Name: Detecção de Biomolecular empregando o sensor de imagem Interferometric Reflectância (IRIS) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Aprenda a detectar biomoléculas sem marcadores usando o sensor IRIS com imagem de interferometria de reflectância. Este método óptico permite quantificar proteínas e ácidos nucleicos em microarranjos de forma rápida e econômica.

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Os autores agradecem a Zoiray Technologies Inc., um parceiro co-patrocinador e comercialização, por seu apoio.

1. Preparação do substrato <ol><li> Revestimento em camadas de silício SiO 2 substratos com a auto-adsorção copoly (DMA-NAS-MAPS): <ol><li> Síntese de copolímero, estrutura química e processo de revestimento são publicados em: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Caracterização de um revestimento polimérico adsorvido para lâminas de vidro DNA Microarray. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358. </li><li> Brevemente, preparar solução de polímero por adição de 100 mg de polímero de 5 mL de água deionizada (DI) e adicionar 5 mL de sulfato de amônio 40% saturada ((NH 4) 2SO 4) solução para alcançar uma concentração final de 0,92 M. </li><li> Chips de submergir em solução por 30 min em um agitador e enxague bem com água DI. Seque bem com Argon / N 2 de gás. </li><li> Fichas leve ao forno a 80 ° C por 15 min. </li></ol></li><li> Loja de polímero revestido substratos / fichas em um ambiente seco (exsicador de vácuo) para até 3 meses até sonda spotting procedimento. </li></ol> 2. Preparação de Probe Array: Anticorpos antígenos, ss / dsDNA, RNA, etc <ol><li> Diluir sonda (s) para concentração adequada em tampão desejado. Este passo pode ser muito variável, mas uma experiência típica utiliza antígeno ou IgG em uma concentração de 0,5 mg / mL (faixa de 0,1 -1 mg / mL) em tampão fosfato salino (PBS), pH ≈ 7,4. </li><li> Coloque soluções em um 96 - ou 384 bem-chapa (ou placa de fonte padrão para o observador a ser utilizado) </li><li> Configuração de parâmetros para spotting desejado série impresso: determinar os parâmetros adequados para manchar a superfície e as soluções a ser utilizado (tempos de parada, velocidades de aproximação, etc.) Determinar o número de repetições de cada condição por grade, o layout de grade, o número de grades de replicar, e no local desejado spotting no chip. Substratos lugar e placa de fonte nos locais apropriados, certifique-se garrafas de resíduos e abastecimento estão prontas, e começar a executar a impressão. </li><li> Depois de spotting é terminar substratos lugar em um ambiente de alta umidade durante a noite (4-18 horas) para permitir processo de imobilização e desativação para prosseguir. </li><li> Lavar substratos: colocá-los nas seguintes soluções durante três minutos para três lavagens separadas: PBS com Tween 0,1% (PBST), PBS e, finalmente, água deionizada (DI). Dependendo do tipo de experimento (wet vs seco), seca o chip completamente com gás argônio e começar a incubação ou colocar o chip em uma câmara de fluxo e montar. </li><li> Desativar demais grupos NHS na superfície copolímero submergindo as fichas em uma solução de 50 mM de etanolamina com o pH ajustado para 7,4 por 30 minutos, enquanto em uma placa de shaker. Um composto contendo aminas primárias, como hidroxilamina ou Tris também pode ser usado, desde a solução preparada é seguro para uso com proteínas. Lavar cuidadosamente a solução desativação usando PBS, em seguida, água DI. </li><li> Passo opcional (dependendo da química de superfície sendo empregados): Bloco de superfície usando uma solução de BSA, caseína, leite ou reidratado durante 30 minutos. Para a química da superfície de polímero atual que usamos, nós não realizar esta etapa como a espinha dorsal de polímeros para evitar que atos não-específica ligação às proteínas. </li></ol> 3. Dados Procedimento de Aquisição e Incubação: formato Endpoint <ol><li> Faça uma solução do alvo de interesse no buffer desejado. Aqui, será uma solução de concentração adequada de Anti-BSA em PBS (ex: make mL 10/01 de uma ng 10 / mL de solução anti-BSA em PBS). Além disso, certifique-se de ter uma quantidade equivalente de tampão (sem destino) para a incubação de controle negativo. </li><li> Dê uma varredura espelho de silício para normalizar todos os dados recolhidos posteriormente. </li><li> Varredura da matriz sonda preparada com o sistema IRIS antes da etapa de incubação para determinar a altura inicial óptico (massa) em cada ponto. Isto irá permitir a análise adequada das alterações na massa na superfície, ou seja, o nível de vinculação, após a incubação. Aqui, alguns parâmetros serão