Name: De Alta Eficiência Transdução de células de câncer de fígado por recombinante sorotipo de vírus adeno-associado 3 Vetores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 2 s
Description: Aprenda a produzir vetores AAV3 para transduzir células de câncer de fígado humano com alta eficiência. Este protocolo detalhado utiliza células 293 e microscopia de fluorescência para validar a expressão de EGFP.

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Agradecemos a drs. R. Jude Samulski e Xiao Xiao para os presentes o seu tipo de AAV3 recombinante e AAV-EGFP plasmídeos, respectivamente, e Gail Dr. Tomlinson para generosamente fornecimento de células Hep293TT. Esta pesquisa foi suportada em parte pelo Serviço de Saúde Pública conceder bolsas R01 HL-076901, R01 HL-097088, e P01 DK-058327 (Projeto 1) do National Institutes of Health (para AS).

1. Embalagem de adeno-associados recombinantes do vírus sorotipo 3 (rAAV3) Vetores <ol><li> Acesse o site: " <a href="http://www.geguchadze.com/calc">http://www.geguchadze.com/calc</a> "e calcular a quantidade de DNA. </li><li> Pré-mix plasmídeos pHelper (helper Adenovirus), pACG2c3 (AAV helper) e pdsAAV-CB-EGFP (rAAV vector) em meio sem SFB e antibióticos. Volume total deve ser 8.750 mL por dez placas de 15 cm 2. </li><li> Adicionar diretamente mL de 1250 PEI (0,1% m / v, Polysciences, Cat # 23966, pH 4.5) na solução de DNA no Passo 1.2. Vortex solução do DNA-PEI por alguns segundos. </li><li> Incubar solução DNA-PEI para formar um complexo de 5 min à temperatura ambiente (RT). </li><li> Adicionar 1 mL de DNA-PEI solução por 15 cm 2 chapa. </li><li> Remova o meio após 4 horas, substituindo com fresca média de 25 mL completa 10% FBS (C-DMEM). </li><li> Setenta e duas horas após a transfecção, as células raspar e despeje em um tubo de centrífuga de 250 mL cônico. </li><li> Giram a 3000 rpm, a 4 ° C por 10 min. Deitar fora o sobrenadante. </li><li> Re-suspender o pellet celular em 5 mL de RB TMS Buffer (pH 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 8,0). Transferência para um novo tubo de 15 mL cônico. </li><li> Congelamento em banho de gelo-seco de etanol por 10 min e descongelamento a 37 ° C por 10 min. Repita três vezes. </li><li> Adicionar 1 mL de 4,8 M MgCl 2 e 2 mL de Benzonase (25 U / mL, Novagen, Cat # 70664-3). Vortex e incubar em 37 ° C por 40 min. </li><li> Girar a 4.000 rpm, a 4 ° C por 40 min e coletar o sobrenadante (lisado clarificado). </li><li> Em um tubo de centrífuga de 13 mL Seal-rápida (Beckman, Cat # 342413), o gradiente de carga iodixanol (OptiPrep, Cat # 1114542) de cima para baixo: 2 mL de 15%, 2 mL de 25%, 1,5 mL de 40% e 1,5 mL de iodixanol 60%. Carregar o sobrenadante (Passo 1.12) na parte superior do gradiente iodixanol. Encher os tubos com RB buffer TMS. </li><li> Centrifugar a 75.000 rpm por 1 hora a 16 ° C utilizando rotor Beckman 90TI. </li><li> Recolher a fração iodixanol 40% através da inserção de uma seringa no limite de 40-60%. </li><li> Alienar a fração iodixanol 40% em um tubo de 50 mL cônica e fazer até 40 mL com tampão A. (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5) </li><li> Montar o aparelho de filtração utilizando HiTrap Q coluna HP (GE Healthcare, Cat # 17-1154-01). Lavar a coluna com o tampão seguinte: 25 mL de tampão A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5);; 25 mL de tampão B (10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,5), 50 mL de tampão A 40 mL de amostra de vírus em tampão A; 50 mL de tampão A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5);; 20 mL de tampão C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5) </li><li> Colete C em um tampão de 20 mL Apollo Concentradores (Orbital Biosciences). Centrifugar