Name: Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a usar eletroporação in utero com CRISPR-Cas9 para analisar funções gênicas em células granulares cerebelares de roedores. Este método permite estudar desenvolvimento neural e formação de tumores cerebrais de forma rápida e eficiente.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim e Petra Schroeter para assistência técnica. Agradecemos também os Drs K. Reifenberg, K. Dell e P. Prückl de assistência úteis para experiências com animais em DKFZ; o Imaging Core instalações da DKFZ e centro de imagiologia de Carl Zeiss no DKFZ para a imagem latente de microscopia confocal. Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (D.K.).

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com normas de bem-estar animal e tenham sido aprovados pelas autoridades responsáveis (Regierungspräsidium Karlsruhe, números de aprovação: G90/13 G176/13, 14/G32, G48/14 e G133/14).
1. gerar plasmídeos pU6-sgRNA-Cbh-Cre
<ol><li>Desenha o sgRNA para o alvo de um gene de interesse de acordo com o protocolo anteriormente publicado14. Nota: Neste experimento, dois sgRNAs são projetados para direcionar o gene Top2b de rato e um sgRNA de controle não específico (tabela 1). A nocaute genes usando a tecnologia CRISPR, sgRNAs precisa ser projetado para atingir ou a sequência da código da região 5' ou o domínio essencial funcional da proteína. Um ponto de partida conveniente é testar sequências sgRNA pre-projetados publicamente disponíveis, como o GeCKO v2 rato nocaute piscina biblioteca15 do laboratório Zhang. Alternativamente, sgRNAs pode ser projetado usando software público disponível, tais como o seguinte Web site: crispr.mit.edu.</li>
	<li>Clone o sgRNAs no vetor pU6-sgRNA-Cbh-Cre. Nota: O vetor pU6-sgRNA-Cbh-Cre12 utilizado neste estudo é derivado do original de plasmídeo pX33016 , substituindo a sequência de código de SpCas9 com o Cre recombinase.<ol>
<li>Dois DNA oligos sintetiza como segue. Sentido: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisentido: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'. Nota: A 20 N é mostrado acima stand para a sequência de sgRNA.</li>
		<li>Digerir pU6-sgRNA-Cbh-Cre com BbsI por 30 min a 37 ° C, usando os seguintes reagentes, carregar a amostra digerida para um gel de agarose a 1% e purificá-los usando um kit de gel-extração. Uso 3 µ g plasmídeo; 3 µ l Bbseu; 1 µ l FastAP; 5 µ l 10 x buffer de digestão; Adicione ddH2O para trazer o volume total de 50 µ l.</li>
		<li>Fosforilar e recoze a cada par de oligos sgRNA usando os seguintes reagentes (volume total de 10 µ l): 1 µ l Customized sentido oligo (100 mM); 1 µ l personalizado antisentido oligo (100 mM); 1 µ l 10 x T4 ligadura Buffer; µ L 6.5 ddH2O; 0,5 Μ L T4 PNK. Incubar em um thermo-cycler por 30 min a 37 ° C e 5 min à 95 ° C e em seguida a rampa até 25 ° C a 5 ° C/min.</li>
		<li>Configurar a seguinte reação de ligadura e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (volume total de 10 µ l): X µL Bbseu digerido do plasmídeo (50 ng); 1 µ l fosforilada e recozido, oligo duplex (diluição de 1: 200); 5 µ l 2 x buffer de ligadura; X µL ddH2O; Ligase rápida de 1 µ l.</li>
		<li>Adicione 2 µ l do produto ligadura em 50 µ l de células quimicamente competentes de DH5α Escherichia coli . Após 30 min de incubação no gelo, calor choque da amostra para 90 s a 42 ° C e incubar por 2 min no gelo. Adicione 100 µ l de meio LB e placa-lo em uma placa LB contendo 100 ampicilina µ g/mL. Nota: A integração da sequência de sgRNA para o plasmídeo pU6-sgRNA-Cbh-Cre é realizada de acordo com as etapas de clonagem para a pX330 do plasmídeo14.</li>
		<li>Inocular dois colônias, cada um em 2 mL de meio LB a 37 ° C por um período mínimo de 6 h e realizar um isolamento de DNA de mini-preparação usando um kit.</li>
		<li>Sanger sequenciar o DNA de prep mini usando o primer hU6-Forward e identificar colônias com a inserção correta de sgRNAs, alinhando com a sequência mostrada na etapa 1.2.1. A sequência da primeira demão é mostrada na tabela 1. Plasmídeos utilizados neste estudo foram nomeados pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre e pU6-sgControl-Cbh-Cre.</li>
		<li>Inocular colônias corretamente identificados e purificar o livre de endotoxinas plasmídeo para eletroporação no útero usando um kit, por exemplo, da Qiagen. Eluir o DNA com endotoxina livre TE-tampão diluído em ddH2O às 01:10 (reserva de 10% TE). A concentração de DNA do plasmídeo precisa ser superior a 2 mg/mL. Nota: Não utilize um kit de maxi-prep regular para preparação de DNA. Loja do plasmídeo-soluções a 4 ° C para uso regular de curto prazo (até 4 semanas), ou alíquota um volume adequado de cerca de 25 µ l e manter a-20 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. testar a eficiência do sgRNAs usando o sistema do plasmídeo EGxxFP
Nota: A eficiência do sgRNAs normalmente é testada pelo topógrafo ou T7E1 (T7 endonuclease eu) ensaios. Neste protocolo, é usada uma abordagem alternativa fácil e eficiente. A chave desta abordagem é usar o plasmídeo pCAG-EGxxFP, que contém fragmentos de EGFP sobrepostos, separados por uma sequência de DNA que contém o sgRNA segmentação local17. Sobre a expressão de pCAG-EGxxFP, juntamente com o sgRNA e Cas9 nas células transfectadas, a ruptura de mediada por Cas9 fita dupla (DSB) na sequência de destino é reparada por endógenos mecanismos dependentes de homologia, que reconstitui a expressão EGFP gaveta.
<ol><li>Desenho de primers para amplificar a região genômica centralizada com o sgRNA como alvo sequências. O amplicon PCR é aproximadamente 500 bp. Neste experimento, aplicou-se um conjunto de DNA para clonar um fragmento amplificado por PCR para o plasmídeo pCAG-EGxxFP. Nota: Como alternativa, sites de restrição apropriada podem ser adicionados à extremidade 5' dos primers PCR. Sites de restrição disponíveis no vetor pCAG-EGxxFP são BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI e EcoRV.</li>
	<li>Amplifica o DNA genômico com primers projetados usando o formulário e PCR parâmetros abaixo. Carregar a amostra (19.7 µ l H2O; 0,3 µ l de 10 ng / µ l do mouse DNA genômico; 2,5 µ l 10 µM EGxxFP-Top2b-F; 2,5 µ l 10 µM EGxxFP-Top2b-R; 25 µ l 2 X mestre mistura PCR; volume total de 50 µ l) para um agarose 1% gel e gel-purificar os fragmentos PCR usando um kit de gel-extração. Use a seguinte reação condições: 95 ° C por 3 min; Então 35 x ciclos de 98 ° C por 20 s, 60 ° C durante 15 s, 72 ° C durante 20 segundos e 72 ° C por 1 min; 4 ° C, por tempo indeterminado. Nota: Neste experimento, uma região Top2b exon 1 foi amplificada; Encontre as sequências de cartilha na tabela 1.</li>
