Medindo Coordenação Motora em Ratos
29 de maio de 2013
Protocolos são apresentados para duas tarefas estabelecidas coordenação motora, o bar rotarod e horizontal, acelerando também dois testes desenvolvidos em Oxford recentemente, as hastes estáticos e barras paralelas. Estes testes podem detectar deficiências motoras potencialmente de interesse em seu próprio direito, bem como possíveis variáveis em testes de outras áreas do comportamento.
O objetivo geral deste procedimento é medir a coordenação motora em camundongos. Isso é feito primeiro testando na haste do rotor de aceleração. Em seguida, a coordenação motora é testada na barra onal.
O animal também pode ser testado em hastes estáticas. Por fim, o desempenho nas barras paralelas pode ser medido. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram se o camundongo tem alguma deficiência na coordenação motora.
Geralmente, os indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades devido à dificuldade de colocar corretamente o mouse no aparelho para todos os testes a seguir. Traga os ratos para a sala experimental cinco a 20 minutos antes do teste para garantir que estejam totalmente acordados. A cena da haste do rotor aqui foi construída na Universidade de Oxford.
A haste tem três centímetros de diâmetro com uma série de sulcos paralelos em sua superfície, que ajudam os ratos a segurá-la com mais eficiência. Um flange de cada lado impede que o mouse saia da haste. Eles têm 30 centímetros de diâmetro e seis centímetros de distância.
A haste é fixada a 30 centímetros da base do aparelho. Uma superfície acolchoada macia é colocada na base para amortecer quaisquer quedas antes de iniciar o teste. Prepare a haste do rotor definindo uma velocidade inicial de quatro rotações por minuto e uma taxa de aceleração de 20 rotações por minuto.
Para começar, segure o mouse pela cauda e traga-o em direção à haste em um ângulo de 45 graus abaixo da horizontal. Solte rapidamente o animal quando ele estiver quase tocando a haste. Alternativamente, o mouse pode ser abaixado em um pino e o pino será usado para transferir o animal para a vara.
Inicie a aceleração 10 segundos depois de colocar o mouse na haste e observe a velocidade com que o mouse cai. Se o rato cair antes de cinco segundos e for provavelmente devido a uma má colocação por parte do experimentador, o resultado não deve ser registado e o ensaio reiniciado se o rato cair antes de 10 segundos. Observe o tempo e permita ao animal mais duas tentativas.
Para animais que permanecem nos últimos 10 segundos, registre a velocidade com que o animal cai. Ocasionalmente, o rato pode parar de andar e, conseqüentemente, algum ataque ao redor da haste antes de cair. É útil observar a velocidade dessa ocorrência.
O desempenho é calculado como a velocidade média entre as tentativas. Por exemplo, um mouse que cai antes de 10 segundos uma vez e permanece ligado até 12 rotações por minuto. A segunda vez marca quatro mais 12 divididos por dois, igualando oito rotações por minuto.
A barra horizontal mede a força e a coordenação dos membros de queda, enquanto uma barra de dois milímetros de diâmetro é mais comumente usada. Barras de diâmetro maior podem fornecer pontuações de desempenho mais refinadas. Barras de latão de 38 centímetros de comprimento são mantidas 49 centímetros acima da superfície da bancada por uma coluna de suporte de madeira.
As barras são mantidas sob tensão quando encaixadas nos entalhes dos suportes que são ligeiramente unidos. Comece o teste com a barra de dois milímetros. Segure o mouse pela cauda e coloque-o na bancada em frente ao aparelho.
Deslize-o rapidamente. Para trás cerca de 20 centímetros para alinhar seu corpo perpendicular à barra rapidamente. Levante o animal permitindo que ele segure a barra horizontal no centro apenas com seus quatro poros.
Solte a cauda ao iniciar simultaneamente um cronômetro. Se o mouse não conseguir agarrar a barra e o posicionamento do experimentador pode ser a causa. Não registre a queda e teste novamente o animal após um breve descanso.
Se o mouse cair antes de cinco segundos, e isso aparentemente não se deve à má colocação do experimentador, repita até três vezes na tentativa de obter uma pontuação superior a cinco segundos. Registre o tempo que o mouse cai ou o tempo até que um quatro pobres toque em uma coluna com um tempo máximo de teste de 30 segundos, tome a melhor pontuação como o datu Direito para marcar a barra horizontal. Se a massa cair entre um e cinco segundos, marque um entre seis segundos e 10 segundos.
Marque dois entre 11 segundos e 20 segundos. Marque três entre 21 segundos e 30 segundos. Marque quatro caindo após 30 segundos ou apenas permanecendo na barra até 30 segundos.
