Detecção de Biomolecular empregando o sensor de imagem Interferometric Reflectância (IRIS)

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar a ligação de anticorpos a antígenos imobilizados na superfície por meio de uma plataforma sensorial sensível e livre de marcadores denominada Iris. Isso é alcançado primeiramente pela preparação de uma matriz de sondas de teste e controle sobre uma superfície uniforme de dióxido de silício quimicamente funcionalizada, para capturar proteínas-alvo a partir de solução. As sondas imobilizadas podem ser anticorpos ou antígenos, DNA ou RNA, ou qualquer outro tipo de macromolécula compatível com as químicas de superfície funcionalizadas, poliméricas ou sane.

A microplaca preparada é então incubada com uma amostra contendo as proteínas de interesse, o que permite a ligação ocorrer em condições especificadas pelo pesquisador. Em seguida, toda a matriz de sensores é imageada em diferentes comprimentos de onda da luz. Com o sistema IRIS, as intensidades refletidas de cada pixel são processadas com algoritmos codificados personalizados.

Para quantificar a quantidade de biomaterial ligado a cada condição de teste ou controle, são obtidos resultados pós-incubação que demonstram detecção eficaz e quantificação absoluta de anticorpos em uma mistura complexa, com base nas medições interferométricas sem marcação deste sistema. Com base em mais de uma década de pesquisa e desenvolvimento em dispositivos ópticos de interferência e cavidades de resina, desenvolvemos este novo método que pode superar muitos dos problemas confundidores encontrados em nossos sistemas anteriores de biossensores sem marcação. A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas de coleta de dados exigem que os procedimentos corretos de normalização e controle de qualidade sejam seguidos, a fim de garantir a aquisição precisa e repetível dos dados.

Para revestir conjuntamente seus substratos de dióxido de silício com copolímeros autoabsorvíveis de NAS DMMA em primeiro lugar, prepare a solução polimérica adicionando 100 miligramas do polímero a cinco mililitros de água desionizada. Em seguida, adicione cinco mililitros de sulfato de amônio a 40% saturado para obter uma concentração final de sulfato de amônio de 0,92 molar. Mergulhe os chips na solução polimérica por 30 minutos em um agitador após a incubação.

Lave minuciosamente os chips com água desionizada, seque-os com gás argônio ou nitrogênio e, em seguida, aqueça-os a 80 graus Celsius por 15 minutos. Armazene os chips de substrato revestidos com polímero em um ambiente seco, como um dessecador a vácuo, por até dois ou três meses até o procedimento de deposição das sondas para diluir cada sonda. Primeiro, determine o volume correto da solução estoque da sonda e do tampão para atingir a concentração final desejada.

Um experimento típico utiliza antígeno ou IgG numa concentração de 0,5 miligramas por mililitro em solução salina tamponada com fosfato, na quantidade calculada de cada solução estoque do sonda para tubos pequenos com tampa cônica contendo a quantidade desejada de tampão PBS, misturando as soluções. Em seguida, pipete as soluções de sonda em uma placa de 96 poços com baixa ligação proteica, que será usada como placa fonte para o spotter. A seguir, configure os parâmetros de deposição para o arranjo impresso determinando o número de réplicas de cada condição por grade.

A grade dispõe o número de grades replicadas e a localização desejada de aplicação no chip. Coloque o substrato e a placa de origem no aplicador e, em seguida, verifique os frascos de descarte e de suprimento. Inicie o processo de impressão.

Após a aplicação, coloque o substrato em um ambiente de alta umidade durante a noite para permitir que o processo de imobilização e desativação prossiga após a incubação. Lave os substratos com agitação, colocando primeiro o chip em PBS com 0,1% de tween por três minutos, repetindo o procedimento três vezes. Em seguida, realize três incubações de três minutos em PBS e, depois, em água desionizada.

Se for realizar uma medição a seco, seque completamente o chip com gás argônio. Desative os grupos NHS remanescentes na superfície do copolímero mergulhando os chips em uma solução de 50 milimolares de etanolamina com o pH ajustado para 7,4 durante 30 minutos sob agitação na placa agitadora. Enxágue completamente a etanolamina usando PBS e, em seguida, água desionizada antes do início do procedimento de incubação.

Prepare uma solução na concentração apropriada da proteína-alvo em PBS para esta demonstração. Utilize 500 nanogramas por mililitro de anti-soroalbumina humana e inclua um volume equivalente de tampão sem a proteína-alvo para a incubação de controle negativo. O sistema de íris consiste em alguns elementos básicos, como uma fonte de iluminação, componentes ópticos para iluminar adequadamente o arranjo de sensores da sonda, uma câmera para registrar as intensidades da luz refletida e uma plataforma onde a amostra é colocada para as medições.