	<li>Digerir o vetor de pCAG-EGxxFP com enzimas de restrição BamHI e EcoRI por 2 h a 37 ° C, em seguida carregar a amostra para um agarose 1% gel e gel-purificar a espinha dorsal de vetor usando um kit de gel-extração. Use os seguintes reagentes (volume total de 50 µ l): X µL plasmídeo (3 µ g); BamHI 2 µ l; 2 µ l EcoRI; 5 µ l 10 x Buffer; X µL ddH2O.</li>
	<li>Configurar o DNA montagem reação18 de acordo com as instruções do fabricante e transformar em DH5α competente Escherichia coli.</li>
	<li>Inocular duas colónias, cada em 2 mL de meio LB a 37 ° C por um período mínimo de 6 h, executar um isolamento de DNA de mini-preparação usando um kit, por exemplo, da Qiagen e identificar colônias com a inserção correta (doravante referida como pCAG-EG-Top2b-FP) usando Sanger sequenciando com o primer EGxxFP-Top2b-F.</li>
	<li>Transfect HEK293T células.<ol>
<li>Células de semente a HEK293T em uma placa de 24 24 h antes do transfection. Nota: As células foram cultivadas em uma incubadora de célula de 37 ° C com 5% CO2, em DMEM com suplemento de glutamina contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina. Certifique-se de que as células são 60% de confluencia no dia do transfection. Neste experimento, costumávamos self-made HEK293T células expressando estàvel SpCas9 para testar pU6-sgRNA-Cbh-Cre. No entanto, sua HEK293T células podem ser usadas se um vetor de expressão SpCas9 é fornecido.</li>
		<li>Transfect as células HEK293T usando o reagente o polyethylenimine (PEI). Transfect as células com 120 ng/poço do plasmídeo pCAG-EG-Top2b-FP12 e 120 ng/poço de pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre ou pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre em uma placa de 24. Misture o DNAs plasmideo e o 1,8 µ l de reagente de PEI em 80 µ l de unsupplemented meio DMEM com glutamina suplemento e incube por 15 min à temperatura ambiente após a utilização do vortex.</li>
		<li>6 h após o transfeccao, remover o meio e substitua por meio fresco.</li>
		<li>Monitore a presença de células vivas de GFP+ 48 h após a transfeccao usando um microscópio de fluorescência na ampliação de 20 x. Nota: O número de células GFP+ indica a eficiência de direcionamento do sgRNA. Resultados da sgRNAs eficaz e não eficazes (sgTop2b-1 e sgTop2b-2, respectivamente) são mostrados na Figura 2A.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. executar no Utero eletroporação
<ol><li>6 a 8 semanas os ratos se reproduzem e preparar as ferramentas para eletroporação no útero . Cruzar um macho homozigoto Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP ratos com ratos fêmeas CD-1. Tempo a gravidez dos ratos CD-1 desde o dia em que o plugue vaginal é detectado (E0.5). Os embriões são electroporated no dia E13.5.<ol>
<li>Puxe os capilares de vidro de borosilicato (diâmetro interno: 0.6-0.8 mm) com um puxador de micropipeta. Use as seguintes configurações: P = 500, calor = 560, Pull = 150, Vel = 75, tempo = 250. Rotule a ponta capilar com tinta preta, para melhor visualização durante a injeção. Aparar o atarraxamento capilar sob um estereomicroscópio usando uma régua e pinças de agulha em ponto e apare a ponta em um comprimento de cerca de 6 mm.</li>
		<li>Manter a unidade dos capilares para manter o experimento pode ser reproduzido. Crie uma borda chanfrada unilateral durante o corte. A ponta deveria ser mais nítida possível para fácil penetração da parede uterina e para evitar danos nos tecidos do embrião. Nota: Como alternativa, use um micro moedor para ajustar um ângulo de 35°19. Os capilares podem ser armazenados à temperatura ambiente em um prato de Petri, sob condições isentos de agentes patogénicos de 10 cm.</li>
		<li>Autoclave os instrumentos cirúrgicos.</li>
		<li>Misture os sgRNA-plasmídeos em partes iguais com Luc-pT2K-IRES a uma concentração final de pelo menos 1 µ g / µ l para cada cor e plasmídeo a plasmídeo-solução com verde rápido (concentração final de 0.05%). Prepare a solução-mãe 1% rápido verde com água destilada livre de endotoxinas e filtrar através de um filtro de 0,22 µm para remover partículas de corante da solução. Nota: Transfection co de pT2K IRES-Luc é opcional, mas permite a identificação dos animais electroporated viável após o nascimento, utilizando imagens de bioluminescência. Por favor, consulte a etapa 3.5. Prepare uma quantidade suficiente de plasmídeo-mistura para o número total de ratos grávidas para ser operado. Use sobre 15-20 µ l misturar por rato (~ 12 embriões). Imediatamente com a cirurgia.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare os ratos para a cirurgia.
	<ol>
<li>ANESTHETIZE ratos CD-1 grávidas com isoflurano. Induzir a anestesia em uma caixa com 3-4% vol isoflurano (taxa de fluxo de oxigênio: 1,5 L/min) e mantê-lo com 2 vol-% durante a cirurgia através do cone de nariz. Nota: A cirurgia completa não deve demorar mais do que 30 min. reduzir o número de injetado e electroporated embriões, se necessário. Use luvas esterilizadas para cirurgia.</li>
		<li>Coloque o mouse sobre as costas de uma almofada de aquecimento e ajuste a anestesia.</li>
		<li>Injetar analgésico (Metamizol, 800 mg/kg peso de corpo, por via subcutânea (s.c.), depósito de 24 h). Nota: Você pode usar outros analgésicos autorizados que Metamizol.</li>
		<li>Aplica a pomada para evitar ressecamento do olho durante a cirurgia.</li>
		<li>Corrigir os membros com fita e esterilizar o abdômen com um desinfectante. Cobrir o mouse com gaze, deixando apenas a área cirúrgica exposta. Espalhe o etanol a 70% sobre gaze e área cirúrgica.</li>
		<li>Fazer uma incisão na pele de cerca de 2 cm de comprimento e alargar o fosso suavemente com tesoura cirúrgica reta. Localize o linea alba e fazer uma segunda incisão ligeiramente menor através do peritônio, utilizando tecido tesoura com ponta romba.</li>
		<li>Umedeça a cavidade abdominal aberta com 1 estéril pré-aquecido x PBS.</li>
		<li>Cuidadosamente, extrai os cornos uterinos da cavidade abdominal, usando pinça de anel. Puxe suavemente, agarrando a parede uterina unicamente na gap entre os sacos de gema dos dois embriões vizinhos. Evite qualquer pressão sobre o embrião enquanto puxa-lo através da incisão. Ampliar a incisão, se necessário e tome cuidado extra para posicionar os cornos uterinos no abdômen enquanto não comprimir o fluxo de sangue através da artéria uterina. Nota: Em alguns casos, é aconselhável extrair um corno uterino de cada vez e substituí-lo antes de prosseguir com o segundo corno uterino.</li>
