Assaying Toxicidade β-amilóide utilizando um transgênico C. elegans Modelo

O objetivo geral do experimento a seguir é testar a toxicidade do peptídeo beta amilóide em um sistema modelo InVivo. A reprodutibilidade e a relativa simplicidade deste ensaio permitem testes rápidos de medicamentos, condições ambientais ou modificações genéticas na toxicidade da beta-amiloide. Um fator chave no desenvolvimento deste ensaio é a geração de vermes transgênicos de cl egan com expressão induzível por temperatura específica do músculo do peptídeo beta amilóide.

Essa expressão sensível à temperatura é projetada pela construção de um transgene que contém uma região não traduzida de três primos anormalmente longa, tornando o mRNA do transgene um alvo da expressão de vigilância de mRNA desse transgene é, portanto, pobre em vermes do tipo selvagem com um sistema de vigilância de mRNA funcional devido à degradação do mRNA do transgene. Se esse transgene for introduzido em um fundo genético que contenha uma mutação em um componente essencial do sistema de vigilância de mRNA, a expressão do transgene será significativamente maior. Se o fundo genético contiver uma mutação sensível à temperatura no sistema de vigilância de mRNA, a propagação dessa cepa trenchgenic na temperatura não permissiva bloqueará a degradação do mRNA do gene da trincheira e resultará em alta expressão do gene trench empregando este sistema para regular a expressão muscular da parede corporal do aumento da temperatura do peptídeo beta amilóide de 16 graus Celsius para 25 graus Celsius, resulta em alto acúmulo do peptídeo beta amilóide, disfunção das células musculares e paralisia dos vermes, medição do tempo.

É preciso uma população desses vermes trincheirosos para ficar paralisada após a temperatura. Upshift é um ensaio sensível para toxicidade beta amilóide. Isso é conseguido fazendo placas de meio de crescimento de nematóides frescos para o ensaio de paralisia, o que ajuda a minimizar as variáveis ambientais que podem influenciar as taxas de paralisia.

Como segundo passo, populações sincronizadas com a idade de vermes trenchgenic ou iniciados, minimiza os efeitos do estágio de desenvolvimento na expressão do transgene. Em seguida, os sincronizados do terceiro estágio larval são aumentados de 16 graus Celsius para 25 graus Celsius, aumentando a estabilidade do mRNA do transgene e levando ao acúmulo do peptídeo beta amilóide. Medir o tempo desde a mudança de marcha até a paralisia para cada verme captura a taxa de disfunção muscular, testando assim os efeitos tóxicos do acúmulo de peptídeo beta amilóide são obtidos resultados que mostram o efeito de tratamentos específicos na toxicidade do peptídeo beta amilóide expresso endogenamente.

Portanto, a principal vantagem de nossa técnica, em vez de usar modelos de camundongos transgênicos para testar a atividade da droga, é que podemos fazer a nossa muito mais rapidamente e com muito menos custo. A demonstração visual desse método é crítica. A pontuação de L quatro vermes em um ensaio de paralisia é muito difícil de aprender.

Então, quando você está marcando um verme L quatro paralisado, o que você quer ver é o movimento isolado do halo da região da cabeça do verme. Uma vez que ele esteja se movendo e todo o corpo do verme esteja paralisado, classificaríamos esse verme como paralisado. Os ensaios de paralisia são realizados em placas de meios de crescimento de nematóides padrão ou NGM usados rotineiramente para propagação e genética de CL egan.

Para preparar placas em autoclave, a solução NGM contendo cloreto de sódio, ágar e peptídeo em um frasco erlenmeyer e, em seguida, adicione as quantidades apropriadas das seguintes soluções estéreis que podem ser encontradas no protocolo escrito que acompanha. Alíquota de 10 mililitros de NGM líquido em cada placa de Petri de 60 milímetros por 15 milímetros. Deixe o NGM solidificar durante a noite à temperatura ambiente.

Se testar os efeitos de compostos ou extratos, alíquota do extrato em cada placa e use um espalhador para distribuí-lo uniformemente sobre a superfície da placa. Deixe as placas secarem durante a noite em temperatura ambiente. Volumes acima de um mililitro exigirão mais tempo para secar.

