar suas bordas. Transferir suavemente os frágeis embriões revestidos com dec para a calha da placa de injecção, utilizando uma pipeta de vidro polido a fogo de calibre largo.

E então estamos carregando um único arquivo neste cocho. Agora os embriões estão prontos para serem injetados com marcador de linhagem usando um fogo calibrado com precisão, pipeta de injeção de vidro puxado e um equipamento de injeção de pressão. Vamos usar um prato cheio de meio embrionário para quebrar a agulha e um prato cheio de óleo para calibrar a agulha.

Este é apenas um óleo mineral de grau de laboratório padrão regular. Pegamos um par de pinças de relojoeiro afiadas e, em seguida, enquanto olhamos pelas oculares para determinar qual seria o tamanho certo, colocamos a pinça em ambos os lados da agulha e, em seguida, quebramos suavemente o chip, o que eu não posso fazer sem olhar para determinar o volume de corante ou ribonucleotídeo que está sendo entregue. Antes de começar.

Meça o tamanho do bolo alimentar em um prato de óleo mineral. A agulha deve ser quebrada para que um bolus de um nanolitro seja fornecido com um ou dois pulsos do microinjetor. O volume do bolo pode ser calculado a partir de seu diâmetro medido por um micrômetro ocular.

Injete um nanolitro de uma a 3% de solução de dextrano fluorescente diretamente no ylk de embriões revestidos entre os estágios de uma e quatro células. O que vou fazer é posicionar o embrião logo abaixo da agulha. Vou espetar a agulha suavemente no centro da gema e pressionar o pedal.

Uma vez injetado, É importante injetar nos fluxos de gema para que o corante seja transportado para as células. Esta injeção será suficiente para rastrear células em embriões quiméricos por vários dias de desenvolvimento. Idealmente, fazemos isso antes que as células atinjam o estágio de quatro células, Levante os embriões injetados em baixa densidade em uma placa de Petri revestida cheia de embriões estreptocócicos de caneta frescos. Média.

Observe que os embriões injetados tendem a ter uma taxa de desenvolvimento ligeiramente lenta, incube embriões em diferentes temperaturas, 25, 28 e 31 graus Celsius para escalonar seu desenvolvimento e maximizar a janela de tempo durante a qual os transplantes podem ser realizados. O aparelho utilizado para transplante de células na blástula do peixe-zebra consiste em uma seringa de Hamilton controlada por acionamento presa por uma torneira de parada de três vias a um reservatório de óleo mineral e a um porta-micropipeta através de um comprimento de tubo flexível. Elimine todas as bolhas de ar do sistema, pois elas arruinarão sua capacidade de controlar a sucção e a pressão.

Use um microscópio estéreo que tenha óptica de alta qualidade de pelo menos uma ampliação DX. Para controlar o posicionamento do porta-micropipeta e da agulha, sugerimos um micromanipulador manual NARA shige. Certifique-se de que ele esteja fixado à bancada usando uma base magnética para evitar que as vibrações sejam transferidas para o transplante.

As agulhas de transplante de agulha são feitas de pipetas capilares de vidro que são atraídas para um cone suave em um eletrodo polar. Consulte o protocolo JoVE do laboratório de Miriam Goodman para obter detalhes sobre como puxar pipetas sob um microscópio de dissecação, quebrar a ponta da agulha puxada. Para transplantes em estágio de blástula, o diâmetro externo da agulha deve medir aproximadamente 50 a 60 mícrons ou 30 a 40 mícrons para uma transferência de estágio gastro.

Para uma transferência de estágio gastro para melhorar a penetração, uma farpa afiada precisa ser puxada na ponta da agulha usando uma micro forragem primeiro, alise a ponta da agulha aproximando-a do filamento da micro forja. Em seguida, gire a agulha para que a borda dianteira do chanfro possa entrar em contato com o filamento. Assim que a ponta da agulha entrar em contato com o filamento, puxe-a rapidamente para criar uma farpa.

Para evitar danificar as células, a farpa deve ser reta e a ponta da agulha não deve se curvar Com o equipamento e as agulhas de transplante preparados, você está pronto para fazer embriões quiméricos. Os transplantes de blástula são usados para transplantar células entre embriões quando as informações do mapa de destino fino não são necessárias. Com exceção das células germinativas primordiais, a maioria das células geralmente não está comprometida com um destino neste estágio.

