Nocaute de múltiplos genes mediado por concatemer CRISPR: uma técnica para nocautear simultaneamente vários genes por via de junção final não homóloga em células intestinais de camundongos

Comece este procedimento adicionando 9 mililitros de meio de soro reduzido ao tubo de 15 mililitros contendo a suspensão celular e centrifugue a 400G por 3 minutos em temperatura ambiente. Remova todo o sobrenadante e ressuspenda o pellet em uma solução de eletroporação. Adicione uma quantidade total de 10 microgramas de DNA a dois novos tubos. Em seguida, adicione a solução de eletroporação a um volume final de 100 microlitros e mantenha a mistura célula-DNA no gelo.

Transfira a mistura célula-DNA para a cubeta de eletroporação. Coloque a cubeta na câmara do eletroporador. Meça a impedância pressionando o botão apropriado no eletroporador e certifique-se de que seja de 0.030 a 0.055 ohm. Realize a eletroporação de acordo com as configurações indicadas no protocolo de texto. Adicione 400 microlitros de tampão de eletroporação mais inibidor de ROCK à cubeta e, em seguida, transfira todo o seu conteúdo para um tubo de 1,5 mililitro.

Incube em temperatura ambiente por 30 minutos para permitir que as células se recuperem. Após 30 minutos, gire a 400G por 3 minutos em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 20 microlitros por poço de matriz de embasamento. Semeie aproximadamente 1 x 10⁴ a 1 x 10⁵ células por poço em uma placa de 48 poços e adicione EGF mais inibidor de Noggin GSK-3, inibidor de ROCK e meio de dimetilsulfóxido de 1,25%. Incube a 37 graus Celsius.