Name: Assaying Toxicidade β-amilóide utilizando um transgênico C. elegans Modelo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Aprenda a ensaiar toxicidade de β-amilóide em C. elegans transgênico usando expressão induzível por temperatura em músculo. Este método permite triagem rápida de drogas e moduladores genéticos da toxicidade de Aβ in vivo.

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Gostaríamos de agradecer aos membros atuais e antigos do laboratório de ligação que ajudou a desenvolver os protocolos aqui descritos, particularmente Gin Fonte, que desenvolveu o procedimento original. Este trabalho foi suportado por concessões do NIH (AG12423) e Associação de Alzheimer (Prêmio Zenith) para CDL

1) Preparar os Suportes Nematóides placas de crescimento para ensaio de paralisia. Os ensaios são realizados paralisia no padrão Nematóides Crescimento Media (NGM) placas de rotina usado em C. elegans propagação e genética (Stiernagle, 2006). <ol><li> Autoclave a solução NGM contendo NaCl, Agar e peptona em um Erlenmeyer e adicionar as quantidades apropriadas de CaCl 2 estéril, Uracila, Colesterol, MgSO 4 e 1M 1M KPO 4. Alíquota de 10 mL de líquidos NGM em cada 60 mm x 15 mm placa de Petri. Permitir NGM para solidificar durante a noite a temperatura ambiente. </li><li> Se o teste para os efeitos de compostos / extratos, alíquota do extrato para cada placa e usar um difusor para distribuir uniformemente o extrato sobre a superfície do prato. Permitem extrair a secar durante a noite à temperatura ambiente. Volumes superiores a 1 mL vai exigir mais tempo para secar. </li><li> Ponto cada placa com 250 mL de E. coli OP5O cepa cultivadas em LB de mídia durante a noite para uma densidade óptica de 0,4-0,6. Permitir que as bactérias para secar durante a noite a temperatura ambiente. </li></ol> Variáveis ​​relevantes A idade de chapas tem um efeito significativo sobre o ensaio de paralisia, como placas mais velhas tendem a secar. Use placas derramado dentro de uma semana de ensaio de paralisia. Para resultados ideais, despeje placas 3-4 dias antes do início das populações verme síncrona [ver (2) abaixo]. Para qualquer experimento, apenas utilizar placas derramado a partir do mesmo lote. Alterando o tamanho do gramado (ou seja, manchado vs spread) e / ou o tipo de bactéria também vai alterar o comportamento dos vermes. Ensaios de paralisia pode ser realizada usando alternativa E. coli como fonte de alimento (por exemplo, a cepa HT115 utilizados na alimentação de experimentos RNAi), mas isso pode mudar a cinética de paralisia, exigindo controles internos adequados. 2) Preparação das Populações Idade-síncrona Worm Strain CL4176 (smg-1 (cc546 ts) I; dvIs27 [myo-3 / Aâ minigene + rol-6 gene marcador (su1006)] X é mais comumente usado para a dosagem Aâ induzida paralisia Esta estirpe e outros modelos transgênicos estão disponíveis. para pesquisadores acadêmicos para uma taxa nominal do Caenorhabditis Genetics Center (http://www.cbs.umn.edu/CGC/). <ol><li> Para maximizar a sincronia etária da população teste é preferível começar com uma geração sincronizado dos pais. Uma semana antes do início do ensaio paralisia da população teste, use um seletor de vermes de platina para transferir 20-30 adultos gravid para várias placas de 10 centímetros NGM espalhar com OP50 para um ovo de duas horas estava em 16 ° C (a temperatura permissivo para CL4176 ). Remove os adultos gravid e permitir que a progênie de crescer por 7 dias, época em que eles serão "segundo dia" adultos gravídico. </li><li> (Dia 1) Os adultos segundo dia gravid são usados ​​para preparar as populações em idade síncrona teste. Para cada condição experimental o objetivo é gerar placas triplicado contendo 50-75 idade síncrona worms. Usando um seletor de verme de platina, a transferência do dia 12/10 2 adultos gravid em 60 mm (10 mL de volume) placas NGM manchado com OP50. Permitirá que as minhocas para botar ovos a 16 ° C por 2 horas, em seguida, apanhar os adultos e permitir que os ovos para