O mapa de destino da blástula é tal que podemos distinguir entre as células que vão dar origem ao ectoderma e as células que vão dar origem ao mesoderma. O mesodérmico e o endodérmico ficam próximos à margem do embrião em estágio de blástula, enquanto os progenitores dérmicos, que darão origem ao sistema nervoso e à derme superficial, ficam mais distantes da margem do embrião. Então, quando transplantamos células em embriões em estágio de blástula, podemos direcionar essas células para o mesoderma presuntivo ou para o ectoderma presuntivo.

Mas não podemos direcionar as células para nenhuma região específica do ectoderma ou do mesoderma porque não sabemos. No estágio de blástula, onde está o lado dorsal do embrião, Prepare as placas de injeção com antecedência, flutuando um molde de plástico com fileiras emparelhadas de saliências em forma de cunha em uma placa de Petri, meio preenchido com 1,2% de aros fundido em meio embrionário. Assim que o aros se solidificar, remova o molde deixando fileiras de poços triangulares, cada um grande o suficiente para conter um embrião.

Encha o molde de transplante com meio de embrião estreptocócico em caneta e carregue os embriões em estágio de blástula individualmente em cada poço com uma pipeta de vidro polido a fogo. Agora transfira os embriões para os poços de transplante e permita que eles fiquem de lado. Organize os embriões de forma que os embriões doadores sejam colocados em uma coluna e os embriões hospedeiros sejam colocados na coluna adjacente.

Posicione o prato no palco de modo que, quando a agulha de transplante entrar em um embrião, a agulha empurre o embrião contra a parede posterior de seu poço. Usando o micromanipulador, abaixe a agulha de transplante no prato em um ângulo bastante acentuado. Idealmente, a agulha de transplante deve entrar no embrião em um ângulo de aproximadamente 45 graus.

Uma vez que a ponta da agulha esteja abaixo da superfície do meio embrionário, puxe uma pequena quantidade de meio embrionário para dentro da agulha girando o acionamento do micrômetro que controla a seringa Hamilton. Para um controle mais preciso, a interface entre o óleo mineral e o meio embrionário deve permanecer na parte fina e cônica da agulha, não muito perto do final. Posicione suavemente o embrião doador com a agulha e, em seguida, puxe a agulha para trás e entre na capa da blástula do embrião na posição desejada.

Um golpe rápido penetrará no embrião sem fazê-lo rolar. Puxe as células do doador lenta e cuidadosamente para dentro da agulha para evitar o cisalhamento das células. Evite levar gema para a agulha depois que o número desejado de células for absorvido.

Inverta ligeiramente a pressão para interromper a sucção e remova a agulha do embrião hospedeiro para a posição. Ao mover a placa de transplante, pequenos ajustes na posição do embrião hospedeiro podem ser feitos girando-o suavemente usando a agulha de transplante, desde que seja tomado cuidado para não tocar na gema. Ao expelir as células do doador para o embrião hospedeiro, evite levar ylk para o embrião, pois isso danificará e matará as células do doador de um único embrião de doador que pode ser transplantado para vários hospedeiros após a conclusão das transferências de células.

Transfira os pares de hospedeiros doadores para os poços revestidos de uma placa de 24 poços para continuar o desenvolvimento. A única exceção à regra de que as células não estão comprometidas com destinos específicos no estágio de blástula são as células germinativas primordiais. As células germinativas primordiais são especificadas muito cedo no desenvolvimento e estão comprometidas com seu destino de estado de célula germinativa primordial.

Desde um estágio muito inicial, as células germinativas primordiais ficam perto da margem de uma blástula e de um embrião em estágio gast. Portanto, se o objetivo do experimento de transplante é transplantar células germinativas primordiais, então é muito importante de onde as células vêm no embrião do doador e não é importante para onde elas vão para o embrião hospedeiro. Portanto, a regra é que, para as células somáticas, é importante para onde elas vão no embrião hospedeiro que determinará seu destino.

Onde, no caso das células germinativas primordiais, é importante de onde elas vêm no embrião do doador, porque seu destino já está determinado. Se o objetivo é transplantar células germinativas primordiais, então isso, as células precisam ser retiradas da margem da esperança do embrião doador, e elas estão situadas bem perto da margem do embrião em quatro pequenos aglomerados de cada uma das três ou quatro células nesta folha, este estágio de lança ou alto estágio de desenvolvimento. E você tem que pegá-los com muito cuidado para não começar a sugar acidentalmente a gema.

Ok, e foi isso que fiz lá, e agora estou mudando para um embrião hospedeiro. Agora, as células germinativas primordiais se concentram na região da crista genital de qualquer embrião em que estejam. Portanto, não há necessidade de transplantar essas células germinativas primordiais para a margem, elas mesmas chegarão lá.