a 3.000 rpm, a 4 ° C por 10 min. </li><li> Descartar o fluxo através de e adicionar 20 mL de PBS refrigerado e centrifugar a 3.000 rpm, a 4 ° C por 10 min. </li><li> Descartar o fluxo através de e adicionar 500 mL de PBS gelado. Lavar os vetores fora da membrana e transferir para tubos de silicone tratados com Eppendorf e armazenar congelada em pequenas alíquotas a -80 ° C. </li></ol> 2. Determinação de rAAV3 Títulos Vector <ol><li> Thaw 10 mL de vírus purificado em um tubo Eppendorf no gelo. Adicionar 40 mL de DDH 2 O. </li><li> Adicionar 0,2 mL de Benzonase (25 U / mL, Novagen, Cat # 70664) e incubar a 37 ° C por 1 hora. </li><li> Tomar 50 mL de padrão plasmídeo (0,2 ng / mL) em outro tubo Eppendorf. </li><li> Adicionar 50 mL de NaOH 100 mM em cada tubo e incubar em 65 ° C por 30 min. </li><li> Frio no gelo imediatamente para pelo menos 5 min. </li><li> Corte de membrana de transferência (Millipore, Cat # INYC00010) de acordo com papel de filtro Bio-Dot (Bio-Rad, Cat # 1620161). Enxágüe membrana em SSC 10x com três papéis de filtro por 20 min. </li><li> Set Slot blot SF Aparelho (Bio-Dot, Cat # 170-6542). Conectar a um balão de vácuo e adicionar 100 mL de SSC 10x para slot blot aparelho. </li><li> Adicionar 100 mL de 20x SSC e 1 mL de corante carregamento 6x de cada uma das amostras no Passo 2.5. </li><li> Carga de 100 mL de cada amostra para a membrana no aparelho blot slot. </li><li> Adicionar outro mL 100 de SSC 10x em cada uma das amostras. </li><li> Repita os passos 2.9 e 2.10 até que todas as amostras o atravessa a membrana. </li><li> Desmontar o aparelho blot slot e remover a membrana. Colocá-lo em Linker Inspector SL-1000 Agente de crosslinking UV. Transformar em "Energia", "Crosslink Optimal" (show 1200) e empurre "Start". </li><li> Ferva 1 mL de esperma de salmão (SS) DNA (Fisher, Cat # NC9753983) por 5 min. Frio no gelo por pelo menos 5 min. </li><li> Prepare a solução de pré-hibridação através da mistura de 27,5 mL de DDH 2 O, 15 mL de 20x SSC, 5 mL de solução 50x Denhardt é, 1,25 mL de SDS 20%, 0,25 mL de Polya e 1 mL de SS DNA a partir da Etapa 2.13. </li><li> Suspender a membrana em 25 mL de solução de hibridização pré-nos um cilindro de vidro tampado e incubar a 65 ° C em uma câmara de hibridização durante a noite. </li><li> Diluir 50 modelos DNA ng em 10 mL de DDH 2 O. Ferver a 100 ° C por 5 min e frio no gelo imediatamente para pelo menos 5 min. </li><li> Centrifugar a 3000 rpm em temperatura ambiente por 1 min. Adicione 2 mL de 10 mM dNTPs 3 (falta dCTP), 2 mL da mistura de Hexanucleotide (Roche, Cat # 11277081001), 1 mL de Klenow (Roche, Cat # 11008404001) e 5 mL de α -32 P-dCTP. Incubar a 37 ° C por 10 min. </li><li> Centrífuga G-50 Colunas (GE Healthcare, Cat # 27-5330-01) a 3.000 rpm por 2 min. carga a sonda em Passo 2,17 na coluna. Centrifugar a 3.000 rpm por 2 min e recolher o escoamento. </li><li> Contagem de radioatividade. Ferva a sonda a 100 ° C por 5 min e frio no gelo imediatamente para pelo menos 5 min. </li><li> Adicionar a sonda (6x10 5 cpm / mL) na solução de pré-hibridação com membrana. </li><li> Incubar durante a 65 ° C em uma câmara de hibridação. </li><li> Descartar a solução de hibridação e enxaguar a membrana em 2x SSC SDS 0,1% no RT por 15 min. </li><li> Descartar a solução e lave a membrana em 0,1 x SSC SDS 0,1% a 65 ° C por 30 min. </li><li> Descartar a solução e lave a membrana em 0,1 x SSC em breve RT. </li><li> Expor o filme a -80 ° C durante 6 horas e desenvolver o filme. Um resultado típico é mostrado na Figura 1. </li></ol> 3. rAAV3 Transdução Vector mediada e expressão do transgene em células humanas de câncer de fígado <ol><li> Semente de 1x10 4 células (ou Huh7 ou Hep293TT) em cada poço da placa de 