chocar e fazer crescer a 16 ° C. Neste ponto, é melhor ter alguém que não será marcar as placas para codificá-las, de modo que o artilheiro será cego às condições experimentais. </li></ol> Variáveis ​​relevantes O estágio de desenvolvimento embrionário, quando os ovos são colocados (~ o ​​estágio de 26 células para vermes tipo selvagem em condições ideais) é uma função da idade adulta e nutrição. Se os adultos gravid usado para a preparação da população de teste são mais velhas ou fome, ovos fase posterior serão estabelecidas, reduzindo a sincronia etária da população e da reprodutibilidade da cinética de paralisia. É essencial que mono-axênicas (ou seja, somente OP50 bactérias) culturas são utilizados (contaminantes microbianos podem afetar gravemente neste ensaio), e reprodutibilidade é maior se as placas têm triplicado número semelhante de worms. 3) Indução Transgene e Ensaio Paralisia <ol><li> (Dia 3) placas upshift a 25 ° C 48 horas após o término do ovo síncrona leigos; worms devem estar no terceiro estágio larval (L3). As placas devem ser organizados, sem empilhamento de uma incubadora de 25 ° C para permitir que todas as placas para chegar a 25 ° C, ao mesmo tempo. </li><li> (Dia 4) Comece a marcar a paralisação de worms (linhagem CL4176) entre 18-20 horas após o início da troca de marcha. Neste ponto, todos os worms na população deve ter alcançado o quarto larval (L4) palco. Continuar a marcar em duas horas até que todos os incrementos de worms em cada uma das placas estão paralisados. Por razões desconhecidas, a paralisia não é nem mesmo todo o comprimento do corpo: a região da cabeça é a última parte do worm para cessar em movimento. Assim, wORMs que recentemente iniciou a paralisia não pode traduzir através da placa, mas pode mover a cabeça, abrindo assim as bactérias em torno de seu anterior e deixando um "halo" de bactérias limpo. Estes worms invariavelmente tornam-se completamente paralisado e, portanto, worms com halos são categorizados como paralisado. Alguns worms não terá halos, mas também não mostram movimento espontâneo, que são testados pela insistência com o selecionador de worm. Se um verme prodded não pode sofrer uma propagação de ondas de corpo inteiro em cima prodding, é também classificada como paralisado. Para marcar eficiente, é mais fácil para mover o worms paralisado para um sector sem mácula da placa de modo que não serão involuntariamente recodificados o período de pontuação próxima. (Isso também permite que mis-categorizado worms para demonstrar movimento, permitindo uma correção de pontuação). </li><li> Para gerar uma curva de paralisia, em cada momento a fração de worms em cada prato que não tenham sido paralisado é convertido em um percentual, ea média percentual "unparalyzed" é plotado contra o tempo desde o início upshift. (A justificativa para traçar desta forma é que a curva resultante é formalmente análogo a uma curva de sobrevivência e, portanto, podem ser analisados ​​usando estatísticas padrão não-paramétricos de sobrevivência.) </li></ol> Variáveis ​​relevantes O upshift de vermes myo-3/Aβ transgênicos deve ocorrer antes que eles atinjam o estágio L4 meados de paralisia para ser iniciada, como o mio-3 promotor é developmentally regulamentada, e reduziu significativamente a expressão em L4 tarde ou vermes adultos. Da mesma forma, a expressão deste transgene é bloqueado se tornar worms fome, por isso é essencial que os vermes estão bem alimentados durante o experimento. Nós nunca observamos um verme paralisado para recuperar sob quaisquer condições, e depois de 12-16 horas de troca de marcha, todos os vermes vão paralisar CL4176, mesmo que sejam downshifted a 16 ° C. Na linhagem CL4176, upregulation suficiente de expressão do transgene para causar paralisia pode ocorrer a temperaturas mais baixas (ie, 20-25 ° C), embora o tempo de paralisia será alterado. A taxa de paralisia depende da cepa específica transgénicos utilizados (temos construído com as duas cepas myo-3/Aβ taxas mais rápidas e mais lentas do que CL4176), assim com cepas alternativa a janela de pontuação pode precisar de ser ajustada. 