Em seguida, localize cada placa com 250 microlitros de e coli cepa OP 50 cultivada em meio LB durante a noite a uma densidade óptica de 0,4 a 0,6, permitindo que as bactérias sequem durante a noite em temperatura ambiente. A idade da placa tem um efeito significativo na taxa de paralisia e, como tal, as placas mais antigas tendem a secar. As placas devem ser derramadas dentro de uma semana após o ensaio de paralisia.

Idealmente, você deseja usar placas que foram derramadas três a quatro dias antes de suas placas síncronas de postura de ovos usadas em qualquer experimento, devem todas vir do mesmo lote, alterando o tamanho do gramado e/ou as bactérias também alterarão o comportamento dos vermes. Por exemplo, HT one 15 é usado em experimentos de RNAi. No entanto, isso pode alterar a cinética do ensaio de paralisia.

Portanto, você deve usar controles internos que sejam apropriados para a tensão. CL 476 é mais comumente usado para testar uma paralisia induzida por beta. Esta cepa e outros modelos transgênicos estão disponíveis para pesquisadores acadêmicos por uma taxa nominal do Saint Ahadi Genetic Center.

Para maximizar a sincronia de idade da população de teste, é preferível. Comece com uma geração parental sincronizada. Uma semana antes de iniciar o ensaio de paralisia da população de teste, use um coletor de vermes de platina para transferir 20 a 30 adultos graves para várias placas NGM de 10 centímetros.

Espalhe com OP 50 por duas horas a 16 graus Celsius, que é a temperatura permissiva para CL 4 1 76. Remova os adultos GR e permita que a progênie cresça por sete dias, quando eles serão adultos graves no segundo dia. Gravidade do segundo dia.

Os adultos são usados para preparar as populações de teste síncronas de idade para cada condição experimental. O objetivo é gerar placas triplicadas contendo 50 a 75 vermes síncronos de idade usando um selecionador de minhoca de platina Transfira 10 a 12 do dia, dois adultos mais graves em placas NGM de 60 milímetros manchadas com OP 50. Deixe os vermes botarem ovos a 16 graus Celsius por duas horas, depois retire os adultos e deixe os ovos eclodirem e crescerem a 16 graus Celsius.

Neste ponto, é melhor ter alguém que não pontuará as placas para codificá-las para que a pontuação seja cega para as condições experimentais. O estágio de desenvolvimento embrionário quando os ovos são postos, que é aproximadamente o estágio de 26 células para vermes do tipo selvagem em condições ideais, é uma função da idade adulta e da nutrição. Se os adultos de gravidade usados para a postura dos ovos forem mais velhos ou morrerem de fome, os ovos de estágio posterior serão postos e a população síncrona não será alcançada, afetando assim a cinética do ensaio de paralisia.

É essencial que culturas bacterianas monogênicas, como e coli, OP 50, sejam usadas porque a contaminação bacteriana de qualquer tipo pode afetar gravemente este ensaio. A reprodutibilidade é maior se suas placas triplicadas tiverem um número semelhante de vermes Para induzir o transgene e realizar o ensaio de paralisia. Aumente as placas para 25 graus Celsius.

48 horas após o término do verme síncrono da postura de ovos deve estar no terceiro estágio larval. As placas devem ser dispostas sem empilhamento em uma incubadora de 25 graus Celsius para permitir que as placas atinjam essa temperatura. Ao mesmo tempo, comece a marcar a paralisia dos vermes 18 a 20 horas após o início da mudança de marcha.

Neste ponto, todos os vermes da população devem ter atingido o quarto estágio larval, continuar marcando em incrementos de duas horas até que todos os vermes em cada uma das placas estejam paralisados. Por razões desconhecidas, a paralisia não é uniforme em todo o comprimento do corpo. A região da cabeça é a última parte do verme a parar de se mover.