ajustados para o experimento atual, como tempo de exposição, campo de visão, concentrando-se prosperando, etc </li><li> Chip de submergir (s) em solução preparada para uma hora em uma placa de shaker. O período de incubação pode variar consideravelmente, dependendo do nível de agitação, a concentração de alvo a ser detectado, as características de transporte da câmara de fluxo (se um modo de detecção em tempo real está sendo usado), as afinidades do par-alvo de sondagem, etc . </li><li> Após a incubação, repita o procedimento de lavagem descrito no passo 2.5) </li><li> Digitalização a matriz mesma sonda usando o sistema IRIS e obter pós-incubação imagens para pré-incubação de comparação. </li><li> Repita esse processo para as etapas de incubação diferente, se necessário, por exemplo, em um formato de ensaio sanduíche onde um anticorpo secundário está sendo usado. </li></ol> 4. Análise de Dados <ol><li> Se encaixam as imagens coletadas para cada scan IRIS (seqüência de imagens de intensidade), utilizando o software desenvolvido para lab-produzir uma imagem da sonda a matriz contendo informações espessura óptica. Uma rápida análise qualitativa de ligação pode ser feita subtraindo (registrados) e pós-pré-incubação imagens. Ligação aparecerá como uma mudança na intensidade naqueles pontos onde as mudanças de massa foram observados. Para a análise quantitativa, determinar as densidades de massa de cada ponto em relação ao fundo pela média informações espessura óptica para cada pixel dentro de um local e um anel fora do local e fazer uma comparação direta entre estas duas áreas. </li></ol> 5. Resultados representativos: A Figura 1 mostra um exemplo do esquema em camadas Si-SiO substrato IRIS 2 manchado com uma matriz de anticorpos representante. Cada conjunto de anticorpos é visto em replicar com especificidade para um epítopo diferente direcionamento proteínas diferentes. Dois diferentes vírus inteiros e uma proteína viral são representados como alvos exemplo. Anticorpos controle negativo depende do ensaio e pode ser não-específica e / ou vírus específico. A Figura 2 mostra a ligação de albumina sérica humana (HSA) com anticorpos monoclonais específicos para uma matriz de spotted HSA e IgG de coelho (controle) pontos. Como pode ser visto aqui, após a montagem e determinação da espessura óptica para as imagens pré e pós-incubação, uma imagem de diferença para a matriz de ligação pode ser criado para avaliar qualitativamente vinculativo. Análise quantitativa revela que um 2,05 e 0,13 nanômetros significa alterar a altura óptico foi observado para o HSA e spots de coelho IgG, respectivamente, para uma concentração de incubação anti-HSA de 500 ng / mL. A Figura 3 mostra uma medida de dependência IRIS Fur ligação às proteínas sobre a concentração de proteína e comprimento oligômero dsDNA. O gráfico de cima mostra absoluta medidas de altura ópticos para alturas inicial oligômero imobilizado sonda e pós-incubação de ligação Fur. Concentrações crescentes de pele (50, 100, 200 nM) resultou na ligação aumentada para sondas de DNA. O comprimento dos oligômeros também impactos vinculativo Fur com seqüências mais longas, resultando em mais vinculativo. Aqui, barras de erro representam um desvio-padrão da média. O enredo inferior mostra dímero de proteínas calculado Fur ligação por fio dsDNA. Dimer ligação foi significativamente maior na concentração de proteína Fur de 200 nM sugerindo um alto nível de ligação não específica. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquemática de um array sonda exemplo, normalmente utilizado em um experimento para detectar vírus e componentes específicos viral de forma multiplexada com o sistema IRIS. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Pós-incubação imagem diferença para a ligação de albumina de soro humano de anticorpos específicos para manchado HSA coletados com este sistema de rótulo livre na concentração de 500 ng / mL. A densidade de massa biomaterial para cada ponto é determinado pela média de espessura óptica informações dentro de um local e depois comparar com a média de um anel em torno do ponto que representa o fundo. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Lote de ligação de dados para as interações Fur proteína com spotted double-stranded oligômeros com uma seqüência consenso conhecido com base no comprimento de oligômero, localização da seqüência de consenso no âmbito do oligômero, ea concentração de proteínas da pele. Informações sobre a quantidade absoluta de proteína Fur obrigado a cada seqüência manchado (em cima) pode ser usado para estimar o número de dímeros Fur vinculados a cada tipo de oligômero (baixo).

