Generierung von primärer Mammosphären: Eine Technik zur Bestimmung der Zellpotenz

Overview

Dieses Video beschreibt die Isolierung von Krebsstammzellen aus Brustkrebszelllinien. Wir kultiermitteln diese Krebsstammzellen, um primäre Mammosphären zur Beurteilung der Selbsterneuerung und zur Berechnung der kugelbildenden Effizienz zu erzeugen, was einen Vergleich über verschiedene Sädichten ermöglicht.

Protocol

1. Erzeugung von primären Mammosphären aus menschlichen Brustkrebszelllinien

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte unter einer sterilen Kulturhaube aus.

1. Bereiten Sie Mammosphere Media mit DMEM/F12 vor, ergänzt durch 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin. Bereiten Sie komplette Medien unmittelbar vor der Verwendung durch Zugabe von 20 ng/ml rekombinanten humanen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF; Sigma), 10 ng/ml rekombinanter menschlicher Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF; F&E-Systeme) und 1x B27 Ergänzung.
2. Aspirieren Sie Medien aus Kolben, die anhaftende MCF-7- oder MDA-MB-231-Zellen enthalten (oder eine Brustkrebszelllinie Ihrer Wahl; 70-80% Zusammenfluss), zweimal in 1x PBS waschen und Zellen trypsinisieren.
3. Zentrifugenzellen bei 200 x g bei Raumtemperatur für 5 min. Dekantieren überstand und resuspendieren Zellen in 1-5 ml Mammosphäremedien. Pipette nach oben und unten und bei Bedarf mit einem 40-m-Zell-Siebkappenfilter zur Einzelzellsuspension. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um sicherzustellen, dass sich eine Einzelzellsuspension gebildet hat (falls nicht, verwenden Sie eine 25 G Nadel, um die Zellsuspension bis zu 3 Mal zu spritzen).
4. Bei Bedarf isolieren CD44+CD24- zelluläre Teilmenge über FACS mit Anti-CD24-Phycoerythrin (PE) und Anti-CD44-Fluorescein Isothiocyanat (FITC) monoklonale Antikörper⁹. Alternativ können Sie eine solche Population mit einem magnetisch aktivierten Zellsortiersystem (MACS) mit Anti-CD44 und Anti-CD24-Biotin kombiniertmikrobeads gemäß herstellerspezifischen Anweisungen isolieren. Führen Sie eine positive Auswahl mithilfe von LS-Spalten und eine negative Auswahl mithilfe von LD-Spalten durch, und bestätigen Sie die Phänotypen aller isolierten Zellen durch Durchflusszytometrie.
5. Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml mit Trypan blau.
   HINWEIS: Die Zelllebensfähigkeit wird als Anzahl lebensfähiger Zellen dividiert durch die Gesamtzahl der Zellen innerhalb der Gitter gitter auf dem Hämozytometer berechnet. Zellen, die Trypanblau aufnehmen, gelten als nicht lebensfähig. Das folgende Verfahren wird verwendet, um den Anteil lebensfähiger Zellen genau zu bestimmen.
   1. Bereiten Sie eine 0,4% Lösung von Trypan Blue in PBS vor. 0,1 ml Trypanblue-Stammlösung zu 1 ml Zell hinzufügen. Laden Sie ein Hämozytometer und untersuchen Sie sofort unter dem Mikroskop bei geringer Vergrößerung. Zählen Sie die Anzahl der Gesamtzellen und die Anzahl der blauen Färbezellen. Lebensfähige Zellen = [1,00 – (Anzahl der blauen Zellen ÷ Anzahl der Gesamtzellen)] × 100.
   2. Um die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml Kultur zu berechnen, verwenden Sie die folgende Formel. Denken Sie daran, den Verdünnungsfaktor zu korrigieren.
      Anzahl lebensfähiger Zellen × 10⁴ × 1,1 = Zellen/ml-Kultur
6. Setzen Sie eine vorbestimmte Menge an Zellen in 2 ml vollständiger Mammosphärenmedien in jedem Brunnen einer 6-well ultra-niedrigen haftenden Platte aus. Die Saatdichte beträgt normalerweise 500-4.000 Zellen/cm² Zelle pro Brunnen. Optional verwenden Sie niedrige Befestigung 24-Well-Platten während der Aussaat Zellen mit der gleichen Dichte in 0,5 ml Medien.
   HINWEIS: Wir empfehlen die Optimierung der Saatdichte und Der Kulturzeit für jede von Interesse bestochene Zelllinie.
7. Ultra-Low-Attachment 6-Well-Platten bei 37 °C und 5%_CO2 für 5-10 Tage (abhängig von der Zelllinie und der Größe der Mammosphären) inkubieren, ohne die Platten zu stören, insbesondere während der Wachstumsphase der ersten 5 Tage.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814