Assim, os vermes que iniciaram recentemente a paralisia não podem se traduzir através da placa, mas podem mover suas cabeças, eliminando assim as bactérias ao redor de sua parte anterior e deixando um halo de bactérias eliminadas. Esses vermes invariavelmente ficarão completamente paralisados e, portanto, os vermes com halos são caracterizados como paralisados. Alguns vermes não terão halos, mas também não mostrarão movimento espontâneo.

Estes são testados cutucando-os com o seletor de minhocas. Se um verme cutucado não puder sofrer propagação de onda de corpo inteiro ao cutucar, ele também será classificado como paralisado para pontuação eficiente. É mais fácil mover os vermes paralisados para um setor não manchado da placa para que eles não sejam remarcados involuntariamente no próximo período de pontuação.

Isso também permite que vermes categorizados incorretamente demonstrem movimento, permitindo que uma correção de pontuação gere uma curva de paralisia. Em cada ponto de tempo, a fração de vermes em cada placa que não foi paralisada é convertida em uma porcentagem, e a porcentagem média não comparada é plotada em relação ao tempo a partir do momento em que a mudança de marcha foi iniciada. A curva resultante é formalmente análoga a uma curva de sobrevivência e, portanto, pode ser analisada usando estatísticas de sobrevivência não paramétricas padrão.

A mudança de marcha dos vermes transgênicos myo three A beta deve ser realizada em meados do estágio L quatro para que a paralisia seja iniciada. O promotor Myo três é regulado pelo desenvolvimento. Uma vez que os vermes atingiram o final da idade adulta ou a idade adulta, o nível de expressão diminuiu significativamente.

A expressão do transgene é bloqueada se os vermes morrerem de fome, por isso é muito essencial que os vermes sejam bem alimentados durante todo o experimento. Nunca observamos um verme paralisado se recuperar sob qualquer condição. Após 12 a 16 horas de mudança para cima, CL 41 76 ficará paralisado, independentemente de você reduzir para 16 graus de tensão, a regulação positiva de CL 41 76 da expressão do transgene que causa paralisia pode ocorrer em temperaturas mais baixas.

No entanto, observe que a taxa de paralisia será afetada em seu tempo. A taxa de paralisia depende da cepa transgênica específica usada. Construímos três cepas beta A que têm uma taxa de paralisia mais rápida e mais lenta do que a CL 41 76 e, como tal, você precisa ajustar sua janela de pontuação para o ensaio de paralisia de acordo.

Aqui é mostrado um gráfico de uma curva de paralisia para CL 4 1 76, não tratada e exposta a cafeína 6,27 milimolar. Este tratamento resulta em um atraso altamente estatisticamente significativo na paralisia de aproximadamente quatro horas, o que interpretamos como indicativo de supressão de uma toxicidade beta. Neste modelo, este experimento testou os efeitos de outro composto encontrado no café.

O gráfico é típico para tratamentos que não afetam a toxicidade beta. Observe que em ambos os experimentos, cerca de metade das populações de CL 4 1 76 não tratadas ficam paralisadas em 24 horas e a paralisia é concluída em 28 horas. Estes são prazos típicos para paralisia de controle.

CL 4 1 7 6 populações desvios significativos desse tempo são indicativos de condições ambientais alteradas ou deleção espontânea de cópias do transgene. Consulte o protocolo anexo para obter informações adicionais sobre a cepa CL 4 1 76. Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente a idade das placas, o estágio da população de vermes e a capacidade de pontuar a taxa de paralisia dos vermes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como usar este sistema de elgan do mar para testar cuidadosamente a toxicidade beta amilóide. Você deve ser capaz de detectar efeitos bastante sutis sobre essa toxicidade de uma variedade de tratamentos ambientais ou medicamentosos. É importante prestar atenção às variáveis sobre as quais falamos, pois isso permitirá que você faça o ensaio de forma muito reprodutível e com uma cinética de paralisia consistente.

Isso é realmente muito importante se você quiser comparar seus resultados feitos em seu laboratório em momentos diferentes por pessoas diferentes, ou comparar seus resultados com outros pesquisadores usando este sistema modelo.