4) Resultados Representante Mostrado na Figura 1 é um gráfico de uma curva de paralisia por CL4176, ambos não tratada e exposta a 6,27 mM cafeína (concentração final na placa NGM). Este tratamento resulta em um atraso altamente significante na paralisia de aproximadamente 4 horas, o que nós interpretamos como indicativo de supressão de toxicidade Aâ neste modelo. Mostrado na Figura 2 é um experimento independente assaying os efeitos da cafestol, um outro composto encontrado no café. Este enredo é típico para os tratamentos que não têm impacto toxicidade Aâ. Note que em ambos os experimentos cerca de metade dos tratados CL4176 populações estão paralisados ​​às 24 horas, e paralisia é completa por 28 hr. Estes são os prazos típicos para a paralisia do controle CL4176 populações. Desvios significativos deste momento são indicativos de alteração das condições ambientais ou de eliminação espontânea de cópias do transgene. (CL4176 contém uma matriz cromossomicamente integrado transgênica com várias cópias do transgene myo-3/Aβ. Embora esta matriz transgênicos é normalmente bastante estável, a propagação da estirpe a temperaturas&gt; 16 ° C irá selecionar para worms raro que sofreram uma eliminação espontânea de transgenes, resultando em variantes que terão reduzida expressão Aâ e resultados mais lento paralisia.) <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Curva de paralisia para a cepa CL4176 worms não tratada ou expostos à cafeína 6,27 mM (Sigma). Os tempos indicados são do início do upshift temperatura. Barras de erro = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Bares curva de paralisia por CL4176 worms expostos a 0,48 mM cafestol (Sigma). Error = SEM

<ol><li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer%27s+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li>
<li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li>
<li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid+beta-peptide+%281-42%29+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li>
<li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li>
<li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li>
<li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li>
<li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo que temos descrito pode ser efetivamente usado para ensaio dos efeitos de compostos de toxicidade Aâ. Exemplos publicados incluem os efeitos dos constituintes Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) e reserpina (Arya et al. 2009). Compostos que têm sido de proteção contra a toxicidade Aâ em outros sistemas também foram mostrados para ser protetor neste modelo (por exemplo, a memantina, nossos resultados não publicados). Uma lógica importante para o estabelecimento deste modelo é que as ferramentas bem desenvolvidas genética e molecular disponíveis em C. elegans pode ser usado para investigar os mecanismos de toxicidade Aâ. Assim, as mutações efeitos específicos sobre a toxicidade Aâ puderem ser analisadas (por exemplo, o efeito de reduzir insulin-like de sinalização através da introdução de uma daf-2 mutação de perda de função, Florez-McClure et al. 2007), e este modelo também pode ser usado para examinar os efeitos da sobre-expressão transgenes (Fonte et al. 2008). Recentemente, fez uso extensivo desse modelo para examinar os efeitos sobre a toxicidade de uma única substituições de aminoácidos na Aâ (dados não publicados). O modelo aqui descrito transgênicos ensaios o efeito de expressão Aâ aguda sobre a função das células musculares. No momento de células paralisia muscular e seus sarcômero estão intactos; o fenótipo paralisia não é o resultado de morte celular do músculo. No entanto, após a paralisia (~ 48 hr após upshift inicial) há uma ruptura da integridade muscular e eventual morte dos vermes. Nós não investigamos o efeito a jusante de expressão Aâ ou usado como um marcador de toxicidade. O modelo de expressão induzível Aâ descrito aqui não é apropriado para a investigação de tratamentos que modulam a β-amilóide formação de per se. Embora vermes transgênicos com forma constitutiva Aâ expressão depósitos de amilóide facilmente detectável (Fay et al 1998;.. Ligação et al 2001), worms transgênicos com a expressão induzível Aâ raramente têm depósitos de amilóide eo fenótipo paralisia aparece independente de amilóide (Drake et al. 2003). Nossos resultados são consistentes com a visão de que a toxicidade aguda de resultados Aâ induzida expressão da acumulação de Aâ oligomérico solúvel, não amilóide.