<ol><li>Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li>
<li>Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li>
<li>Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed%2C+high-throughput%2C+label-free%2C+and+dynamic+biosensing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li>
<li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A plataforma IRIS é um sistema simples e rápido de usar para a recolha de high-throughput de ligação de dados em um formato de microarray. Por imobilizar covalentemente diferentes sondas funcionais de proteínas ou DNA em uma superfície antígenos alvo / biomarcadores / etc. podem ser capturados a partir de solução, como em um imunoensaio. Medição dessas interações entre as condições sonda em um terminal ou em tempo real formato com o sistema IRIS permite que a informação altamente sensível e quantitativos a serem coletados para cada interação. O experimento representante detalhado aqui é apenas um exemplo dos tipos de interações que podem ser estudados com esta técnica. Detecção de fatores de transcrição, os antígenos virais, vírus e todo tem sido demonstrado anteriormente e representa apenas alguns exemplos dos tipos de análises que o IRIS pode facilmente manipular.

<ol><li> Wafers de silício com 500 nm de dióxido de silício termicamente crescido, Silicon Valley Microelectronics, ordem personalizada <li> Pó de sulfato de amônio, Sigma-Aldrich gato. # A5132 <li> Tampão fosfato salino (PBS) concentrado 10X pronto, Fisher Scientific gato. # BP665-1 <li> Anticorpos para albumina sérica humana (Anti-HSA), Sigma-Aldrich gato. # A0433 <li> Albumina sérica humana (HSA), gato Sigma-Aldrich. # A9511 <li> Argônio ou nitrogênio gás (ultra-alta pureza), gato Airgas. # AR UHP300 ou # NI UHP300 <li> Placas de Petri, 60 mm x 15 mm, Fisher Scientific gato. # 0875713A <li> Scienceware ® vácuo dessecador, Sigma-Aldrich gato. # Z119016 <li> Tubos de microcentrífuga, Fisher Scientific gato. # 05-408-120 <li> Placas de 96 poços, a ligação célula baixa, Nalgene Nunc gato International. # 145399 <li> BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer, Bio-Rad <li> Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379 <li> Etanolamina, Sigma-Aldrich # 398136 <li> Hidroxilamina, Thermo Scientific gato. # 26103 <li> Multi-purpose rotador, Thermo Scientific (Barnstead International), modelo # 2314, cat. # 2314Q <li> Retiga câmera 2000R, gato QImaging. # 01-RET-2000R-FM-12 <li> Fonte de iluminação AcuLED, PerkinElmer, ordem personalizada <li> Componentes ópticos (lentes, objetivos, aberturas, grades, postes, etc), Thorlabs </ol>

detecção de biomolecular empregando o sensor de imagem interferometric reflectância (iris)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