	</ol></li>
	<li>Injeção e eletroporação de plasmídeo DNAs
	<ol>
<li>Aspire aproximadamente 15 µ l de plasmídeo-solução colorida com o capilar de vidro preparado. Evite quaisquer bolhas de ar durante este processo. Nota: A solução do plasmídeo pode entupir a ponta facilmente se sua concentração for elevada. Teste capilar liberando alguns DNA antes da injeção.</li>
		<li>Delicadamente segurar o embrião com pinça de anel e localizar a área do pescoço. Nota: Se o embrião está em uma posição difícil injetar, ignorá-lo e ir para o embrião do próximo. Aumento de reposicionamento do embrião pode aumentar as chances de dano a eles.</li>
		<li>Lentamente, perfurar com a ponta do capilar de vidro previamente preparado para o quarto ventrículo por penetrar o rombencéfalo dorsal e posteriormente injetar cerca de 1 µ l de mistura de plasmídeo. Confirme que o DNA tingido não é vazado do cérebro e é visível como um diamante em forma de estrutura. Nota: Como opção, use 2.5-fold lupas para melhor visualização do quarto ventrículo e ao redor dos vasos sanguíneos. Entrega os impulsos elétricos imediatamente depois da injeção para evitar a difusão da plasmídeo-solução para os outros ventrículos.</li>
		<li>Aplicar impulsos elétricos quadrados (5 pulsos, 32 mV, 50 ms-na, 950 ms-fora) com fórceps, como pinças de platina (ver Tabela de materiais). Coloque os eléctrodos lateralmente com o polo negativo, cobrindo a orelha e o polo positivo do primórdio cerebelar posicionados ao longo da parede uterina. Use placas de eletrodo 5 mm de diâmetro para eletroporação eficaz de embriões E13.5. Nota: Aumente a taxa de sobrevivência dos filhotes manipulando a menos de 2/3rd do número total de embriões por barragem. Evite os embriões demasiado perto para o colo do útero. Se manipulado, eles podem causar complicações durante o parto e comprometer a ninhada inteira. Se os eletrodos são muito perto do coração do embrião, isto pode causar parada cardíaca.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuidados pós-electroporation e pós-operatório
	<ol>
<li>Coloque cuidadosamente os cornos uterinos volta na cavidade abdominal e preenchimento com pré aquecido estéril 1 x PBS. Deixe o slide de cornos uterinos em uma posição natural.</li>
		<li>Feche o peritônio e pele separadamente com uma sutura contínua simples. Nota: Tome cuidado extra para não perfurar a parede uterina quando suturar o peritônio.</li>
		<li>Encerramento da anestesia e coloque o animal de barriga para baixo numa jaula de nova.</li>
		<li>Monitore o animal durante a fase de vigília e novamente 24 h após a cirurgia. Coloque a gaiola sob uma lâmpada de aquecimento, se o tremor não melhora dentro de um tempo-frame de 15 min e o animal não inicia o aliciamento.</li>
		<li>Confirme o sucesso electroporation pela imagem latente do luciferase.<ol>
<li>Certifique-se que as barragens operadas cair embriões no tempo (na E19.5). Nota: A data de nascimento pode ser adiada para o dia seguinte provavelmente por causa da operação.</li>
			<li>Anestesiar os filhotes de electroporated (P5-P7) com 2,5% de isoflurano e injetar (intraperitoneal (i.p.)) com D-luciferina (3 mg/kg de peso corporal) 5 min antes da imagem latente.</li>
			<li>Detecta sinais de luciferase nos filhotes de electroporated usando o gerador de imagens de bioluminescência. Nota: Um tempo de exposição de 1 min é suficiente para detectar o sinal de luciferase. Radiance (p/s/cm2/sr) é aproximadamente > 1 x 106.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>4. prepare Cryosections de Cerebella a Electroporated
<ol><li>Abater os filhotes de P7 electroporated e dissecar o cerebelo. Nota: O sinal GFP pode ser observado usando um estereoscópio epifluorescente.</li>
	<li>Corrigir o cerebella durante a noite em 5 mL por cérebro de 4% PFA em PBS a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir o cerebella fixo durante a noite em 10 mL por cérebro de 30% de sacarose em PBS a 4 ° C. Nota: O tecido deve atingir o fundo de um tubo de 15 mL após incubação na solução de sacarose.</li>
	<li>Após absorver o restante da solução de sacarose com um pedaço de papel de filtro de celulose, mergulhe o cerebelo em uma temperatura de corte ideal (OCT) composta em um molde de plástico descartável e congelá-lo em gelo seco. O bloco criogênico pode ser armazenado a-80 ° C até o uso. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Corte o bloco criogênico em seções com 10 µm de espessura, usando um criostato e manter as secções a-80 ° C até o uso. Nota: Um pode confirmar a expressão de GFP nas seções, depois de lavar a OCT composto com PBS.</li>
</ol>5. imunocoloração da Cryosections
<ol><li>Seca as lâminas no room temperature por 30 min e lave duas vezes por 10 min em PBS.</li>
	<li>Circule as seções com uma caneta de bloqueador líquido e incubar as seções em uma solução de bloqueio (10% de soro normal burro em PBS contendo 0,1% Triton-X100) por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Acrescente os anticorpos primários contra as moléculas de interesse (por exemplo, as boas práticas agrícolas e topoisomerase II beta (Top2B) neste estudo) na solução de bloqueio e incubar durante a noite a 4 ° C. Nota: Os nomes e as concentrações de anticorpos utilizados estão listadas na Tabela de materiais. Para melhorar os sinais GFP, um anticorpo anti-GFP opcionalmente pode ser usado juntamente com os outros anticorpos.</li>
	<li>Lave os slides com 0.1% contendo Triton PBST 3 X 10 min. Incubar as secções por 1h à temperatura ambiente com um anticorpo secundário conjugado fluoróforo diluído na solução de bloqueio contendo DAPI.</li>
	<li>Lavar as lâminas em PBS 3 X 10 min. Monte os slides e manter a 4 ° C até a imagem. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>6. geração de imagens e análise
<ol><li>As seções usando um microscópio confocal, ampliação de 20 x da imagem.</li>
	<li>Conte o número de células positivas GFP, perdendo a expressão da proteína alvo. Uma imagem representativa é mostrada na Figura 2B.</li>
	<li>Verifique se o fenótipo molecular após ablação do gene-alvo no PNB e suas progênies immuostaining12.</li>
</ol>