96 poços. Incubar em umidificado incubadora de CO 2 por pelo menos 18 horas. </li><li> Remova o meio da placa de 96 poços. </li><li> Lave as células duas vezes com 50 mL de meio, sem FBS e antibióticos e remover. </li><li> Adicionar 50 mL de meio sem FBS e antibióticos e vetores rAAV menos 5.000 vgs / célula. </li><li> Incubar as placas na incubadora de CO 2 para 4 horas. </li><li> Descartar o meio. Lave as células duas vezes com 50 mL de meio completo e remover. </li><li> Adicionar 150 mL de C-DMEM a cada poço e incube a placa na incubadora de CO 2 por 72 horas, e visualizar a expressão EGFP usando um microscópio de fluorescência (DMI 4000B; Leica Microsystems). </li><li> Imagens a partir de três poços de células infectadas por vírus são analisados ​​quantitativamente através de análise de software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EUA). </li><li> Expressão do transgene é avaliada como a área total de fluorescência verde (pixel 2) por campo visual. Um resultado típico é mostrado na Figura 2. </li><li> Expressão do transgene também pode ser determinado por citometria de fluxo. </li></ol> 4. Resultados representativos: Seguindo o protocolo descrito acima, pode-se gerar vetores AAV sorotipo eficiente. O rendimento típico é ~ 500 mL contendo ~ 10 11 vgs / mL de ações purificadas vetor. A pureza do estoque vetor é determinada pela comparação de sinais de hibridação em blots slot de DNA quantitativo, com e sem digestão Benzonase. Purificada rAAV3 vetores transduzir câncer de fígado humano - hepatoblastoma (HB) e carcinoma hepatocelular (HCC) - linhas de células de forma eficiente. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Quantitativa de análises de ADN Slot blot para determinar os títulos de rAAV3 vetores. Diluições duplas de purificada stocks viral, digerido com Benzonase (linha superior) foram analisados ​​em blots ranhura quantitativa DNA com 32 P-sonda marcada DNA EGFP-específicas. A título de AAV3 vetor foi determinada pela comparação com 1 ng (linha do meio) ou 10 ng (linha inferior) de AAV-EGFP padrões plasmídeo carregado na membrana. Os números correspondem a cópias de DNA. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. AAV recombinante vector mediada expressão do transgene em células humanas de câncer de fígado. Hep293TT células, uma recém-criada linha celular humana hepatoblastoma 4, eram (painel esquerdo) mock-infectados, ou transduzidas com 5.000 vgs / célula de qualquer scAAV2-EGFP ou scAAV3-EGFP vetores a 37 ° C por 2 horas. Expressão do transgene foi visualizado 72 horas pós-transdução usando um microscópio de fluorescência.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Vetores recombinantes baseados em um parvovírus não-patogênicos humanos, o vírus adeno-associado (AAV) têm sido desenvolvidas, e estão atualmente em uso em uma série de ensaios clínicos de terapia genética 5. Anteriormente, dos 10 sorotipos mais comumente usados ​​AAV, a eficiência de transdução de AAV3 vetores em geral, tem sido relatada a ser particularmente baixo, tanto in vitro como in vivo 1. No entanto, a nossa observação recente de que AAV3 vetores transdução do fígado humano linhas celulares de cancro muito bem, conforme determinado quantitativamente por citometria de fluxo 2, e que o ser humano utiliza AAV3 hepatócito receptor do fator de crescimento (hHGFR) como um co-receptor celular para a entrada obrigatória e nestes 3 células, sugerem fortemente uma seletiva do tecido tropismo de AAV3 de células do fígado humano em geral, e as células humanas de câncer de fígado em particular. No entanto, desde AAV3 vetores também transdução de hepatócitos humanos normais de forma eficiente 2, seu uso potencial no câncer de aplicação da terapia