Inicie com uma varredura de espelho de silício em um chip de silício limpo e descoberto para normalizar todos os dados subsequentemente coletados antes de realizar a varredura. Prepare o sistema de íris ajustando os parâmetros para o experimento. Isso inclui medir o histograma das intensidades de luz, registradas pela câmera, e definir o tempo de exposição para intensidades ideais.

Após a varredura de normalização, carregue a matriz de sonda preparada no sistema iris e realize a configuração como anteriormente, ajustando o foco para imaginar corretamente a superfície do substrato. Certifique-se de que a platina da amostra está nivelada, inspecionando os histogramas registrados para as intensidades de luz refletida. Por fim, escolha um nome de arquivo para salvar os dados.

Inicialize o software para escanear a matriz, o qual ilumina a superfície em diferentes comprimentos de onda várias vezes e faz a média das imagens coletadas. O ponto óptico inicial alto é determinado, permitindo uma análise adequada das alterações na massa na superfície após a incubação, seguindo ao escaneamento inicial, submerja o chip na solução de incubação preparada por uma hora em uma placa agitadora. O tempo de incubação pode variar consideravelmente dependendo do nível de vegetação, da concentração do alvo sendo detectado e das afinidades do par sonda-alvo.

Após a incubação, repita o procedimento de lavagem conforme realizado anteriormente. Analise o mesmo arranjo de proteínas utilizando o sistema iris para obter imagens pós-incubação destinadas à comparação com as imagens pré-incubação. Esse processo pode ser repetido para diferentes etapas de incubação, se necessário.

Por exemplo, em um formato de ensaio sanduíche no qual um anticorpo secundário está sendo usado, ajuste as imagens coletadas para cada varredura de íris utilizando software comercialmente disponível para produzir uma imagem do proby contendo a formação de espessura óptica. Uma análise qualitativa rápida da ligação pode ser realizada subtraindo-se as imagens pós e pré-incubação. A ligação aparecerá como uma mudança na intensidade nos pontos onde foram observadas alterações de massa.

Para análise quantitativa, determine as densidades mássicas de cada ponto em comparação com o fundo, calculando a média das informações de espessura óptica para cada pixel dentro de um ponto e para uma região anular fora do ponto. Em seguida, faça uma comparação direta dessas duas áreas mostradas aqui. Como exemplo, esquema do substrato de silício em camadas com íris de dióxido de silício, contendo um arranjo representativo de anticorpos.

Cada conjunto de anticorpos é depositado em replicata com especificidade para um epítopo diferente, visando uma proteína distinta. Dois vírus completos diferentes e uma proteína viral são representados como exemplos de alvos. Os anticorpos de controle negativo dependem do ensaio e podem ser inespecíficos e/ou específicos para o vírus.

Aqui está um exemplo de resultados qualitativos para a ligação de anticorpos específicos da albumina sérica humana a uma matriz de pontos de HSA e pontos-controle de IgG de coelho, conforme visto aqui. Após o ajuste e a determinação da espessura óptica das imagens pré e pós-incubação, pode-se criar uma imagem de diferença para a matriz de ligação, permitindo uma avaliação rápida da ligação. Uma análise mais rigorosa revela que uma alteração média na altura óptica de 2,05 e 0,13 nanômetro foi observada para os pontos de HSA e IgG de coelho, respectivamente, com uma concentração de incubação de anti-HSA de 500 nanogramas por mililitro.

Este gráfico de barras representa um exemplo dos dados quantitativos que as medições de íris podem fornecer. Neste exemplo, é apresentada a dependência da ligação da proteína de pelo em relação à concentração proteica e ao comprimento de todas as fitas duplas do ligamento. Este gráfico de barras mostra as medições absolutas de altura óptica para as alturas iniciais do prop do ligamento imobilizado e após incubação para ligação.

Concentrações crescentes da proteína Fur de 5, 100 e 200 nanomolares resultaram em maior ligação aos sondas de DNA. Aqui, é mostrado o ligamento do dímero da proteína Fur por ligamento de DNA de dupla fita. O ligamento do dímero aumentou significativamente em uma concentração de 200 nanomolares da proteína Fur, sugerindo um alto nível de interações não específicas com todos os ligamentos ou um mecanismo diferente de ligação da proteína Fur, tal como a agregação de múltiplos dímeros.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de começar com substratos limpos e uniformes que tenham a espessura apropriada de óxido e manter as amostras limpas, manipulando-as cuidadosamente com pinças. Também é fundamental utilizar reagentes que tenham sido armazenados corretamente e cuja funcionalidade seja conhecida. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir ações biomoleculares em formato livre de marcadores por meio da preparação de matrizes de sondas funcionais em uma superfície de dióxido de silício, bem como da aquisição e análise de dados utilizando o sensor de imagem de reflexão interferométrica ou iris.