Marca cinco, e o mouse também marca cinco se tocar uma extremidade. Suporte com suas quatro portas a qualquer momento durante o teste. Se uma pontuação de cinco for alcançada na barra de dois milímetros, o animal pode ser testado em barras mais grossas após um breve descanso.
O sistema de pontuação para as barras de quatro e seis milímetros é o mesmo que para a barra de dois milímetros, e a pontuação final é o total acumulado. Assim, um mouse que marca cinco na barra de dois milímetros, mas cai da barra de quatro milímetros após 13 segundos. Pontuações cinco mais oito.
Neste teste de coordenação motora, dows ou hastes de madeira de espessura variável, 35 28, 22 15 e nove milímetros de diâmetro, cada um com 60 centímetros de comprimento, afixados por uma pinça G a uma prateleira de laboratório a 60 centímetros do chão. Uma marca é feita a 10 centímetros da extremidade perto do banco para denotar a linha de chegada. Para começar, coloque o mouse na extremidade mais larga da haste mais larga, de costas para a prateleira, registre o tempo que leva para o animal se orientar em direção à prateleira e esse tempo total de trânsito.
Se o mouse virar de cabeça para baixo e se agarrar abaixo da haste durante a orientação, atribua-o arbitrariamente à pontuação máxima de 120 segundos. O animal não é testado nas outras hastes e também recebe um valor máximo de trânsito. Se o mouse cair ou atingir o tempo máximo de teste de 120 segundos após a orientação, não o teste em hastes mais estreitas.
Uma pontuação máxima também é atribuída se o mouse virar de cabeça para baixo enquanto atravessa a haste após a orientação, retorne o mouse para a gaiola inicial e deixe-o descansar antes do teste. A próxima haste menor. Coloque o animal na haste menor, conforme mostrado anteriormente.
Se o mouse cair antes de cinco segundos, substitua-o e permita até mais duas tentativas. Registre o tempo para inverter a haste ou até que o mouse caia. Para montar as barras paralelas suportam duas barras, de um metro de comprimento e quatro milímetros de diâmetro, separadas por 30 milímetros em suporte de madeira.
Colunas 60 centímetros acima do chão. Coloque o mouse no centro das duas barras com seu eixo longitudinal perpendicular às barras. Ambos os poros frontais devem estar em uma barra com ambos os poros posteriores na outra barra.
A pontuação é semelhante à das hastes estáticas. Duas medidas são tomadas: o tempo até que o mouse se oriente 90 graus em relação à posição inicial e o tempo até atingir um dos suportes finais. Da mesma forma, a orientação e o trânsito devem ser alcançados sem que o animal vire de cabeça para baixo, caso contrário, o tempo máximo é alocado.
Se o animal cair antes de cinco segundos, provavelmente é devido a uma má colocação e o animal deve ser testado novamente. Uma haste estática foi originalmente usada para monitorar o progresso da doença em camundongos mutantes com ou sem enriquecimento ambiental em suas gaiolas domésticas. O programa de enriquecimento atrasou drasticamente o início da disfunção motora na haste, que foi paralela a um atraso no início do aperto fraco das costas.
Um sinal geral de camundongos infectados com câncer neurológico e scrapy mostrou uma diminuição no desempenho da barra horizontal a partir da semana 16 após a injeção no teste da haste do rotor a partir da semana 18 e nas hastes estáticas a partir de pelo menos a semana 19. As lesões do hipocampo não tiveram efeito sobre nenhuma medida da capacidade motora, mas 1 2 9 s dois camundongos SV foram prejudicados em relação à tensão C 57 black six na haste do rotor e hastes estáticas após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para os investigadores da doença de Huntington estudarem os efeitos do enriquecimento ambiental em ratinhos mutantes da doença de Huntington.
Visão Geral
Este artigo apresenta protocolos para avaliar a coordenação motora em camundongos utilizando diversas tarefas, incluindo os testes de rotarod acelerado e de barra horizontal. Além disso, introduz dois testes recentemente desenvolvidos, barras estáticas e barras paralelas, que podem identificar déficits motores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Análise Comportamental
- Coordenação Motora
Antecedentes
- A coordenação motora é fundamental para compreender diversas condições neurológicas.
- Testes estabelecidos, como o rotarod, têm sido amplamente utilizados na pesquisa.
- Novos testes desenvolvidos em Oxford visam aprimorar a detecção de comprometimentos motores.
- Esses testes também podem servir como variáveis em estudos comportamentais mais amplos.
Objetivo do Estudo
- Medir a coordenação motora em camundongos utilizando protocolos estabelecidos e novos.
- Identificar possíveis déficits motores em sujeitos experimentais.
- Fornecer uma abordagem padronizada para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Teste de rotarod acelerado para avaliar preensão e equilíbrio.