gênica in vivo seria impactado negativamente. Uma possível estratégia para contornar esse problema em potencial envolve a transcrição de metas de células de câncer através da identificação de um produto gene que é seletivamente produzida pelo tumor, mas não pelos hepatócitos normal. Por exemplo, estudos anteriores mostraram que os níveis séricos de α-fetoproteína (AFP) são usados ​​como um marcador específico para o rastreamento da presença, progressão e / ou a recorrência de certos tipos de cânceres de fígado, uma vez que os hepatócitos normais geralmente produzem quantidades muito pequenas de esta proteína. Na verdade, temos utilizado AAV3 vetores contendo o promotor AFP para atingir a expressão do transgene em células de câncer de fígado, mas não em hepatócitos normais 2, e os estudos estão em andamento para testar a eficácia desta abordagem em um modelo murino xenoenxerto de câncer de fígado. Em nossos estudos adicionais, temos observado que a eficiência de transdução de vetores sorotipo vários AAV pode ser significativamente aumentada pelo sítio-dirigida mutagênese da superfície exposta resíduos de tirosina na capsídeos virais 14/06. Desde 6 de 7 de superfície exposta tirosinas também são conservados em AAV3, temos realizado mutagênese sítio-dirigida desses resíduos e observaram que a eficiência de transdução de tirosina-mutante AAV3 vetores é significativamente maior em células de fígado humano com câncer (dados não publicados). Estudos também estão em andamento para avaliar a segurança ea eficácia da tirosina-mutante AAV3 vetores em modelos xenoenxerto mouse para hepatoblastoma humanos e carcinoma hepatocelular, e se bem sucedida, o ideal tirosina-mutante vetores sorotipo AAV3 pode vir a ser útil para a segmentação do fígado humano câncer para a terapia genética potencial.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-0170CM</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>Coluna HiTrap Q HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmão</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9753983</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente de iodixanol</td><td>OptiPrep</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>Colunas G-50</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr></tbody></table>

de alta eficiência transdução de células de câncer de fígado por recombinante sorotipo de vírus adeno-associado 3 vetores

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors 

Vetores recombinantes baseado em um parvovirus patogênico não-humanos, o vírus adeno-associado 2 (AAV2) foram desenvolvidos e estão atualmente em uso em uma série de ensaios clínicos de terapia genética. Mais recentemente, um número de sorotipos adicionais AAV também foram isolados, que foram mostrados para expor seletiva tropismo de tecido em vários modelos animais pequenos e grandes 1. Dos 10 sorotipos mais comumente usados ​​AAV, AAV3 é de longe o menos eficiente na transdução de células e tecidos in vitro, bem como in vivo. No entanto, em nossos estudos recentemente publicados, temos documentado que AAV3 vetores transduzir câncer de fígado humano - hepatoblastoma (HB) e carcinoma hepatocelular (HCC) - linhas de células de forma extremamente eficiente porque utiliza AAV3 receptor do fator humano como um hepatócito crescimento celular co-receptor para a ligação e entrada nestas células 2,3. Neste artigo, descrevemos os passos necessários para atingir alta eficiência de transdução de células humanas de câncer de fígado por vetores recombinantes AAV3 carregando um gene repórter. O uso de vetores recombinantes AAV3 carregando um gene terapêutico pode eventualmente levar à terapia genética potencial de câncer de fígado em humanos.