A medição sensíveis de interações biomoleculares tem uso em muitos campos e indústrias como a biologia básica e microbiologia, monitoramento ambiental / agrícola / biodefesa, nanobiotecnologia, e muito mais. Para aplicações de diagnóstico, monitoramento (detectar) a presença, ausência, ou a expressão anormal de biomarcadores de proteômica alvo ou genômico encontrado em amostras de pacientes pode ser usado para determinar abordagens de tratamento ou eficácia terapêutica. Na área da pesquisa, a informação sobre afinidades e especificidades molecular são úteis para a plena caracterização dos sistemas sob investigação. Muitos dos sistemas atuais empregados para determinar as concentrações moleculares ou afinidades contam com o uso de etiquetas. Exemplos desses sistemas incluem imunoensaios tais como o ensaio imunoenzimático (ELISA), reação em cadeia da polimerase (PCR), ensaios de eletroforese em gel e espectrometria de massa (MS). Geralmente, esses rótulos são fluorescentes, radiológicas, ou colorimétrico na natureza e estão directa ou indirectamente ligados ao alvo molecular de interesse. Embora o uso de etiquetas é amplamente aceito e tem algumas vantagens, há desvantagens que estão estimulando o desenvolvimento de novas rótulo sem métodos para medir essas interações. Estas desvantagens incluem aspectos práticos, tais como o custo aumentou ensaio, reagentes vida e as preocupações de armazenamento, usabilidade e segurança, desperdício de tempo e esforço na rotulagem, ea variabilidade entre os reagentes diferentes devido aos processos de rotulagem ou rótulos próprios. Em uma base de pesquisa científica, o uso desses rótulos também pode introduzir dificuldades, tais como preocupações com os efeitos sobre a funcionalidade de proteínas / estrutura devido à presença dos rótulos anexados ea incapacidade de medir diretamente as interações em tempo real. Aqui apresentada é a utilização de um biosensor rótulo sem nova ótica que é passível de microarray estudos, denominado o Imaging Sensor Interferometric Reflectância (IRIS), para detecção de proteínas, DNA, material antigênico, patógenos todo (virions) e outro material biológico. O sistema IRIS tem sido demonstrado ter alta sensibilidade, precisão e reprodutibilidade de interações biomoleculares diferentes [1-3]. Benefícios incluem a capacidade multiplex de imagem, em tempo real e capacidades de medição endpoint, e outros de alto rendimento atributos, tais como consumo de reagente, bem como diminuição nos tempos de ensaio. Além disso, a plataforma IRIS é simples de usar, requer equipamento barato, e utiliza silício baseados em componentes do ensaio em fase sólida tornando-o compatível com muitas abordagens contemporâneas de química de superfície. Aqui, apresentamos o uso do sistema IRIS, desde a preparação de matrizes de sonda para incubação e medição de meta vinculativa para a análise dos resultados em formato de ponto de extremidade. O sistema modelo será a captura de anticorpos alvo, que são específicas para albumina sérica humana (HSA), em HSA-spotted substratos.

Detecção biomolecular quantitativos, de alto rendimento, em tempo real, sem rótulo e (DNA, proteínas, etc) em SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Superfícies pode ser conseguido usando uma técnica simples interferométricos que depende de iluminação LED, o mínimo de componentes ópticos, e uma câmera. O sensor de imagem Interferometric Reflectância (IRIS) é barato, simples de usar, e passíveis de microarray formatos.

Detecção de Biomolecular empregando o sensor de imagem Interferometric Reflectância (IRIS)

A medição sensível de interações biomoleculares tem aplicação em diversos campos e indústrias, tais como a biologia básica e a microbiologia, ...