- Teste da barra horizontal para força e coordenação dos membros.
- Teste de barras estáticas para avaliar orientação e equilíbrio.
- Teste de barras paralelas para medir a coordenação motora geral.
Resultados Principais
- Os resultados indicam níveis variados de coordenação motora entre os camundongos testados.
- As métricas de desempenho fornecem informações sobre possíveis comprometimentos.
- Novos testes mostram potencial na detecção de déficits motores sutis.
- Protocolos padronizados facilitam a reprodutibilidade na pesquisa.
Conclusões
- O estudo descreve com sucesso métodos para avaliar a coordenação motora.
- Tanto os testes estabelecidos quanto os novos são eficazes na identificação de comprometimentos motores.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes protocolos para explorar condições neurológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação da coordenação motora em camundongos é fundamental para reduzir riscos na validação de alvos em descoberta de fármacos em neurociência, assegurando que os fenótipos comportamentais observados reflitam mudanças cognitivas ou emocionais reais e não déficits motores confundidores. Testes motores padronizados permitem confiança preditiva no estágio inicial de descoberta ao isolar a função motora como uma variável independente, apoiando decisões de avançar ou interromper nos fluxos de validação de alvos. Esses ensaios proporcionam continuidade translacional do engajamento do alvo à triagem fenotípica, reduzindo a desistência em estágios avançados devido a efeitos colaterais motores inesperados.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas dissociando déficits motores de fenótipos cognitivos ou emocionais em modelos mutantes ou com lesões.
- Valor Operacional: Permite a dissecção seletiva de interferências motoras em ensaios comportamentais como o labirinto aquático de Morris, melhorando a interpretabilidade dos dados.
- Valor Estratégico: Apoia a redução de riscos do alvo ao validar que os fenótipos observados não são secundários a disfunção motora, aumentando a confiança na associação entre alvo e mecanismo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, confirmando a competência motora basal antes de testes cognitivos.
- Valor Operacional: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis (por exemplo, velocidade de queda no rotarod, tempo de preensão na barra horizontal), permitindo a padronização de ensaios entre diferentes locais.
- Valor Estratégico: Facilita a avaliação escalável de compostos ao garantir que o desempenho motor não interfira nos resultados de resposta à dose ou em triagens.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao detectar déficits motores em modelos da doença de Huntington e outras condições neurodegenerativas.
- Valor Operacional: Oferece continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo o acompanhamento longitudinal da deterioração motora.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de avanço com base no risco ao identificar precocemente sinais de segurança motora ao longo do processo de descobrimento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e o triagem pré-clínica, em que a coordenação motora atua como um filtro crítico de confundidores antes da avaliação de desfechos cognitivos ou emocionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao isolar a função motora como uma variável independente, esclarecendo se os fenótipos observados decorrem do engajamento do alvo ou de toxicidade motora.
- Triagem: Garante a prontidão do ensaio ao validar a competência motora, reduzindo falsos negativos em triagens comportamentais devido ao desempenho motor deficiente.
- Análises: Gera medidas quantitativas (velocidade de queda no rotarod, duração do aperto na barra) que permitem comparação objetiva entre genótipos, tratamentos ou pontos temporais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar a deterioração motora progressiva em modelos de doenças neurodegenerativas, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade de plataforma reutilizável em diversos projetos de neurociência, padronizando a avaliação motora entre classes de alvos e modalidades.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista em fenótipos comportamentais, garantindo que os efeitos observados sejam específicos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos definidos, parâmetros de aceleração e sistemas de pontuação em diferentes modalidades de teste.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir decisões mais precoces de prosseguir ou interromper, reduzindo investimentos em alvos com fenótipos confundidos por alterações motoras.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco ao identificar comprometimentos motores que poderiam prejudicar a translação clínica.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em neurociência comportamental e manejo de roedores para garantir o posicionamento adequado e minimizar artefatos induzidos pelo posicionamento.
- Depende de instrumentação calibrada (por exemplo, rotarod acelerado com controle preciso de velocidade, aparelho de barra horizontal com regulação de tensão).
- Necessita padronização entre equipes quanto aos períodos de aclimatação (5–20 minutos), regras de repetição de ensaios e critérios de pontuação para assegurar a comparabilidade dos dados.
- Envolve considerações de adaptação entre diferentes sistemas modelo, já que diferenças de linhagem (por exemplo, C57BL/6 vs. SV129) e variabilidade baseada no sexo afetam o desempenho motor basal.
- Inclui limitações práticas, como a suscetibilidade ao viés de posicionamento pelo experimentador, especialmente nos ensaios iniciais, exigindo protocolos de reteste e exclusão de valores aberrantes.
