Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical

O objetivo deste procedimento é determinar o potencial da membrana mitocondrial e os níveis de espécies reativas de oxigênio em neurônios corticais primários usando as sondas fluorescentes, TMRM e H 2D CFD, respectivamente. Isso é feito preparando primeiro as concentrações de estoque e trabalho do TMRM e H 2D CFDA. O segundo passo é incubar os neurônios corticais com TMRM e H 2D CFDA em temperatura ambiente por 45 minutos em tampão de estradas tailandesas.

O terceiro passo é obter imagens da intensidade de fluorescência de TMRM e DCF em neurônios corticais vivos usando emissão de excitação de 5 15 5 17 nanômetros e 4 88 5 15 nanômetros, respectivamente. As alterações no TMR na fluorescência serão monitoradas na presença do unco FCCP mitocondrial, enquanto as alterações na fluorescência do DCF serão monitoradas na presença de peróxido de hidrogênio. A etapa final desse procedimento é a coleta, normalização e análise de dados.

Em última análise, os resultados são obtidos traçando um gráfico que mostra os níveis relativos de intensidade de fluorescência TMRM e DCF antes e depois do tratamento com FCCP e peróxido de hidrogênio, respectivamente. Olá, sou Joanna Koska. Bem-vindo ao meu laboratório na Loyola University Chicago.

Hoje mostraremos como medir o potencial da membrana mitocondrial e as espécies reativas de oxigênio em neurônios corticais de ratos. O procedimento será demonstrado por dhi. Olá, sou de Denise Jossi.

Usando este procedimento, o potencial da membrana mitocondrial pode ser medido em um único marcador mitocondrial e as espécies reativas de oxigênio em um único rótulo celular. Então vamos começar. Preparar um stock de 10 milimolares de TMRM dissolvendo cinco miligramas de TMRM num mililitro de vórtice de óxido de dimetilsulfo anidro durante um minuto.

Em seguida, faça alíquotas armazenar as alíquotas a menos 20 graus Celsius. Proteger da luz e usar dentro de um mês. Em seguida, prepare um estoque de 10 milimolares de H 2D CFDA dissolvendo 4,87 miligramas de H 2D CFDA em um mililitro de óxido de dimetilsulf anidro.

Da mesma forma, faça um vórtice por um minuto, depois faça alíquotas e armazene-as a menos 20 graus Celsius. Proteja da luz e use dentro de uma semana para carregar os neurônios corticais de ratos com TMRM primeiro. Lave os neurônios cultivados três vezes com o tampão de tyro.

Em seguida, prepare 20 TMRM nano molar diluindo o estoque TMRM de 10 milimolares 1000 vezes em tb. Em seguida, adicione dois microlitros do TMRM diluído por um mililitro de tb. Incube os neurônios com TMRM por 45 minutos no escuro em temperatura ambiente.

Após 45 minutos, monte a placa de cultura no palco do microscópio e inicie a imagem para carregar os neurônios corticais de rato com H 2D CFDA, lave os neurônios cultivados três vezes com tb. Em seguida, prepare dois micromolares de H 2D CFDA diluindo o estoque de 10 milimolares H 2D CFDA 10 vezes em tb. Em seguida, adicione dois microlitros de H 2D CFDA diluído por um mililitro de tb.

Em seguida, incube os neurônios com H 2D CFDA por 45 minutos no escuro à temperatura ambiente após 45 minutos. Lave os neurônios quatro vezes com TB para remover o excesso de indicador fluorescente antes de obter imagens para realizar imagens ao vivo de neurônios incubados com microscopia de varredura a laser confocal TMRM com a aplicação de programa de séries temporais ao vivo é usado. Aplique baixa resolução e potência de laser atenuada para minimizar o tempo necessário para obter imagens e evitar o branqueamento de fotos.

Em seguida, ajuste o foco dos neurônios montados carregados com TMRM usando luz refletida. Examinar a fluorescência TMRM por iluminação a cinco 14 nanómetros e detecção a cinco a 70 nanómetros. Defina o ganho de detecção da câmera logo abaixo do nível de saturação, uma vez que todos os parâmetros, que incluem resolução, detecção de potência do laser, ganho da câmera e intervalo de lapso de tempo para obter imagens, estejam definidos.

Não altere essas configurações entre os experimentos. Em seguida, altere o campo. Comece a coletar imagens para testar alterações no estímulo delta PSY M, como um micromolar de FCCP ou dois microgramas por mililitro de oligomicina, o que irá despolarizar ou hiperpolarizar significativamente o potencial da membrana mitocondrial, respectivamente.

Essas alterações serão refletidas por uma diminuição na intensidade de fluorescência de TMRM em comparação com a intensidade de fluorescência de linha de base no caso de FCCP ou um aumento na intensidade de fluorescência de TMRM. No caso de um LIGA myin sin para realizar imagens ao vivo de neurônios incubados com H 2D CFDA primeiro montar a placa de cultura no palco de um microscópio, ajustar o foco das células usando luz refletida. Examinar a fluorescência DCF por excitação a 4 88 nanómetros e emissão a cinco a 15 nanómetros.

Em seguida, ajuste a potência do laser para cinco a 7% detecte um ganho e resolução de 2 56 por 2 56. Não altere essas configurações entre os experimentos. Em seguida, defina a frequência para obter imagens ao vivo.

Usando o programa de séries temporais, selecione um novo campo e comece a adquirir imagens para detectar alterações nos níveis de R os. Trate as células com 100 a 200 micromolares de peróxido de hidrogênio. Isso será refletido por um aumento na intensidade de fluorescência do DCF em comparação com o nível basal.

Use a ferramenta de região de interesse do programa LSM para selecionar as áreas. Em seguida, selecione ROIs de regiões mitocondriais ou ROIs de todo o corpo celular em células de imagem. Para medir as intensidades de fluorescência de TMRM ou ROS, respectivamente.

Selecione regiões ao lado das células. Para calcular a intensidade de fluorescência de fundo, faça várias medições e para calcular a intensidade média de fundo, subtraia a intensidade média de fluorescência de fundo das intensidades médias de fluorescência das regiões de interesse em cada célula para cada ponto de tempo usando o Microsoft Excel. Depois de subtrair a intensidade de fundo, normalize a intensidade de fluorescência TMRM ou DCF para a fluorescência da linha de base.

Usando esta fórmula, use o programa de plotagem Sigma para gerar o gráfico mostrando as mudanças na intensidade da fluorescência ao longo do tempo. Aqui está um exemplo de uma imagem de fluorescência de neurônios corticais de ratos incubados com TMRM. A adição de unco mitocondrial F-C-C-P-A leva à despolarização mitocondrial e à perda da intensidade de fluorescência do TMRM.

O nível de fluorescência TMRM basal permanece estável antes da adição de FCCP. A análise quantitativa das mudanças de fluorescência de TMRM ao longo do tempo mostra uma diminuição significativa na fluorescência de TMRM após a adição de FCCP. Aqui está um exemplo de uma imagem de fluorescência de neurônios corticais de ratos carregados com DCF.

O nível de fluorescência DCF basal permanece inalterado nos primeiros 120 segundos antes da aplicação de peróxido de hidrogênio. A adição de peróxido de hidrogênio resulta em um aumento na intensidade de fluorescência do DCF nos corpos celulares. As medições de lapso de tempo da fluorescência do DCF mostram seus níveis estáveis que aumentaram após os tratamentos com peróxido de hidrogênio.

Neste procedimento, é importante lembrar de usar uma baixa potência de laser e velocidade de varredura rápida para evitar os artefatos de fotobranqueamento e fototoxicidade. Tenha boa sorte com seu experimento.