Neste artigo, descrevemos a identificação da adeno-associated virus sorotipo 3 (AAV3) como o vetor mais eficiente para alvejar células humanas de câncer de fígado.

De Alta Eficiência Transdução de células de câncer de fígado por recombinante sorotipo de vírus adeno-associado 3 Vetores

Foram desenvolvidos vetores recombinantes baseados em um parvovírus humano não patogênico, o vírus adenoassociado 2 (AAV2), que estão atualmente em uso em um...

O objetivo geral deste procedimento é produzir vetores ativos do vírus adeno-associado do sorotipo três, capazes de transduzir eficientemente células de câncer hepático humano. Isso é realizado primeiramente pela transfeção simultânea de três plasmídeos diferentes em células 293. O segundo passo do procedimento consiste na purificação do AAV três montado nas células 293.O terceiro passo do procedimento é determinar a titulação do estoque purificado do vetor AAV três. O passo final do procedimento é transduzir células de câncer hepático humano utilizando os vetores AAV três purificados. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a proteína EGFP altamente expressa em células de câncer hepático humano por meio de microscopia de fluorescência.A principal vantagem desta técnica em relação ao método existente é alcançar alta eficiência de transferência e expressão gênica em células de câncer hepático humano. Embora este método possa fornecer informações sobre a produção de três vetores AAV, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como os vetores V dois mais amplamente utilizados. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades devido ao envolvimento de diversas etapas que podem ser tediosas. A demonstração do procedimento será feita por um cientista biológico de nosso laboratório.As manipulações experimentais nesta seção do protocolo são realizadas dentro de uma cabine de cultura celular 48 horas antes de iniciar este procedimento. Semear 10 placas de cultura celular de 15 centímetros com a linhagem de células renais embrionárias humanas 2, 9 3, de modo que as células apresentem 70 a 80% de confluência no dia da transfeção. Utilize o site www.ge shae. com/calc para calcular a quantidade de DNA plasmidial a ser usada para transfeção. Uma vez que os volumes corretos de DNA plasmidial tenham sido calculados, prossiga para a transfeção: pipete um volume apropriado de meio de cultura celular sem soro bovino fetal (FBS) e antibióticos em um tubo estéril de 15 mililitros.Em seguida, pipete os volumes necessários de P helper, PACG dois, C3 e PDSA AAV C-B-E-G-F-P no meio. O volume total deve ser de 8.750 microlitros para 10 placas de 15 centímetros; pipete 1.250 microlitros de PEI no meio contendo o DNA plasmidial, vorte a solução DNA-PEI por alguns segundos e, então, incube a solução DNA-PEI por cinco minutos à temperatura ambiente para permitir a formação dos complexos DNA-PEI. Retire as 10 placas de 15 centímetros de células HEC 293 do incubador de cultura tecidual.Em seguida, pipete um microlitro da solução de D-N-A-P-E-I em cada uma das placas. Incube as placas em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro a seis horas. Após quatro a seis horas, aspire cuidadosamente o meio das placas.Em seguida, pipete 25 mililitros de meio completo com 10% de FBS para cada placa. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por aproximadamente 72 horas. Após decorridas 72 horas, remova as placas do incubador e retorne à capela de cultura de tecidos.Em seguida, sem aspirar o meio da placa, utilize um espátula para células para desprender a camada celular do fundo da placa para dentro do meio de cultura celular. Despeje o meio contendo as células em um tubo cônico de centrífuga de 250 mililitros. Repita este procedimento para cada uma das placas transfectadas, despejando o conteúdo de cada placa no mesmo tubo cônico de centrífuga de 250 mililitros.Centrifugue o tubo contendo as células e o meio em uma centrífuga refrigerada. Quatro graus Celsius por 10 minutos a 3000 rotações por minuto. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante, então pipete cinco mililitros de tampão RB TMS sobre o pellet e ressuspenda. Transfira a solução celular para um tubo cônico de centrífuga limpo de 15 mililitros.Coloque o tubo de 15 mililitros em um banho de etanol com gelo seco para congelar durante 10 minutos. Após o tempo de incubação, retire o tubo e coloque-o a 37 graus Celsius por 10 minutos. Para descongelar, repita este ciclo de congelamento e descongelamento mais duas vezes.Vortex a tubo por alguns segundos. Após cada descongelamento, após o período final de descongelamento, pipete um microlitro de cloreto de magnésio 4,8 molar e dois microlitros de 25 unidades por microlitro. Adicione benon nase à solução celular e vortex para homogeneizar.Em seguida, incubar a 37 graus Celsius por 40 minutos após a incubação. Coloque o tubo em uma centrífuga refrigerada a quatro graus Celsius e gire a 4.000 rotações por minuto durante 40 minutos. No final do período de centrifugação, prepare o gradiente de IAL a ser usado para purificar o vírus. Para isso, pipete dois mililitros de 15%, dois mililitros de 25%, 1,5 mililitro de 40% e 1,5 mililitro de 60% de IAL em um tubo de centrífuga selável de 13 mililitros.Após a centrifugação, pipete o sobrenadante S do tubo de centrífuga, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular, pipete o sobrenadante sobre o gradiente IAL e, em seguida, pipete quantidade suficiente de tampão RB TMS no tubo para enchê-lo completamente. Coloque o tubo em um rotor Beckman 90 TI, tomando cuidado para garantir que o rotor esteja adequadamente balanceado. Centrifugue a 75.000 rotações por minuto durante uma hora a 16 graus Celsius.Após a centrifugação, colete a fração 40%IAL inserindo uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de 18 gauge no gradiente idal na interface de 40 a 60%. Aspire cuidadosamente com a seringa e colete a fração idal 40%.Expulse a fração de 40%IAL da seringa para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, complete o volume do tubo até 40 mililitros com o tampão a. Monte o aparato de filtração utilizando uma coluna High Trap Q HP de acordo com as instruções do fabricante.Em seguida, lave a coluna com as seguintes soluções: 25 mililitros do tampão A, 25 mililitros do tampão B, 50 mililitros do tampão A, 40 mililitros da amostra de vírus idal preparada em tampão A, 50 mililitros do tampão A e, finalmente, 20 mililitros do tampão C. Colete o tampão C em um concentrador Apollo de 20 mililitros. Em seguida, centrifugue a amostra em uma centrífuga refrigerada ajustada a quatro graus Celsius por 10 minutos a 3000 rotações por minuto; após a centrifugação, descarte o fluxo passante.Em seguida, adicione 20 mililitros de PBS gelado ao concentrador Apollo e centrifugue novamente em uma centrífuga refrigerada a quatro graus Celsius por 10 minutos a 3000 rotações por minuto após a centrifugação. Descarte novamente o fluxo, pipete 500 microlitros de PBS gelado sobre a membrana para ressuspender o vírus da membrana. Em seguida, pipete alíquotas de 10 microlitros do vetor viral em tubos eppendorf tratados com silicone e armazene a menos 80 graus Celsius até o uso; descongele uma das alíquotas de 10 microlitros do vírus purificado em gelo.Pipete 40 microlitros de água bidestilada no tubo para diluir o vírus. Em seguida, adicione 0,2 microlitros de Ben Nase a 25 unidades por microlitro e incube a mistura a 37 graus Celsius por uma hora. Enquanto isso, pipete 50 microlitros de padrão de plasmídeo a 0,2 nanogramas por microlitro em um tubo eppendorf limpo.Após a incubação, adicione 50 microlitros de hidróxido de sódio 100 milimolar ao tubo contendo o vírus. Bens aase mix e ao tubo contendo o padrão de plasmídeo. Incube ambos os tubos a 65 graus Celsius por 30 minutos.Após decorridos os 30 minutos, resfrie imediatamente ambos os tubos em gelo