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagentes </td><td> Quantity/2L </td><td> Empresa / Catálogo # </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> Sigma-Aldrich / S9888 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> 40g </td><td> Sigma-Aldrich / A7002 </td><td></td></tr><tr><td> Peptona </td><td> 5g </td><td> Sigma-Aldrich / P0556 </td><td></td></tr><tr><td> 2 O DDH </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 1M </td><td> 2mL </td><td></td><td> 147.02mg/mL em DDH 2 O </td></tr><tr><td> Uracil </td><td> 2mL </td><td></td><td> 2mg/ml em DDH 2 O </td></tr><tr><td> Colesterol </td><td> 2mL </td><td></td><td> 5mg/mL em etanol (não autoclave) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2mL </td><td></td><td> 246.5mg/mL em DDH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50mL </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. ML, 48mg K2HPO4/mL em DDH 2 O, pH </td></tr><tr><td> Erlenmeyer </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying toxicidade β-amilóide utilizando um transgênico c. elegans modelo

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Acúmulo do peptídeo β-amilóide (Aâ) é acreditado geralmente para ser central para a indução da doença de Alzheimer, mas o mecanismo relevante (s) de toxicidade ainda não estão claros. Aâ também é depositado por via intramuscular em Miosite Inclusão Corpo, uma miopatia severa humana. A intensamente estudada nemátodo Caenorhabditis elegans worm pode ser projetado para expressar transgenicamente Aâ humana. Dependendo do tecido ou o momento de expressão Aâ, worms transgênicos podem ter fenótipos facilmente mensuráveis, que servem como uma leitura de toxicidade Aâ. Por exemplo, worms transgênicos com pan-neuronal expressão Aâ têm defeitos é aprendizagem associativa (Dosanjh et al 2009.), Enquanto worms transgênicos com constitutiva músculo-específicos expressão mostram uma progressiva, dependente da idade fenótipo paralisia (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Um C. particularmente útil elegans modelo emprega uma mutação sensível à temperatura no sistema de vigilância mRNA para engenheiro de temperatura induzida por expressão de um transgene muscular Aâ, resultando em um fenótipo paralisia reprodutíveis sobre upshift temperatura (Link et al. 2003). Tratamentos que a toxicidade Aâ contra neste modelo [por exemplo, a expressão de um transgene de proteção (Hassan et al. 2009) ou exposição a extratos de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] reproducibly alterar a taxa de paralisia induzida por upshift temperatura desses transgênicos worms. Aqui nós descrevemos nosso protocolo para medir a taxa de paralisia neste C. transgênicos elegans modelo, com particular atenção às variáveis ​​experimentais que podem influenciar esta medida.

O verme nematóide intensamente estudada<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Pode ser transgenicamente projetadas para expressar o peptídeo β-amilóide humana (Aâ). Expressão induzida de Aâ em<em&gt; C. elegans</emMuscular&gt; leva a uma rápida paralisia fenótipo, reproduzível que pode ser usado para monitorar tratamentos que modulam a toxicidade Aâ.

Assaying Toxicidade β-amilóide utilizando um transgênico C. elegans Modelo

Acredita-se, geralmente, que o acúmulo do peptídeo beta-amiloide (A&beta;) seja central para a indução da doença de Alzheimer, mas a relevância...

