Infecção de Células Epiteliais Primárias Nasais Cultivadas em Interface Ar-Líquido para Caracterizar Interações Coronavírus-Hospedeiro Humano

Os protocolos descritos aqui abordam questões-chave, como cinética de replicação, tropismo da célula hospedeira, indução imune inata e indução de citotoxicidade no epitélio nasal durante infecções por coronavírus humanos. Este protocolo permite o estudo das interações do hospedeiro do coronavírus humano em um microambiente organoide que recapitula de perto as características do epitélio nasal in vivo, incluindo sua população celular heterogênea e funções mucociliares. Esta técnica pode ser aplicada a outros sistemas de cultura de LPA, como os derivados das vias aéreas inferiores.

Além disso, o sistema pode ser usado para imitar estados de doenças clínicas, como vias aéreas asmáticas ou fibrosas císticas. Cultive e diferencie a interface ar-líquido nasal, ou culturas ALI, em transwells com uma câmara basal e uma apical. Expandir as células nasossinusais humanas dissociadas em estado submerso, após o que remover o meio da câmara apical para permitir a diferenciação das culturas em uma interface ar-líquido.

No dia anterior à infecção, lave as culturas de LPA apicalmente com solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Para fazer isso, adicione 200 microlitros de PBS aquecido no compartimento apical de cada transwell e incube a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos. Aspire o PBS e repita o processo de lavagem duas vezes.

Em seguida, substitua o meio basal por 500 microlitros de meio fresco por poço e equilibre a cultura durante a noite na temperatura de infecção pretendida. No dia seguinte, diluir o vírus em DMEM sem soro para atingir a multiplicidade desejada de infecção em um volume total de inóculo de 50 microlitros. Adicione o inóculo viral apicalmente à cultura e coloque-o de volta na incubadora por uma hora.

A cada 15 minutos durante a incubação, balance suavemente a placa para frente e para trás, bem como de um lado para o outro, segurando-a firmemente com as duas mãos para garantir uma adsorção uniforme do inóculo viral. Após a incubação, aspirar o inóculo viral e assegurar a sua remoção completa, lavando três vezes cada cultura infectada com PBS, conforme descrito anteriormente. Se desejar, colete a terceira lavagem de PBS para confirmar a remoção adequada do vírus de entrada.

Substitua o meio basal nas LPAs infectadas a cada 72 horas. Em momentos predeterminados após a infecção, adicione 200 microlitros de PBS à câmara apical de cada transwell infectado. Pipete o PBS para cima e para baixo cinco vezes para garantir a coleta máxima de vírus eliminado apicalmente e transfira todo o volume para um tubo de microcentrífuga para coletar o líquido da superfície apical, ou amostra de ASL.

Em seguida, dilua em série a amostra para quantificar a concentração de partículas virais no ASL usando um ensaio de placa viral padrão. Conforme descrito na tela, selecione o tipo de célula dependendo do coronavírus humano, ou HCoV, que está sendo titulado. Se desejar, confirme a ausência de vírus liberado basalmente por ensaio de placa de meio basal não diluído coletado em vários momentos pós-infecção.

Para medir o TEER em culturas de LPA nasal, limpe, equilibre e apague o instrumento EVOM de acordo com as instruções do fabricante. Use um transwell vazio sem células nasais para apagar e registre a medição em branco. Para lavar o meio basal residual, transfira cada transwell infectado para uma placa pré-rotulada e limpa de 24 poços contendo 500 microlitros de PBS com cálcio e magnésio em cada poço.

Em seguida, adicione 200 microlitros de PBS contendo cálcio e magnésio ao compartimento apical de cada transpoço. Adicione um mililitro de PBS contendo cálcio e magnésio à câmara de medição Endohm-6. Coloque cada transwell na câmara de medição Endohm-6 usando uma pinça e feche a câmara recolocando a tampa.

Certifique-se de que o eletrodo apical esteja submerso nos 200 microlitros de PBS no compartimento apical. O eletrodo basal permanece no fundo da câmara. Assim que a leitura do EVOM se estabilizar, registre a medição TEER bruta.

Se a titulação for desejada, colete a amostra ASL após a medição TEER. Converta as leituras TEER brutas em medições finais em ohms por centímetro quadrado usando a equação mostrada na tela. Para coronavírus humanos, ou HCoVs, avalie o TEER em intervalos de 24 ou 48 horas após a infecção.

Certifique-se de incluir um controle negativo em cada ponto de tempo. Para o controle médio ou de fundo, use PBS com a mesma composição usada para coletar a amostra ASL. Para o controle positivo, trate as culturas de ALA controle apicalmente com 200 microlitros de 2%Triton X-100.

Após incubação por 10 a 15 minutos, colete todo o volume como uma amostra de vedação Triton, seguindo o layout da placa que consiste em amostras de controle positivas Triton, amostras de controle de fundo simuladas, amostras de controle PBS e amostras experimentais. Carregue a lactato desidrogenase, ou placa LDH, em triplicata. Finalmente, calcule a porcentagem de citotoxicidade em relação ao valor de vedação de Tritão usando a equação exibida, Os títulos virais médios de eliminações apicais de culturas nasais de LPA infectadas com quatro HCoVs revelaram que cada um dos vírus se replicou produtivamente, embora SARS-CoV-2 e HCoV-229E tenham se replicado com mais eficiência.

Os títulos virais intracelulares e apicalmente eliminados do MERS-CoV foram aproximadamente os mesmos 48 horas após a infecção, ou HPI. A co-coloração das culturas infectadas com anticorpos específicos para antígenos virais e marcadores para células ciliadas ou caliciformes mostrou que o SARS-CoV-2 e o HCoV-NL63 infectaram principalmente células ciliadas, mas o MERS-CoV infectou predominantemente células caliciformes não ciliadas. A diferença no TEER desde o início até um determinado ponto de tempo pós-infecção ou delta-TEER para infecções por SARS-CoV-2 e HCoV-NL63 foi negativa em 192 HPI, ao contrário da infecção por MERS-CoV, que não resultou em nenhuma alteração significativa no TEER.

Valores delta-TEER negativos indicam danos à integridade da barreira epitelial. O HCoV-229E causou disfunção da barreira epitelial em um ponto de tempo anterior de 96 HPI, mas se recuperou para níveis simulados mais tarde na infecção. Os traços TEER que descrevem os dados brutos do TEER para cada transwell infectado ao longo do tempo permitiram a visualização das tendências do TEER ao longo da infecção.

A quantificação de LDH liberada apicalmente durante a infecção revelou que SARS-CoV-2, HCoV-NL63 e HCoV-229E causaram citotoxicidade significativa em culturas nasais, enquanto MERS-CoV não. É crucial entender a cinética de replicação viral em culturas nasais, pois elas determinam os pontos de tempo ideais para outras análises a jusante, como citotoxicidade e indução imune inata. As medições de TEER são mais informativas se feitas sequencialmente nas mesmas culturas, antes da infecção e em vários momentos após a infecção, a fim de monitorar as alterações no TEER ao longo da infecção.

Nossa pesquisa atual aplica abordagens de sequenciamento de RNA ao sistema descrito para entender as mudanças transcricionais durante infecções por coronavírus humano, bem como técnicas de ELISA para medir a produção de citocinas e outras proteínas.