por pelo menos cinco minutos. Em seguida, corte um pedaço de membrana de transferência com o mesmo tamanho de um pedaço de papel filtro bio dot. Coloque a membrana de transferência e três pedaços de papel filtro bio em uma bandeja rasa.Encha a bandeja com SSC 10 vezes e deixe embebendo por 20 minutos enquanto a membrana está embebendo. Monte o aparelho de bloco com ranhuras SF de acordo com as instruções do fabricante. Conecte o aparelho a um frasco de vácuo e, em seguida, pipete 100 microlitros de SSC 10 vezes em cada uma das ranhuras que serão carregadas com a diluição da amostra do vírus e o padrão de plasmídeo.Retire os tubos da centrífuga refrigerada a quatro graus Celsius por um minuto a 13.000 rotações por minuto. Em seguida, adicione 100 microlitros de SSC 20 vezes e um microlitro de corante de carregamento 6 vezes a cada tubo. Depois, pipete mais 100 microlitros de SSC 10 vezes para cada tubo e carregue 100 microlitros de cada amostra em compartimentos adjacentes.Repita o procedimento de diluição e carregamento até que todo o volume de cada amostra tenha sido carregado no aparelho de encaixe em fenda e até que sejam feitas adições adicionais de 10 vezes SSC, em um volume de 100 microlitros ou menos. Depois que todas as amostras tiverem atravessado a membrana, desmonte o aparelho de encaixe em fenda e remova a membrana com pinça. Tenha cuidado para manipular a membrana pelas bordas e coloque a membrana na câmara do cruzador UV inspector linker SL 1000.Em seguida, selecione energia ideal; a reticulação deve levar aproximadamente 30 segundos. Agora, prepare-se para hibridização fervendo um mililitro de DNA de esperma de salmão por cinco minutos. Após ferver por cinco minutos, o DNA de esperma de salmão deve ser imediatamente resfriado em gelo por pelo menos cinco minutos.Em seguida, prepare a solução de pré-hibridização de acordo com o protocolo escrito. Pipete 25 mililitros da solução de pré-hibridização contendo DNA de esperma de salmão em um tubo de hibridização. Transfira cuidadosamente a membrana reticulada para o tubo de hibridização e, em seguida, coloque a tampa no tubo, garantindo que a solução de pré-hibridização cubra completamente a membrana.Na posição horizontal, incubar em câmara de hibridização a 65 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, iniciar a preparação da sonda pipetando 50 nanogramas de molde de DNA em um tubo einor e adicionando 10 microlitros de água bidestilada para diluir, ferver o DNA diluído por cinco minutos e, em seguida, resfriar imediatamente em gelo por pelo menos cinco minutos após o resfriamento. Centrifugar o molde de DNA diluído a 13.000 rotações por minuto por um minuto em temperatura ambiente.Em seguida, trabalhe de acordo com as diretrizes de segurança da instituição para radioatividade. Prepare a sonda radioativa adicionando dois microlitros de DNTS 10 milimolar sem DCTP, dois microlitros de hexanucleotídeo. Misture um microlitro de AU e cinco microlitros de 32P-D-C-T-P e incube a 37 graus Celsius por uma hora após a incubação.Prepare colunas G 50 por centrifusão a 3000 rotações por minuto durante dois minutos. Em seguida, carregue a sonda na coluna e centrifugue seu produto a 3000 rotações por minuto durante dois minutos, coletando o fluxo passante. Neste ponto, a radioatividade do fluxo passante é medida utilizando procedimentos padrão para determinar as contagens por minuto por mililitro da sonda.Em seguida, ferva a sonda por cinco minutos. Após isso, resfrie imediatamente a sonda em gelo por cinco minutos. A sonda então está pronta para ser usada na hibridização sem a remoção da membrana.Pipete a sonda em uma concentração de seis vezes o centro de cinco contagens por minuto por mililitro diretamente na solução de pré-hibridização no tubo de hibridização. Incube a câmara de hibridização durante a noite a 65 graus Celsius no dia seguinte. Descarte a solução de hibridização de acordo com os protocolos institucionais