Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada

O objetivo geral desta abordagem de transferência de genes in vivo baseada em eletroporação é avaliar os papéis dos genes de interesse na diferenciação de células granulares cerebelares usando análises de perda de função mediadas por CRISPR. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nas neurociências do desenvolvimento e nas neuro-oncologias, como a identificação das moléculas importantes para o desenvolvimento cerebelar normal e formações de tumores cerebrais. O procedimento de eletroporação no útero será demonstrado pela Dra. Lena Herbst, pós-doutoranda do laboratório do professor Peter Lichter e, em seguida, a imuno-histoquímica a seguir será realizada pelo Dr. Weijun Feng, pós-doutorando do laboratório do Dr. Haikun Di.

A principal vantagem desse método é tentar nocautear de forma viável genes de interesse nas células cerebelares, usando as tecnologias CRISPR-cas9, em vez da geração da combinação de animais knock-out. Embora esse método possa fornecer informações sobre as funções dos genes durante o desenvolvimento cerebelar normal, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o desenvolvimento de outras regiões físicas do cérebro e a modelagem de tumores cerebrais. Comece carregando um capilar de vidro borossilicato em um extrator de micropipeta e puxando para criar uma ponta fina.

Rotule a ponta capilar com tinta preta para melhor visualização durante a injeção e desenhe uma escala no vidro. Trabalhando sob um estereomicroscópio, use uma régua e uma pinça de agulha afiada para aparar a ponta em um comprimento de cerca de seis milímetros e criar uma borda chanfrada afiada e unilateral. Filtre uma solução de estoque verde rápido a 1% através de um filtro de ponto zero de 22 mícrons para remover as partículas de corante da solução.

Misturar os plasmídeos de RNA de guia único em partes iguais com o plasmídeo repórter de luciferase até obter uma concentração final de pelo menos um micrograma por mililitro para cada plasmídeo. Pinte a solução de plasmídeo com verde rápido em uma concentração final de 0,5%Após anestesiar um camundongo CD-1 grávida com isoflurano, coloque o camundongo de costas em uma almofada de aquecimento e administre analgésico. Aplique pomada para os olhos para evitar o ressecamento dos olhos durante a cirurgia.

Fixe a lente com fita adesiva e esterilize o abdômen com um desinfetante. Cubra o mouse com gaze, deixando apenas a área cirúrgica exposta. Depois de fazer uma incisão na pele de cerca de dois centímetros de comprimento, localize a linha alba e use uma tesoura de tecido de ponta romba para fazer uma segunda incisão um pouco menor através do peritônio.

Umedeça a cavidade abdominal aberta com PBS estéril pré-aquecido. Em seguida, use uma pinça de anel para extrair cuidadosamente os chifres uterinos da cavidade abdominal. Segure a parede uterina no espaço entre os sacos vitelos de dois embriões vizinhos e puxe suavemente.

Evite qualquer pressão sobre o embrião enquanto o puxa pela incisão. Uma vez extraídos os cornos uterinos, aspirar aproximadamente 10 a 15 microlitros de solução plasmidial colorida com o capilar de vidro preparado. Evite bolhas de ar durante este processo.

Segure suavemente o embrião com uma pinça de anel e localize a área do pescoço. Penetre lentamente no rombencéfalo dorsal com a ponta do capilar de vidro e mova-se para o quarto ventrículo. Injete cerca de um microlitro da mistura de plasmídeo.

Confirme se o DNA tingido não vazou do cérebro e é visível como uma estrutura em forma de diamante. Aqui é mais importante preencher toda a região do quarto ventrículo com solução de plasmídeo, para entregar DNA também à parte distal do primórdio cerebelar. Ao mesmo tempo, certifique-se de não causar sangramento durante esse processo.

de platina, equipadas com placas de eletrodos de cinco milímetros de diâmetro lateralmente sobre a cabeça do embrião, com o pólo negativo cobrindo a orelha e o pólo positivo posicionado no primórdio cerebelar sobre a parede uterina, e aplique pulsos quadrados elétricos. Quando todos os embriões tiverem sido eletroporados, coloque cuidadosamente os cornos uterinos de volta na cavidade abdominal e preencha com PBS estéril. Deixe os cornos uterinos deslizarem para uma posição natural.

Desligue a anestesia e coloque o animal de barriga para baixo em uma nova gaiola para se recuperar. Antes da criossecção, fixe o cerebelo durante a noite em cinco mililitros de 4% de PFA em PBS por cérebro, a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira o cerebelo fixo para dez mililitros de sacarose a 30% em PBS por cérebro e incube durante a noite a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, depois que o tecido afundar no fundo do tubo, remova os miolos da sacarose e absorva a solução de sacarose restante com um pedaço de papel de filtro de celulose. Em seguida, mergulhe cada cerebelo em um composto de temperatura de corte ideal em um molde de plástico descartável e congele em gelo seco. Corte o bloco criogênico em seções de 10 mícrons de espessura, usando um criostato, e mantenha as seções a menos 80 graus Celsius até o uso.

Quando estiver pronto para prosseguir com a imunocoloração, primeiro seque as lâminas em temperatura ambiente por 30 minutos e, em seguida, lave duas vezes por 10 minutos de cada vez em PBS. Circule as seções com uma caneta bloqueadora de líquido e incube as seções em solução de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente. Adicione anticorpos primários contra as moléculas de interesse na solução de bloqueio e incube durante a noite a quatro graus Celsius.

Lave as lâminas com 0,1% de Triton contendo PBS três vezes por 10 minutos cada. Em seguida, adicione o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo diluído em solução de bloqueio contendo DAPI e incube as seções por uma hora em temperatura ambiente no escuro. Lave as lâminas em PBS-T três vezes por 10 minutos de cada vez, depois monte as lâminas e mantenha a quatro graus Celsius até a imagem.

As células hek293T que expressam estavelmente streptococcus pyogenes cas9 foram transfectadas com plasmídeos que expressam e direcionam sgRNA. A expressão de GFP em células vivas foi monitorada usando um gerador de imagens de células fluorescentes 48 horas após a transfecção. Esta imagem mostra uma sequência de sgRNA afetada com base na expressão de GFP.

Esta imagem mostra a falta de expressão de GFP resultante de uma sequência de sgRNA não eficaz. Essas imagens mostram imunocoloração de GFP, Ki67 e p27 em cerebelo de um camundongo knock-in p7-rosa26-LSL-cas9 com de parada floxed e sequências bicistronic cas9 e EGFP a jusante, que foi submetido a eletroporação em E13.5 com um plasmídeo Cre expressando sgRNA de controle. A seção é contra-manchada com DAPI.

Observe as células que expressam GFP na camada externa de células granulares marcadas por Ki67. Uma vez dominada, esta cirurgia pode ser feita em menos de 30 minutos por camundongo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear o embrião com muito cuidado, sempre usar capilares de ponta afiada e posicionar os eletrodos no ângulo preciso para garantir a entrega dos pulsos elétricos ao teto do quarto ventrículo.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo das ciências médicas explorarem os fatores causais dos distúrbios neurológicos, incluindo os tumores cerebrais no cerebelo de camundongos.