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a toxicidade do peptídeo beta amiloide em um sistema modelo InVivo. A reprodutibilidade e a relativa simplicidade deste ensaio permitem a realização rápida de testes de fármacos, condições ambientais ou modificações genéticas sobre a toxicidade do beta amiloide. Um fator fundamental no desenvolvimento deste ensaio é a geração de vermes transgênicos de C. elegans com expressão induzível por temperatura específica de músculo do peptídeo beta amiloide.Essa expressão sensível à temperatura é criada por meio da construção de um transgene que contém uma região não traduzida três prima anormalmente longa, tornando o RNA mensageiro do transgene um alvo do sistema de vigilância de RNA mensageiro. A expressão desse transgene é, portanto, baixa em vermes selvagens com um sistema de vigilância de RNA mensageiro funcional, devido à degradação do RNA mensageiro do transgene. Se esse transgene for introduzido em um contexto genético que contenha uma mutação em um componente essencial do sistema de vigilância de RNA mensageiro, a expressão do transgene será significativamente maior. Se o contexto genético contiver uma mutação sensível à temperatura no sistema de vigilância de RNA mensageiro, então a propagação dessa linhagem transgênica na temperatura não permissiva bloqueará a degradação do RNA mensageiro do transgene e resultará em alta expressão do transgene. Vermines transgênicos que utilizam esse sistema para regular a expressão no músculo da parede corporal do peptídeo beta amilóide: a elevação da temperatura de 16 graus Celsius para 25 graus Celsius resulta na alta acumulação do peptídeo beta amilóide, disfunção das células musculares e paralisia dos vermes. Medição do tempo.É necessária uma população desses vermes trenchgênicos para que fiquem paralisados após a elevação da temperatura. O teste de sensibilidade à toxicidade do beta amiloide é um ensaio sensível. Isso é conseguido preparando placas frescas de meio de crescimento para nematoides para o ensaio de paralisia, o que ajuda a minimizar variáveis ambientais que possam influenciar as taxas de paralisia.Como segundo passo, populações sincronizadas por idade de vermes transgênicos são iniciadas, o que minimiza os efeitos do estágio de desenvolvimento sobre a expressão do transgene. Em seguida, vermes sincronizados no terceiro estágio larval são transferidos de 16 graus Celsius para 25 graus Celsius, aumentando a estabilidade do mRNA do transgene e levando ao acúmulo do peptídeo beta amiloide. A medição do tempo entre a transferência e a paralisia de cada verme captura a taxa de disfunção muscular, permitindo assim avaliar os efeitos tóxicos do acúmulo do peptídeo beta amiloide; os resultados obtidos demonstram o efeito de tratamentos específicos sobre a toxicidade do peptídeo beta amiloide expresso endogenamente.Portanto, a principal vantagem da nossa técnica, em comparação com o uso de modelos de camundongos transgênicos para avaliar a atividade de fármacos, é que podemos realizá-la de forma muito mais rápida e muito menos onerosa. A demonstração visual deste método é fundamental. A pontuação de vermes L4 em um ensaio de paralisia é muito difícil de aprender.Portanto, ao avaliar um verme paralisado L4, o que se deve observar é o movimento isolado em forma de halo na região da cabeça do verme. Quando essa região estiver em movimento e todo o corpo do verme estiver paralisado, considera-se o verme como paralisado. Os ensaios de paralisia são realizados em placas de meio de crescimento nematódio padrão, ou meio NGM, comumente utilizado para a propagação e estudos genéticos de C. elegans.Para preparar as placas autoclavadas, autoclave a solução de NGM contendo cloreto de sódio, ágar e peptona em um frasco erlenmeyer, depois adicione as quantidades apropriadas das seguintes soluções estéreis que podem ser encontradas no protocolo escrito em anexo. Aliquote 10 mililitros de NGM líquido em cada placa de Petri de 60 milímetros por 15 milímetros. Deixe o NGM solidificar durante a noite à temperatura ambiente.Se estiver testando os efeitos de compostos ou extratos, alíquota o extrato em cada placa e use um espalhador para distribuí-lo uniformemente sobre a superfície da placa. Deixe as placas secarem durante a noite à temperatura ambiente. Volumes