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar a ligação de anticorpos a antígenos imobilizados na superfície por meio de uma plataforma sensorial sensível e livre de marcadores denominada Iris. Isso é alcançado primeiramente pela preparação de uma matriz de sondas de teste e controle sobre uma superfície uniforme de dióxido de silício quimicamente funcionalizada, para capturar proteínas-alvo a partir de solução. As sondas imobilizadas podem ser anticorpos ou antígenos, DNA ou RNA, ou qualquer outro tipo de macromolécula compatível com as químicas de superfície funcionalizadas, poliméricas ou sane.A microplaca preparada é então incubada com uma amostra contendo as proteínas de interesse, o que permite a ligação ocorrer em condições especificadas pelo pesquisador. Em seguida, toda a matriz de sensores é imageada em diferentes comprimentos de onda da luz. Com o sistema IRIS, as intensidades refletidas de cada pixel são processadas com algoritmos codificados personalizados.Para quantificar a quantidade de biomaterial ligado a cada condição de teste ou controle, são obtidos resultados pós-incubação que demonstram detecção eficaz e quantificação absoluta de anticorpos em uma mistura complexa, com base nas medições interferométricas sem marcação deste sistema. Com base em mais de uma década de pesquisa e desenvolvimento em dispositivos ópticos de interferência e cavidades de resina, desenvolvemos este novo método que pode superar muitos dos problemas confundidores encontrados em nossos sistemas anteriores de biossensores sem marcação. A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas de coleta de dados exigem que os procedimentos corretos de normalização e controle de qualidade sejam seguidos, a fim de garantir a aquisição precisa e repetível dos dados.Para revestir conjuntamente seus substratos de dióxido de silício com copolímeros autoabsorvíveis de NAS DMMA em primeiro lugar, prepare a solução polimérica adicionando 100 miligramas do polímero a cinco mililitros de água desionizada. Em seguida, adicione cinco mililitros de sulfato de amônio a 40% saturado para obter uma concentração final de sulfato de amônio de 0,92 molar. Mergulhe os chips na solução polimérica por 30 minutos em um agitador após a incubação.Lave minuciosamente os chips com água desionizada, seque-os com gás argônio ou nitrogênio e, em seguida, aqueça-os a 80 graus Celsius por 15 minutos. Armazene os chips de substrato revestidos com polímero em um ambiente seco, como um dessecador a vácuo, por até dois ou três meses até o procedimento de deposição das sondas para diluir cada sonda. Primeiro, determine o volume correto da solução estoque da sonda e do tampão para atingir a concentração final desejada.Um experimento típico utiliza antígeno ou IgG numa concentração de 0,5 miligramas por mililitro em solução salina tamponada com fosfato, na quantidade calculada de cada solução estoque do sonda para tubos pequenos com tampa cônica contendo a quantidade desejada de tampão PBS, misturando as soluções. Em seguida, pipete as soluções de sonda em uma placa de 96 poços com baixa ligação proteica, que será usada como placa fonte para o spotter. A seguir, configure os parâmetros de deposição para o arranjo impresso determinando o número de réplicas de cada condição por grade.A grade dispõe o número de grades replicadas e a localização desejada de aplicação no chip. Coloque o substrato e a placa de origem no aplicador e, em seguida, verifique os frascos de descarte e de suprimento. Inicie o processo de impressão.Após a aplicação, coloque o substrato em um ambiente de alta umidade durante a noite para permitir que o processo de imobilização e desativação prossiga após a incubação. Lave os substratos com agitação, colocando primeiro o chip em PBS com 0,1% de tween por três minutos, repetindo o procedimento três vezes. Em seguida, realize três incubações de três minutos em PBS e, depois, em água desionizada.Se for realizar uma medição a seco, seque completamente o chip com gás argônio. Desative os grupos NHS remanescentes na superfície do copolímero mergulhando os chips em uma solução de 50 milimolares de etanolamina com o pH ajustado para 7,4 durante 30 minutos sob agitação na placa agitadora. Enxágue completamente a etanolamina usando PBS e, em seguida, água desionizada antes do início do procedimento de incubação.Prepare uma solução na concentração apropriada da proteína-alvo em PBS para esta demonstração. Utilize 500 nanogramas por mililitro de anti-soroalbumina humana e inclua um volume equivalente de tampão sem a proteína-alvo para a incubação de controle negativo. O sistema de íris consiste em alguns elementos básicos, como uma fonte de iluminação, componentes ópticos para iluminar adequadamente o arranjo de sensores da sonda, uma câmera para registrar as intensidades da luz refletida e uma plataforma onde a amostra é colocada para as medições.Inicie com uma varredura de espelho de silício em um chip de silício limpo e descoberto para normalizar todos os dados subsequentemente coletados antes de realizar a varredura. Prepare o sistema de íris ajustando os parâmetros para o experimento. Isso inclui medir o histograma das intensidades de luz, registradas pela câmera, e definir o tempo de exposição para intensidades