<ol><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing.</a> Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).</li>
<li>Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+CRISPR%2FCas9-mediated+tumour+suppressor+disruption+enables+versatile+brain+tumour+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling.</a> Nat Commun. 6, 7391(2015).</li>
<li>Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+and+transforming+neocortical+progenitors+by+CRISPR%2FCas9+gene+targeting+and+piggyBac+transposase+lineage+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling.</a> Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+nucleogenesis+by+precerebellar+neurons%3A+involvement+of+ventricle-directed%2C+radial+fibre-associated+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration.</a> Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).</li>
<li>Kawauchi, D., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+cascade+from+Math1+to+Mbh1+and+Mbh2+is+required+for+cerebellar+granule+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation.</a> Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).</li>
<li>Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+BarH1+confers+commissural+neuron+identity+on+dorsal+cells+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord.</a> Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).</li>
<li>Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+expression+in+postmitotic+neurons+by+an+in+vivo+electroporation-based+tetracycline+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system.</a> J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).</li>
<li>Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+MYC-driven+medulloblastoma+models+from+multiple+embryonic+cerebellar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells.</a> Oncogene. , (2017).</li>
<li>Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chd7+is+indispensable+for+mammalian+brain+development+through+activation+of+a+neuronal+differentiation+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme.</a> Nat Commun. 8, 14758(2017).</li>
<li>Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mutant+mice+by+pronuclear+injection+of+circular+plasmid+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA.</a> Scientific Reports. 3, 3355(2013).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortex-%2C+Hippocampus-%2C+Thalamus-%2C+Hypothalamus-%2C+Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+Utero+Electroporation+in+the+C57BL%2F6+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> J Vis Exp. (107), e53303(2016).</li>
<li>Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+basis+of+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular basis of cerebellar development.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Usando o exo utero electroporation, anteriormente informamos siRNA-baseado na vivo funcional análises de Atoh1 numa fase precoce do grânulo cerebelar celular diferenciação8. Devido à diluição de siRNA/degradação e exposição de embriões fora da parede uterina, análise fenotípica das células grânulo electroporated limitou-se a estágios embrionários. No entanto, o método atual habilitado para análise do fenótipo dos animais pós-natal.
Nosso estudo anterio...