Então, estou apenas transplantando-os, colocando-os de volta em qualquer lugar antigo para o pós-embrião. A chave para transplantes de células germinativas, que é exatamente o oposto de qualquer outro tipo de transplante, é que importa de onde vêm as células do doador. O transplante de células para um hospedeiro em estágio gastro permite que o experimentador aproveite o mapa de destino do peixe-zebra que surge quando o escudo embrionário se torna visível.

Torna-se possível distinguir diferentes tipos de tecido, bem como os domínios dentro do sistema nervoso central presuntivo. Ao transferir células entre embriões no estágio de lista gastro, existem algumas variações no protocolo, mas o procedimento geral é semelhante ao trabalho com blastos para montar gastros. Primeiro esfregue uma faixa vertical de metilcelulose na depressão de uma lâmina de depressão de vidro e, em seguida, inunde com uma quantidade generosa de meio de embrião estreptocócico usando uma transferência de pipeta polida a fogo.

Um doador e três hospedeiros do estágio de escudo para o slide de depressão. Selecione embriões de doadores que sejam ligeiramente mais jovens que os hospedeiros. Uma nova ferramenta é necessária para manipular a cola gastros, as extremidades de um comprimento curto de linha de pesca de teste de duas libras na extremidade de um tubo capilar.

Fazendo assim um pequeno laço. Use o laço para rolar suavemente os embriões do doador e do hospedeiro no topo da tira de metilcelulose e coloque-os na metilcelulose até ficarem firmes. Role-os na posição de forma que a região alvo fique mais alta.

Já durante o transplante, a agulha entrará no embrião tangencialmente para entregar as células do doador sem danificar o ylk. Os transplantes de estágio gastro são melhor realizados em um microscópio composto de estágio fixo. Use os controles do micromanipulador para colocar a ponta da agulha de transplante em foco.

Posicione o porta-micropipeta e a agulha em um ângulo bastante raso para que a agulha fique o mais próximo possível da horizontal Em seguida, perfure o embrião do doador. Se for montado corretamente, não rolará quando a agulha de transplante entrar, a menos que o embrião seja muito velho para permitir que a agulha penetre facilmente.

Para evitar perfurar o ylk, a agulha deve entrar no embrião em um plano focal ligeiramente mais profundo que o do EDL. Uma vez perfurado, um grande número de células pode ser removido do doador para até três injeções de células hospedeiras. Ao extrair células, evite sugar a gema movendo a agulha à medida que as células são recolhidas, se desejar.

Embriões adicionais podem ser colhidos para mais células usando a mesma agulha antes de ejetar as células para o hospedeiro, durante a ejeção celular para o embrião hospedeiro, expulse as células enquanto a agulha está sendo puxada através da área alvo, em vez de depositar as células em um único aglomerado. Isso aumentará a probabilidade de que as células do doador contribuam para o tecido desejado. Assim que as transferências de células forem concluídas, coloque a lâmina inteira em uma placa de Petri e inunde-a cuidadosamente com embrião estreptocócico em caneta. Média.

Nas próximas horas, a metilcelulose se dissolverá liberando os embriões. O número de células transferidas depende do objetivo específico do experimento. As células de um único doador podem ser transplantadas para três ou quatro hospedeiros na manhã seguinte ao transplante.

Os hospedeiros podem ser examinados para determinar se o direcionamento de células doadoras foi bem-sucedido. O transplante bem-sucedido de células germinativas primordiais da idade da blástula resulta em células marcadas com fluorescência, posicionadas ventralmente perto da junção entre o ylk e a extensão do ylk. Então, acabamos de mostrar como fazer transplantes de gástrula e blástula.

Ao fazer essa técnica, é importante escolher o tipo certo de método de transplante para o tecido-alvo que você espera atingir com suas células. Portanto, o transplante em estágio de blástula é suficiente para determinar as células que vão para a derme versus o ectoderma. E você também pode usar essa técnica para atingir células germinativas primordiais.

Se você quiser fazer um mapeamento mais preciso, é melhor usar um transplante de idade gastrostática onde o lado dorsal já foi determinado. E assim, com essa técnica, você pode direcionar células para várias partes do sistema nervoso, em particular, o prosencéfalo, o mesencéfalo, o cérebro posterior e a medula espinhal. Então é isso.

Muito obrigado por assistir e boa sorte com todos os seus experimentos.