ideais.Após a varredura de normalização, carregue a matriz de sonda preparada no sistema iris e realize a configuração como anteriormente, ajustando o foco para imaginar corretamente a superfície do substrato. Certifique-se de que a platina da amostra está nivelada, inspecionando os histogramas registrados para as intensidades de luz refletida. Por fim, escolha um nome de arquivo para salvar os dados.Inicialize o software para escanear a matriz, o qual ilumina a superfície em diferentes comprimentos de onda várias vezes e faz a média das imagens coletadas. O ponto óptico inicial alto é determinado, permitindo uma análise adequada das alterações na massa na superfície após a incubação, seguindo ao escaneamento inicial, submerja o chip na solução de incubação preparada por uma hora em uma placa agitadora. O tempo de incubação pode variar consideravelmente dependendo do nível de vegetação, da concentração do alvo sendo detectado e das afinidades do par sonda-alvo.Após a incubação, repita o procedimento de lavagem conforme realizado anteriormente. Analise o mesmo arranjo de proteínas utilizando o sistema iris para obter imagens pós-incubação destinadas à comparação com as imagens pré-incubação. Esse processo pode ser repetido para diferentes etapas de incubação, se necessário.Por exemplo, em um formato de ensaio sanduíche no qual um anticorpo secundário está sendo usado, ajuste as imagens coletadas para cada varredura de íris utilizando software comercialmente disponível para produzir uma imagem do proby contendo a formação de espessura óptica. Uma análise qualitativa rápida da ligação pode ser realizada subtraindo-se as imagens pós e pré-incubação. A ligação aparecerá como uma mudança na intensidade nos pontos onde foram observadas alterações de massa.Para análise quantitativa, determine as densidades mássicas de cada ponto em comparação com o fundo, calculando a média das informações de espessura óptica para cada pixel dentro de um ponto e para uma região anular fora do ponto. Em seguida, faça uma comparação direta dessas duas áreas mostradas aqui. Como exemplo, esquema do substrato de silício em camadas com íris de dióxido de silício, contendo um arranjo representativo de anticorpos.Cada conjunto de anticorpos é depositado em replicata com especificidade para um epítopo diferente, visando uma proteína distinta. Dois vírus completos diferentes e uma proteína viral são representados como exemplos de alvos. Os anticorpos de controle negativo dependem do ensaio e podem ser inespecíficos e/ou específicos para o vírus.Aqui está um exemplo de resultados qualitativos para a ligação de anticorpos específicos da albumina sérica humana a uma matriz de pontos de HSA e pontos-controle de IgG de coelho, conforme visto aqui. Após o ajuste e a determinação da espessura óptica das imagens pré e pós-incubação, pode-se criar uma imagem de diferença para a matriz de ligação, permitindo uma avaliação rápida da ligação. Uma análise mais rigorosa revela que uma alteração média na altura óptica de 2,05 e 0,13 nanômetro foi observada para os pontos de HSA e IgG de coelho, respectivamente, com uma concentração de incubação de anti-HSA de 500 nanogramas por mililitro.Este gráfico de barras representa um exemplo dos dados quantitativos que as medições de íris podem fornecer. Neste exemplo, é apresentada a dependência da ligação da proteína de pelo em relação à concentração proteica e ao comprimento de todas as fitas duplas do ligamento. Este gráfico de barras mostra as medições absolutas de altura óptica para as alturas iniciais do prop do ligamento imobilizado e após incubação para ligação.Concentrações crescentes da proteína Fur de 5, 100 e 200 nanomolares resultaram em maior ligação aos sondas de DNA. Aqui, é mostrado o ligamento do dímero da proteína Fur por ligamento de DNA de dupla fita. O ligamento do dímero aumentou significativamente em uma concentração de 200 nanomolares da proteína Fur, sugerindo um alto nível de interações não específicas com todos os ligamentos ou um mecanismo diferente de ligação da proteína Fur, tal como a agregação de múltiplos dímeros.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de começar com substratos limpos e uniformes que tenham a espessura apropriada de óxido e manter as amostras limpas, manipulando-as cuidadosamente com pinças. Também é fundamental utilizar reagentes que tenham sido armazenados corretamente e cuja funcionalidade seja conhecida. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir ações biomoleculares em formato livre de marcadores por meio da preparação de matrizes de sondas funcionais em uma superfície de dióxido de silício, bem como da aquisição e análise de dados utilizando o sensor de imagem de reflexão interferométrica ou iris.

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Hibridização In Situ de Fluorescência Infravermelha Óptica Fototérmica (OPTIR-FISH)

Aprenda a detectar biomoléculas sem marcadores usando o sensor IRIS com imagem de interferometria de reflectância. Este método óptico permite quantificar proteínas e ácidos nucleicos em microarranjos de forma rápida e econômica.

Detecção de Biomolecular empregando o sensor de imagem Interferometric Reflectância (IRIS)

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