Doenças do cérebro são uma das mais terríveis doenças mortais. Muitas vezes resultam de mutações genéticas e desregulação subsequente. Para entender os mecanismos moleculares de doenças cerebrais, eterno esforços para decifrar os genomas dos pacientes humanos descobriram um número de genes causadores potenciais. Até agora, modelos animais germline geneticamente modificado têm sido utilizados para na vivo ganho-de-função (GOF) e perda de função (LOF) análises de tais genes candidatos. Devido ao acelerado desenvolvimento de estudos de validação funcional, um mais viável e flexível na vivo gene ensaio sistema para estudar a função dos genes é desejável.
A aplicação de um sistema de transferência de gene electroporation-baseado na vivo para o cérebro de rato em desenvolvimento é apropriada para esta finalidade. Na verdade, vários estudos utilizando no utero electroporation mostraram seu potencial para realizar análises funcionais no desenvolvimento cerebral1,2,3. Na verdade, várias regiões do cérebro do rato, tais como o córtex cerebral4retina5, diencéfalo6, rombencéfalo7, cerebelo8e medula espinhal9 têm sido alvo de entrega genética somática abordagens, até agora.
De fato, expressão do gene transitória por eletroporação na vivo no cérebro de rato embrionárias tem sido muito utilizado para análise GOF. Recentes tecnologias de integração de genômica transposon-baseado mais habilitado a longo prazo e/ou condicional a expressão de genes de interesse10,11, que é uma vantagem para dissecar a função dos genes de uma forma espacial e temporal durante desenvolvimento. Em contraste com a análise do GOF, análise LOF tem sido mais difícil. Enquanto transfection transiente de siRNAs e plasmideos shRNA de transporte realizou-se, a longo prazo efeitos de LOF dos genes não são garantidos devido à eventual degradação dos ácidos nucleicos exogenamente introduzidas, como plasmídeos e dsRNAs. No entanto, a tecnologia CRISPR/Cas fornece uma quebra-através de análises LOF. Genes que codificam proteínas fluorescentes (por exemplo, as boas práticas agrícolas) ou proteínas bioluminescentes (por exemplo, luciferase de vaga-lume) tem sido co transfected com CRISPR-Cas9 e sgRNAs para rotular as células expostas a mutações somáticas CRISPR-Cas9-mediada. No entanto, esta abordagem pode ter limitações em estudos funcionais em pilhas proliferating, desde genes marcadores exógenos são diluídos e degradados após proliferação a longo prazo. Enquanto as células transfectadas e suas células-filhas passam por mutações induzidas pelo CRISPR em seus genomas, suas pegadas podem se perder ao longo do tempo. Assim, abordagens genéticas de rotulagem seria adequadas para superar esse problema.
Recentemente desenvolvemos um método LOF CRISPR-baseado em células grânulo cerebelar que se submetem a proliferação de longo prazo durante sua diferenciação,12. Para rotular geneticamente as células transfectadas, temos construído um plasmídeo carregando um sgRNA juntamente com Cre e introduzido o plasmídeo a cerebella de Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP de ratos13 usando no utero electroporation. Ao contrário dos vetores de plasmídeo regular codificação EGFP, essa abordagem com êxito rotulado grânulo transfectado precursores do neurônio (PNB) e suas células-filhas. Este método fornece grande apoio na compreensão função in vivo de genes de interesse nas células em proliferação no desenvolvimento normal do cérebro e um fundo propensas a tumor.