de radioatividade e pipete 25 mililitros de SSC duas vezes mais 0,1% de SDS para dentro do tubo e lave a membrana por 15 minutos à temperatura ambiente.Descarte a solução e pipete 25 mililitros de SSC 0,1 vezes mais 0,1% de SDS para dentro do tubo. Lave a membrana a 65 graus Celsius por 30 minutos. Após essa lavagem, descarte a solução e enxágue brevemente a membrana com 25 mililitros de SSC 0,1 vezes à temperatura ambiente.Envolva a membrana com filme plástico e coloque-a em uma cassete de exposição, trabalhando no escuro. Coloque uma chapa de filme sobre a membrana e feche a cassete para protegê-la da luz. Coloque a cassete de exposição no congelador a menos 80 graus Celsius por seis.Após seis horas. Revele o filme e determine o título das estirpes virais comparando a densidade das bandas virais com as bandas dos padrões de plasmídeo. Uma vez determinado o título, o vírus pode ser usado para transduzir células; primeiro, semeie um vezes dez à quarta células Hep 2 93 TT.Em cada poço de uma placa de 96 poços, incubar as células por pelo menos 18 horas em um incubador com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Após a incubação, aspirar o meio de cada poço e pipetar cuidadosamente 50 microlitros de meio sem antibióticos e sem FBS em cada um. Aspirar este meio e então repetir o processo para lavar as células.Dilua os vetores recombinantes a a v no meio sem FBS e antibióticos até uma concentração final de 5.000 VGS por célula. Adicione 50 microlitros dessa solução ou 50 microlitros de meio sem FBS como controle negativo aos poços da placa de 96 poços e incube por duas horas em um incubador com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova o meio contendo o vírus e lave as células duas vezes como antes, utilizando 50 microlitros de meio completo por poço.Após descartar a última lavagem, adicione 150 microlitros de meio completo a cada poço e incube a placa em um incubador com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 72 horas. Por fim, visualize a expressão de EGFP utilizando microscopia de fluorescência. A intensidade da fluorescência pode ser quantificada usando o software Image J, com a expressão do transgene avaliada como a área total de fluorescência verde por campo visual.Um exemplo de um bloco quantitativo de DNA em slot para determinação dos títulos de vetores RAV três é mostrado aqui. Esta membrana foi hibridizada com uma sonda de DNA específica para EGFP marcada com P 32. A linha superior do bloco compreende diluições em dobro de estoques virais purificados digeridos com Ben Nase.As linhas intermediária e inferior são compostas por padrões A-A-V-E-G-F-P diluídos a partir de um nanograma ou 10 nanogramas de plasmídeo, respectivamente. O título das amostras virais é determinado por comparação com os padrões de plasmídeo. Os números mostrados na membrana correspondem ao número de cópias de DNA plasmidial.Este é um exemplo de expressão de transgene mediada por vetor AAV recombinante. Em uma linhagem celular de hepatoblastoma humano, as células foram visualizadas 72 horas após a transdução utilizando um microscópio de fluorescência. A primeira imagem ilustra os resultados de uma infecção controle.A segunda imagem mostra células HEP 2 93 TT transduzidas com 5.000 VGS por célula de todos os vetores AAV dois EGFP a 37 graus Celsius por duas horas. A imagem final mostra a transdução com 5.000 VGS por célula de R AAV três EEG FP nas mesmas condições. Pode-se observar que RAAV três é muito mais eficiente na transdução desse tipo celular em comparação com R AAV dois.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da terapia gênica, como como direcionar células de câncer hepático humano. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento do câncer hepático humano porque um V três tem a capacidade de expressar um gene terapêutico especificamente em câncer hepático humano em alto nível.

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