Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Este artigo descreve métodos diferentes de crescimento

O objetivo geral deste procedimento é cultivar biofilmes de aerógenos de pseudomonas na superfície apical de células epiteliais vivas das vias aéreas humanas. Isso é feito estabelecendo primeiro uma monocamada confluente de células epiteliais das vias aéreas em uma superfície de plástico ou em uma lamínula de vidro. A segunda etapa do procedimento é cultivar uma cultura de bactérias p aerogênicas constitutivamente, expressando a proteína fluorescente verde.

O próximo passo é colocar as bactérias e as células das vias aéreas em contato umas com as outras em um ambiente estático ou em uma câmara de fluxo. A etapa final do procedimento é permitir que os biofilmes bacterianos se desenvolvam ao longo do tempo enquanto avalia a viabilidade das células das vias aéreas. Podem ser obtidos resultados que mostram a formação de biofilme em células vivas das vias aéreas por meio de microscopia de fluorescência.

A implicação dessa técnica se estende para a terapia de pacientes com fibrose cística, pois esses modelos de cocultura podem ser usados para desenvolver e validar novos esquemas antibióticos, capazes de erradicar os biofilmes responsáveis pela colonização crônica das vias aéreas. Em pacientes com fibrose cística, o modelo de biofilme de co-cultura estática usa células CFBE, que são vias aéreas humanas imortalizadas. As células epiteliais originalmente desenvolvidas a partir de um indivíduo com fibrose cística sete a 10 dias antes da inoculação bacteriana semeiam as células CFBE em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.

Semeamos células a uma concentração de duas vezes 10 elevado ao quinto por poço em 0,5 mililitros de meio essencial mínimo ou MEM suplementado com 10% de soro bovino fetal dois milimolares de L-glutamina, 50 unidades por mililitro, penicilina e 50 microgramas por mililitro. A estreptomicina aumenta as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. 95% de ar por sete a 10 dias troque o meio a cada dois ou três dias.

Essas condições levarão à formação de junções confluentes, monocamadas e apertadas um dia antes do experimento. Inocular uma cultura de cinco mililitros LB com pierro gen de um estoque congelado e crescer 18 horas a 37 graus Celsius em um rotador. A 200 RPM, usamos o aerógeno p carregando o plasmídeo PSMC 21 para expressão constitutiva de GFP no dia da inoculação bacteriana.

Remova o meio das células CFPE e adicione um volume igual de meio de microscopia, que é MEM sem vermelho de fenol, suplementado com dois milimolares de confluência de inoculação de L-glutamina, monocamadas de CFBE com posa em uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 30 para um em relação ao número de células CFBE originalmente semeadas para uma placa de 24 poços. Isso equivale a 1,2 vezes 10 da sétima UFC por mililitro em 0,5 mililitros de MEM por. Bem, incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, 95% de ar por uma hora.

Após uma hora de incubação, remova o snat e substitua por uma nova microscopia. Meio suplementado com 0,4% de arginina. A adição de arginina retarda a destruição da monocamada por tempo suficiente para que os biofilmes se formem nas células CFPE.

Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, 95% de ar por vários pontos de tempo até aproximadamente oito horas a cada duas horas. Analisar a integridade da monocamada CFBE e o crescimento do biofilme usando microscopia. O modelo de biofilme de co-cultura de célula de fluxo requer a formação de uma monocamada confluente de células CFBE em uma lamínula de vidro de 40 milímetros de diâmetro.

Para isso, coloque primeiro uma lamínula estéril em um prato de plástico estéril de 60 milímetros de diâmetro. Em seguida, adicione três mililitros de crescimento celular pré-aquecido, pressionando a lamínula com a ponta da pipeta para remover quaisquer bolhas presas por baixo e para forçar a lamínula no fundo da semente do prato de plástico, duas vezes 10 elevado à sexta célula CFBE por prato. Agite o prato suavemente para frente e para trás, mas evite girar para evitar centrifugar as células contra as laterais do prato.

Coloque o prato em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono e 95% de ar a 37 graus Celsius por oito a 10 dias. Alimente as células em dias alternados com três mililitros de meio de crescimento fresco. Nessas condições, as células formarão uma monocamada confluente na lamínula de vidro.

O próximo passo é preparar a cepa bacteriana de P aerogênio um dia antes do experimento. Cultive p aerogen em cinco mililitros de LB por 18 horas a 37 graus Celsius em um rotador. A 200 RPM, utilizamos a cepa de arógeno P, PO um, carregando o plasmídeo PSM C 21 para expressão constitutiva de GFP no dia do experimento.

Em um mililitro de cultura bacteriana em um tubo de microcentrífuga estéril e centrifugue a 6.000 RPM por três minutos. Lave o pellet bacteriano duas vezes em um mililitro de microscopia. Meio diluir 0,5 mililitros de bactérias lavadas e ressuspensas em 4,5 mililitros de meio de microscopia para atingir uma concentração de cerca de cinco vezes 10 das oitavas UFC por mililitro.

Agora estamos prontos para observar as células CFPE em tempo real, o que requer uma câmara de imagem acoplada a uma bomba peristáltica para garantir um fluxo de nutrientes por longos períodos de tempo. E um controlador de temperatura, usamos um aparelho de célula de fluxo de biofilme padrão. As biotecnologias FCS de duas câmaras modificadas para acomodar células CFPE.