<table><tbody><tr><td>Alexa 488 ThermoFisher anti-frango para cabras</td><td></td><td>A11039</td><td>Diluição 1:400</td></tr><tr><td>Alexa 568 Anti-rato para burros</td><td>Life Technologies</td><td>A-10037</td><td>Diluição 1:400</td></tr><tr><td>Alexa 594 Anti-coelho para burros</td><td>ThermoFisher</td><td>A21207</td><td>Diluição 1:400</td></tr><tr><td>Alexa 647 Anti-Coelho para burros</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>Diluição 1:400</td></tr><tr><td>Alcalina Fosfatase (FastAP)</td><td>ThermoFisher</td><td>EF0654</td><td></td></tr><tr><td>Banda de autoclave</td><td>Kisker Biotech</td><td>150262</td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BbsI (FastDigest)</td><td>ThermoFisher</td><td>FD1014</td><td></td></tr><tr><td>Papel de Filtro de Celulose (Whatman)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10347525</td><td></td></tr><tr><td>Pano</td><td>Tork</td><td>530378</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina</td><td>biovision</td><td>7903-1</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Moldes de plástico descartáveis (Tissue-Tek Cyromold)</td><td>VWR</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>31966047</td><td></td></tr><tr><td>Soro</td> <td>de burroSigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI (HF)</td> <td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Electro Square Porator</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td></td></tr><tr><td>Endofree Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para os olhos (Bepanthen)</td> <td>Bayer</td><td>81552983</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Merck</td><td>104022</td><td></td></tr><tr><td>Filtro FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10270-016</td><td></td></tr><tr><td>(0.22 &micro; m)</td> <td>Merck</td><td>F8148</td><td></td></tr><tr><td>Imageador de células fluorescentes (ZOE)</td> <td>Biorad</td><td>1450031</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps em linha reta</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Gaze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15387311</td><td></td></tr><tr><td>GFP anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>1:1000 diluição</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro com filamento</td><td>Narishige</td><td>GD1-2</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>ThermoLux</td><td>463265 / -67</td><td></td></tr><tr><td>Software de processamento de imagem (ImageJ e Fiji)</td><td></td><td></td>Seringa de <td></td></tr><tr><td>insulina NIH (B. Braun OMNICAN U-100)</td><td>Carl Roth</td><td>AKP0.1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Zoetis</td><td>TU061219</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Paquímetro Lumina LT Série III</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136331</td><td></td></tr><tr><td>Kalt Agulhas de Sutura</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>12050-02</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HIFI HOTSTART READY mix</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>diluição 1:500</td></tr><tr><td>Ponteiro de luz</td><td>Fotônico</td><td>PL3000</td><td></td></tr><tr><td>Caneta bloqueadora líquida</td><td>Kisker Biotech</td><td>MKP-1</td><td></td></tr><tr><td>Metamizol</td><td></td> <td>WDT-Microgrinder</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Narishige</td><td>EG-45</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta Extrator</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Software para microscópio ZEN</td><td>Zeiss-Fio</td> <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>sutura de seda não estéril (0,12 mm)</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Composto (Tissue-Tek)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo p27</td><td>BD biociência</td><td>610241</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Roth</td><td>335,3</td><td></td></tr><tr><td>PBS ( 1x)</td> <td>Life Technologies</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-EGxxFP</td><td>Addgene</td><td>50716</td><td></td></tr><tr><td>Polietileninina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo pX330</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de Extração de Gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ligação rápida</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de anel Ferramentas</td><td>de ciências finas</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas (SuperFrost)</td>Software <td>de 10417002</td><td></td> <td>ThermoFisher</td></tr><tr><td>para bioestatística (Prisma 7)</td><td>Software GraphPad,</td> <td>Inc-Spitacid</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>EcoLab</td><td>3003840</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Nikon</td><td>C-PS</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica com ponta romba</td><td>Fine Science Tools</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Sutura (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))</td><td>SMI</td><td>220340</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligation Buffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de tecido sem corte (11,5 cm)</td> <td>Ferramentas de ciência fina</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>TOP2B anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc13059</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Tripsina (2,5%)</td> <td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>pinças com 5mm e Oslash; eletrodos de disco Platinum</td><td>Xceltis GmbH</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador</td><td>Dr&auml; gerwerk AG</td><td>GS186</td><td></td></tr></tbody></table>