superiores a um mililitro exigirão mais tempo para secar.Em seguida, aplique em cada placa 250 microlitros da linhagem de E. coli OP50 cultivada em meio LB durante a noite até uma densidade óptica de 0,4 a 0,6, e deixe as bactérias secarem durante a noite à temperatura ambiente. A idade da placa tem um efeito significativo na taxa de paralisia, e, por isso, placas mais antigas tendem a ressecar. As placas devem ser preparadas até uma semana antes do ensaio de paralisia.Idealmente, você deve usar placas que tenham sido preparadas de três a quatro dias antes. As placas para coleta sincronizada de ovos utilizadas em qualquer experimento devem todas vir do mesmo lote. Alterar o tamanho da lawn e/ou a bactéria também modificará o comportamento dos vermes. Ensaios de paralisia podem ser realizados usando cepas alternativas de E. coli. Por exemplo, HT115 é usada em experimentos de RNAi. No entanto, isso pode alterar a cinética do ensaio de paralisia.Portanto, você deve usar controles internos que sejam cepas apropriadas. A cepa CL 476 é a mais comumente utilizada para ensaiar uma paralisia induzida por beta. Essa cepa e outros modelos transgênicos estão disponíveis para pesquisadores acadêmicos por uma taxa simbólica no Centro Genético Saint Ahadi.Para maximizar a sincronia etária da população-teste, é preferível iniciar com uma geração parental sincronizada. Uma semana antes de iniciar o ensaio de paralisia da população-teste, utilize um coletor de vermes de platina para transferir de 20 a 30 adultos gravidos para várias placas de NGM de 10 centímetros.Espalhe com OP 50 para postura de ovos de duas horas a 16 graus Celsius, que é a temperatura permissiva para CL 4 1 76. Remova os adultos GR e permita que a prole cresça por sete dias, período em que atingirão a fase de adultos gravídicos do segundo dia. Segundo dia de gravidez.Adultos são utilizados para preparar populações-teste sincronizadas por idade para cada condição experimental. O objetivo é gerar placas em triplicata contendo 50 a 75 vermes sincronizados por idade, utilizando um coletor de vermes de platina. Transfira 10 a 12 adultos do segundo dia para placas NGM de 60 milímetros com manchas de OP50. Deixe os vermes depositarem ovos a 16 graus Celsius por duas horas, depois remova os adultos e permita que os ovos eclosionem e cresçam a 16 graus Celsius.Neste momento, é preferível que alguém que não irá pontuar as placas as codifique, de modo que a pontuação seja cega em relação às condições experimentais. O estágio de desenvolvimento embrionário no qual os ovos são postos, que é aproximadamente o estágio de 26 células para vermes selvagens em condições ideais, depende da idade e nutrição dos adultos. Se os adultos expostos à gravidade utilizados para a postura de ovos forem mais velhos ou estiverem privados de alimento, ovos em estágios mais avançados serão postos e a população sincrônica não será obtida, afetando assim a cinética do ensaio de paralisia.É essencial usar culturas bacterianas monogênicas, como e coli, OP 50, porque qualquer contaminação bacteriana pode afetar gravemente este ensaio. A reprodutibilidade é maior se suas placas triplicadas tiverem um número semelhante de vermes para induzir o transgene e realizar o ensaio de paralisia. Eleve as placas para 25 graus Celsius.48 horas após o término da postura sincronizada de ovos, os vermes devem estar no terceiro estágio larval. As placas devem ser organizadas sem empilhamento em um incubador a 25 graus Celsius para permitir que as placas atinjam essa temperatura. Ao mesmo tempo, inicie a avaliação da paralisia dos vermes de 18 a 20 horas após o aumento de temperatura ter sido iniciado.Neste ponto, todos os vermes da população devem ter atingido o quarto estágio larval; continue a avaliação em incrementos de duas horas até que todos os vermes em cada placa estejam paralisados. Por razões desconhecidas, a paralisia não é uniforme ao longo do comprimento do corpo. A região da cabeça é a última parte do verme a deixar de se mover.Assim, vermes que recentemente iniciaram a paralisia não conseguem se deslocar pela placa, mas podem mover suas cabeças, removendo as bactérias ao redor da região anterior e deixando um halo de bactérias eliminadas. Esses vermes inevitavelmente ficarão completamente paralisados e, portanto, os vermes