Uma das etapas mais críticas no modelo de biofilme de cocultura de célula de fluxo é montar a câmara sem danificar o monitor de células para montar a câmara. Segure a metade superior da câmara de cabeça para baixo para que os tubos de perfusão fiquem visíveis e alinhe os orifícios de folga de uma junta de borracha de 0,75 milímetro de espessura nos tubos de perfusão. Empilhe a corrediça do microaqueduto fornecida com a câmara em cima da junta de borracha, certificando-se de que o lado ranhurado esteja para cima.

Em seguida, coloque outra junta de borracha em cima da corrediça. A espessura e a geometria interna desta segunda junta determinarão o volume da câmara. Em seguida, adicione um mililitro de meio de microscopia pré-quente no centro da lâmina.

Coloque a câmara de imagem em uma superfície estéril enquanto recupera as células CFPE da incubadora de cultura de células. Remova o meio gasto do prato e lave as células CFPE uma vez com três mililitros de meio de microscopia pré-quente. Usando pinça lavada com etanol.

Retire a lamínula do prato e abaixe-a de cabeça para baixo sobre o cordão de meio de microscopia colocado na câmara. A lamínula agora está apoiada na segunda junta de borracha e a monocamada de células das vias aéreas está voltada para baixo. Segurando os componentes montados em uma mão, coloque a base da câmara no topo da pilha e vire a câmara rapidamente para que tudo fique com o lado certo para cima.

Trave a base no lugar girando o anel. Conecte o tubo de entrada à bomba de microperfusão de baixo fluxo. Um segundo pedaço de tubulação liga a bomba a um meio de microscopia colocado no banho-maria de 37 graus Celsius.

Localizado ao lado do microscópio. Inicie o fluxo a uma taxa de 20 mililitros por hora. Esta taxa de fluxo está dentro da capacidade de velocidade de natação da posa.

Conecte um tubo pré-cortado estéril 16th CFL aos tubos de perfusão de entrada e saída da câmara e, em seguida, conecte o controlador de temperatura. Coloque a câmara montada no microscópio stage de um microscópio de fluorescência invertida. Usando uma seringa descartável de um mililitro.

Injete a suspensão bacteriana previamente preparada na câmara usando uma válvula bidirecional colocada em linha entre a bomba e a câmara para permitir que as bactérias se liguem às células das vias aéreas. Pare a bomba por duas horas. Após duas horas, o fluxo pode ser reiniciado e mantido em 20 mililitros por hora.

Para o resto do experimento, monitore a integridade das células das vias aéreas por interferência diferencial. Microscopia de contraste durante todo o experimento para verificar se há sinais de danos à monocamada. Simultaneamente, siga o desenvolvimento de biofilmes de aerogênio p marcados com GFP na superfície apical das células das vias aéreas.

Ao adquirir imagens com um microscópio de fluorescência confocal invertido ou de campo amplo nos ensaios estático e de célula de fluxo, verificou-se que a monocamada de CFPE poderia suportar a presença de p aerogênio por até oito horas após a inoculação sem qualquer sinal de alteração. A integridade da monocamada epitelial pode ser avaliada por microscopia de contraste de fase usando um invertido, como mostrado por este exemplo de uma monocamada confluente de células CFPE cultivadas em placas de cultura de tecidos. Com o tempo, o arógeno p produzirá toxinas e fatores de virulência que podem danificar a monocamada da célula epitelial totalmente ou em seções.

Neste exemplo de uma monocamada CFPE comprometida, as bactérias aerogênicas P mostradas em verde são vistas se espalhando entre as junções apertadas das células epiteliais e ganhando acesso às membranas basolaterais. A formação de biofilme normalmente não é alcançada nessas condições devido à deterioração da monocamada. Esta imagem mostra um biofilme de aérgeno p crescido observado 24 horas após a inoculação após apoiar com sucesso a formação de biofilme.

A monocamada de CFPE foi danificada além do reparo e agora está praticamente ausente. O biofilme residual crescendo como uma camada plana de bactérias é mostrado preso à lamínula de cobertura. Quando a integridade da monocamada das vias aéreas não está comprometida.

Os biofilmes de aerogênio P podem se formar e se desenvolver com sucesso na superfície apical das células das vias aéreas em ambos os modelos de co-cultura. Aqui é mostrada uma imagem representativa de A GFP expressando biofilme de aerógeno p cultivado em uma monocamada confluente de células CFPE usando o modelo estático de biofilme de co-cultura avaliado por microscopia de epifluorescência. A imagem é uma sobreposição do canal de contraste da face e do canal de fluorescência.

A próxima imagem mostra A GFP rotulado como p aerogênio. Biofilme crescido por seis horas em uma monocamada confluente de células CFBE usando o modelo de biofilme de co-cultura de células de fluxo para facilitar a visualização das vias aéreas. Os núcleos de monocamada foram corados com HEXT 3 33 42 antes da inoculação com posa e aparecem na cor azul.

Os filmes que se apresentam como aglomerados verdes ligados à superfície apical das células CFPE são dispersos pelas células das vias aéreas. As estruturas típicas em forma de cogumelo de biofilmes de aerógenos de seis horas de idade formados na monocamada de células A-C-F-P-E após a reconstrução 3D são mostradas aqui. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar e visualizar com sucesso biofilmes bacterianos em uma monocamada estabelecida de células das vias aéreas usando os modelos de cocultura descritos aqui e acoplados a métodos microbiológicos padrão e microscopia de fluorescência.