mediada por crispr perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no utero electroporation gene transferência baseada

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Malformação do cérebro é frequentemente causada por mutações genéticas. Decifrar as mutações nos tecidos derivados de paciente identificou potenciais fatores causais das doenças. Para validar a contribuição de uma disfunção dos genes mutantes para o desenvolvimento da doença, a geração de modelos animais carregando as mutações é uma abordagem óbvia. Enquanto germline geneticamente modelos do rato (GEMMs) são populares ferramentas biológicas e apresentam resultados reprodutíveis, é restrito pelo tempo e custos. Entretanto, GEMMs não-germline frequentemente permitem explorar função do gene de uma forma mais viável. Desde o cérebro algumas doenças (por exemplo, tumores cerebrais) aparecem como resultado de somático mas não germline mutações, modelos de não-germline quimérico do rato, em que coexistem células normais e anormais, podem ser útil para análise de doenças relevantes. Neste estudo, nós relatamos um método para a indução de mutações somáticas CRISPR-mediada no cerebelo. Especificamente, utilizamos o condicionais bater-em camundongos, no qual Cas9 e GFP são cronicamente ativado pelo promotor CAG (CMV realçador/frango ß-actina) após Cre-mediada recombinação do genoma. O single-guia auto-concebidos RNAs (sgRNAs) e a sequência de recombinase Cre, ambos codificados em um plasmídeo único construto, foram entregues em células tronco/progenitoras cerebelar numa fase embrionária usando eletroporação no útero . Consequentemente, células transfectadas e suas células-filhas foram rotuladas com proteína verde fluorescente (GFP), facilitando ainda mais as análises fenotípicas. Portanto, este método é não só mostrando entrega baseada em electroporation gene em células embrionárias Cerebelares mas também propõe uma nova abordagem quantitativa para avaliar mediada por CRISPR fenótipos de perda-de-função.

Na vivo análise funcional, é fundamental para identificar as células em que foram introduzidos genes exógenos. Enquanto a expressão de um marcador, como o GFP na não-proliferação de células pode ser acompanhados por um longo período de tempo, o sinal se perde sequencialmente nas células em proliferação. Uma ilustração deste efeito é demonstrada na Figura 1. Para contornar a perder a pegada de células transfectadas em análises LOF, desenvolvemos uma n...

Estudos convencionais de perda-de-função de genes usando animais nocaute foram frequentemente dispendioso e demorado. Baseado em Electroporation mutagênese mediada por CRISPR somática é uma ferramenta poderosa entender gene funciona em vivo. Aqui, nós relatamos um método para analisar os fenótipos de nocaute nas células em proliferação do cerebelo.

Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

O objetivo geral desta abordagem de transferência de genes in vivo baseada em eletroporação é avaliar os papéis dos genes de interesse na diferenciação de células granulares cerebelares usando análises de perda de função mediadas por CRISPR. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nas neurociências do desenvolvimento e nas neuro-oncologias, como a identificação das moléculas importantes para o desenvolvimento cerebelar normal e formações de tumores cerebrais. O procedimento de eletroporação no útero será demonstrado pela Dra. Lena Herbst, pós-doutoranda do laboratório do professor Peter Lichter e, em seguida, a imuno-histoquímica a seguir será realizada pelo Dr. Weijun Feng, pós-doutorando do laboratório do Dr. Haikun Di.A principal vantagem desse método é tentar nocautear de forma viável genes de interesse nas células cerebelares, usando as tecnologias CRISPR-cas9, em vez da geração da combinação de animais knock-out. Embora esse método possa fornecer informações sobre as funções dos genes durante o desenvolvimento cerebelar normal, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o desenvolvimento de outras regiões físicas do cérebro e a modelagem de tumores cere

crispr-mediated-loss-function-analysis-cerebellar-granule-cells-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Na eletroporação utero é um método valioso para transfecting células progenitoras neuronal in vivo. Dependendo da colocação dos eletrodos e do ponto no tempo de desenvolvimento de eletroporação, certos subgrupos de células corticais podem ser alvo. Células-alvo podem então ser analisados ​​in vivo ou in vitro para efeitos da alteração genética.

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

Este vídeo demonstra a entrega de DNA de plasmídeo em células neuronais cerebelares de embriões murinos usando eletroporação in utero. Este método é útil para obter compreensão da função in vivo dos genes no desenvolvimento normal do cérebro e as mudanças na expressão gênica das células dos neurônios durante a progressão do tumor.

Entrega de genes baseada em eletroporação in utero: uma técnica para injetar DNA de plasmídeo em células cerebelares embrionárias de embriões murinos

Neste vídeo, realizamos eletroporação de fatias de cerebelo de embrião de galinha com plasmídeos do gene repórter. A técnica facilita a visualização do desenvolvimento e migração de precursores de células granulares para formar uma camada granular.

Eletroporação ex vivo de fatias cerebelares de embriões de galinha: um método para introduzir DNA de plasmídeo que codifica proteína fluorescente verde para visualizar o desenvolvimento de células granulares

Morfogênese neuronal ea migração são eventos cruciais subjacentes ao desenvolvimento do cérebro. Aqui, descrevemos os métodos para manipular geneticamente cultivadas neurônios granulares do cerebelo e do cerebelo em desenvolvimento para a avaliação da morfologia e características migratórias dos neurônios.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

A migração de neurônios é regulada por vários fatores autônomos e não celulares autônomos.  Este protocolo mostra como a eletroporação in utero pode ser usada para determinar se um fenótipo em um camundongo transgênico é devido à interrupção de um mecanismo intrínseco celular ou comprometimento da interação entre o neurônio e seu ambiente.

Indução da Eliminação Proteína Através In Utero Eletroporação para definir défices de Migração Neuronal em modelos transgênicos

A camada externa de grânulo cerebelar é o local da maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo para direcionar modificação genética a esta camada no pico de proliferação utilizando ex eletroporação vivo e cultura de fatias de cerebelo a partir do dia 14 embriões de galinha embrionárias.

Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

Periventricular nodular heterotopia (PNH) é a forma mais comum de malformação do desenvolvimento cortical (MCD) na idade adulta, mas sua base genética permanece desconhecida em casos mais esporádicos. Recentemente desenvolvemos uma estratégia para identificar genes candidatos romance para MCDs e confirmar diretamente seu papel causal em vivo.

Uma nova estratégia combinando Array-CGH, todo-exome sequenciamento e eletroporação no Utero em roedores para identificar Genes causadores de malformações do cérebro

Funções celulares autónomos de genes no cérebro podem ser estudadas através da indução de perda ou ganham de função em esparsas populações de células. Aqui, descrevemos no utero electroporation para entregar recombinase Cre em populações esparsas de desenvolver os neurônios corticais com genes de floxed para causar a perda da função em vivo.

Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero

Aqui descrevemos um método para visualizar a sinaptogênese de neurônios de grânulos no cerebelo do rato ao longo do curso de tempo do desenvolvimento cerebral pós-natal, quando essas células refinam suas estruturas sinápticas e formam sinapses para se integrarem ao circuito cerebral geral.

Utilizando a eletroporação pós-natal in vivo para estudar a morfologia do neurônio do grânulo cerebelar e o desenvolvimento da sinapse

Aqui, descrevemos uma técnica simples destinada à geração eficiente de camundongos geneticamente modificados chamada CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Este método fornece reagentes de edição por eletroporação em embriões a uma eficiência próxima de 100%. Este protocolo é eficaz para mutações pontuais, pequenas inserções genômicas e deleções em embriões de mamíferos.

Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

Aprenda a usar eletroporação in utero com CRISPR-Cas9 para analisar funções gênicas em células granulares cerebelares de roedores. Este método permite estudar desenvolvimento neural e formação de tumores cerebrais de forma rápida e eficiente.

Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada (Vídeo) | JoVE Journal

Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada

Explorar mais vídeos