com halos são caracterizados como paralisados. Alguns vermes não terão halos, mas também não apresentarão movimento espontâneo.Esses são testados empurrando-os com o coletor de vermes. Se um verme empurrado não puder realizar a propagação completa da onda corporal após o estímulo, ele também é classificado como paralisado para uma pontuação eficiente. É mais fácil mover os vermes paralisados para um setor não marcado da placa para que não sejam reavaliados acidentalmente no próximo período de pontuação.Isso também permite que vermes mal classificados demonstrem movimento, possibilitando uma correção na pontuação para gerar uma curva de paralisia. Em cada ponto temporal, a fração de vermes em cada placa que ainda não foram paralisados é convertida em uma porcentagem, e a porcentagem média não paralisada é representada graficamente em função do tempo a partir do momento em que a elevação de temperatura foi iniciada. A curva resultante é formalmente análoga a uma curva de sobrevida e, portanto, pode ser analisada utilizando estatísticas não paramétricas padrão de sobrevida.O deslocamento para cima dos vermes transgênicos myo three A beta deve ser realizado até a fase média de L quatro para que a paralisia seja iniciada. O promotor Myo three é regulado durante o desenvolvimento. Uma vez que os vermes atingiram o estágio tardio de L quatro ou a fase adulta, o nível de expressão foi significativamente reduzido.A expressão do transgene é bloqueada se os vermes forem privados de alimento, portanto é muito essencial que os vermes sejam bem alimentados durante todo o experimento. Nunca observamos um verme paralisado se recuperar sob qualquer condição. Após 12 a 16 horas de aumento de temperatura, CL 41 76 ficará paralisado, independentemente de você reduzir a temperatura para 16 graus na linhagem; a superexpressão da expressão do transgene que causa paralisia pode ocorrer em temperaturas mais baixas.No entanto, observe que a taxa de paralisia será afetada em seu momento. A taxa de paralisia depende da linhagem transgênica específica utilizada. Construímos três linhagens de myo com A beta que apresentam uma taxa de paralisia mais rápida e mais lenta do que a CL 41 76, e, portanto, você precisará ajustar sua janela de avaliação para o ensaio de paralisia de acordo com isso.Mostrado aqui está um gráfico de uma curva de paralisia para CL 4 1 76, tanto não tratado quanto exposto à cafeína 6,27 milimolar. Esse tratamento resulta em um atraso altamente significativo estatisticamente na paralisia de aproximadamente quatro horas, o que interpretamos como indicativo da supressão de uma toxicidade beta. Neste modelo, este experimento avaliou os efeitos de ol outro composto encontrado no café.O gráfico é típico para tratamentos que não afetam a toxicidade beta. Observe que em ambos os experimentos, cerca de metade das populações não tratadas de CL 4 1 76 estão paralisadas após 24 horas e a paralisia é completa em 28 horas. Esses são os intervalos de tempo típicos para a paralisia do controle.Populações CL 4 1 7 6 com desvios significativos em relação a esse tempo indicam condições ambientais alteradas ou deleção espontânea de cópias do transgene. Consulte o protocolo associado para obter informações adicionais sobre a linhagem CL 4 1 76. Ao realizar este procedimento, é importante ter em mente a idade das placas, o estágio da população de vermes e a capacidade de quantificar a taxa de paralisia dos vermes.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar este sistema com *C. elegans* para avaliar cuidadosamente a toxicidade do beta amiloide. Você deverá ser capaz de detectar efeitos bastante sutis dessa toxicidade provocados por diversos tratamentos ambientais ou farmacológicos. As variáveis que discutimos são importantes para se atentar, pois isso permitirá que você realize o ensaio de forma altamente reprodutível e com cinética de paralisia consistente.Isso é na verdade muito importante se você deseja comparar seus resultados obtidos em seu laboratório em diferentes momentos por diferentes pessoas, ou comparar seus resultados com os de outros pesquisadores que utilizam este sistema modelo.

assaying-amyloid-toxicity-using-a-transgenic-c-elegans-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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