Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical

O objetivo deste procedimento é determinar o potencial da membrana mitocondrial e os níveis de espécies reativas de oxigênio em neurônios corticais primários utilizando as sondas fluorescentes TMRM e H2DCFDA, respectivamente. Isso é realizado primeiramente preparando as concentrações estoque e de trabalho do TMRM e do H2DCFDA. O segundo passo é incubar os neurônios corticais com TMRM e H2DCFDA à temperatura ambiente por 45 minutos em tampão Thai roads.

O terceiro passo é obter imagens da intensidade de fluorescência de TMRM e DCF em neurônios corticais vivos utilizando excitação/emissão de 5 15 5 17 nanômetros e 4 88 5 15 nanômetros, respectivamente. As alterações na fluorescência de TMR serão monitoradas na presença do desacoplador mitocondrial FCCP, enquanto as alterações na fluorescência de DCF serão monitoradas na presença de peróxido de hidrogênio. O passo final deste procedimento é a coleta, normalização e análise dos dados.

No final das contas, os resultados são obtidos pela construção de um gráfico que mostra os níveis relativos de intensidade de fluorescência de TMRM e DCF antes e depois do tratamento com FCCP e peróxido de hidrogênio, respectivamente. Olá, sou Joanna Koska. Bem-vindos ao meu laboratório na Universidade Loyola de Chicago.

Hoje vamos mostrar como medir o potencial da membrana mitocondrial e as espécies reativas de oxigênio em neurônios corticais de rato. O procedimento será demonstrado por dhi. Olá, sou Denise Jossi.

Utilizando este procedimento, o potencial da membrana mitocondrial pode ser medido em nível de mitocôndria individual e as espécies reativas de oxigênio em nível de célula individual. Vamos começar. Prepare um estoque de 10 milimolar de TMRM dissolvendo cinco miligramas de TMRM em um mililitro de óxido de dimetilsulfóxido anidro, agitando em vórtex por um minuto.

Em seguida, faça alíquotas e armazene-as a menos 20 graus Celsius. Proteja da luz e utilize dentro de um mês. A seguir, prepare um estoque de 10 milimolar de H 2D CFDA dissolvendo 4,87 miligramas de H 2D CFDA em um mililitro de óxido de dimetilsulfóxido anidro.

Da mesma forma, agite em vórtex por um minuto, em seguida, faça alíquotas e armazene-as a menos 20 graus Celsius. Proteja da luz e utilize dentro de uma semana para carregar primeiro os neurônios corticais de rato com TMRM. Lave os neurônios cultivados três vezes com tampão Tyro's.

Em seguida, prepare TMRM a 20 nanomolar diluindo o estoque de TMRM a 10 milimolar 1000 vezes em tb. Em seguida, adicione dois microlitros do TMRM diluído por um mililitro de tb. Incube os neurônios com TMRM por 45 minutos no escuro e à temperatura ambiente.

Após 45 minutos, coloque a placa de cultura sobre a platina do microscópio e inicie a aquisição de imagens para carregar os neurônios corticais de rato com H 2D CFDA, lave os neurônios cultivados três vezes com tb. Em seguida, prepare dois micromolares de H 2D CFDA diluindo o estoque de H 2D CFDA de 10 milimolares 10 vezes em tb. E então adicione dois microlitros de H 2D CFDA diluído por um mililitro de tb.

Em seguida, incubar os neurônios com H2DCFDA por 45 minutos no escuro, à temperatura ambiente, após 45 minutos. Lavar os neurônios quatro vezes com TB para remover o indicador fluorescente em excesso antes de obter imagens para realizar a imagem em tempo real de neurônios incubados com TMRM, utilizando microscopia confocal a laser com aplicação do programa de séries temporais em tempo real. Aplicar baixa resolução e potência atenuada do laser para minimizar o tempo necessário para obtenção das imagens e evitar o desbotamento fotônico.

Em seguida, ajuste o foco dos neurônios montados carregados com TMRM utilizando luz refletida. Examine a fluorescência do TMRM por meio de iluminação em cinco 14 nanômetros e detecção em cinco 70 nanômetros. Configure o ganho de detecção da câmera logo abaixo do nível de saturação, uma vez que todos os parâmetros, incluindo resolução, potência do laser, ganho da câmera e intervalo de captura de imagens no tempo, estiverem definidos.

Não altere essas configurações entre experimentos. Em seguida, modifique o campo. Comece a coletar imagens para testar alterações no estímulo delta PSY M, como a aplicação de um micromolar de FCCP ou dois microgramas por mililitro de oligomicina, o que irá significativamente despolirar ou hiperpolarizar o potencial da membrana mitocondrial, respectivamente.

Essas alterações serão refletidas por uma diminuição na intensidade da fluorescência de TMRM em comparação com a intensidade de fluorescência basal no caso do FCCP, ou por um aumento na intensidade da fluorescência de TMRM. No caso de um LIGA myin sin para realizar imagem em tempo real de neurônios incubados com H 2D CFDA, monte primeiro o recipiente de cultura sobre a platina de um microscópio e ajuste o foco das células utilizando luz refletida. Examine a fluorescência de DCF com excitação em 4 88 nanômetros e emissão em cinco 15 nanômetros.

Em seguida, ajuste a potência do laser para entre 5% e 7% para detectar um ganho e uma resolução de 256 por 256. Não altere essas configurações entre os experimentos. Em seguida, defina a frequência para obtenção de imagens em tempo real.

Utilizando o programa de séries temporais, selecione um novo campo e inicie a aquisição de imagens para detectar alterações nos níveis de ESP. Trate as células com 100 a 200 micromolares de peróxido de hidrogênio. Isso será refletido por um aumento na intensidade da fluorescência de DCF em comparação com o nível basal.

Utilize a ferramenta de região de interesse do programa LSM para selecionar as áreas. Em seguida, selecione as ROI de regiões mitocondriais ou as ROI de todo o corpo celular nas células da imagem para medir as intensidades de fluorescência de TMRM ou de ESP, respectivamente.

Selecione regiões adjacentes às células. Para calcular a intensidade de fluorescência de fundo, realize várias medições e, para calcular a intensidade média de fundo, subtraia a intensidade média de fluorescência de fundo das intensidades médias de fluorescência das regiões de interesse em cada célula para cada ponto temporal utilizando o Microsoft Excel. Após subtrair a intensidade de fundo, normalize a intensidade de fluorescência de TMRM ou DCF à fluorescência basal.

Usando esta fórmula, utilize então o programa Sigma Plot para gerar o gráfico que mostra as alterações na intensidade de fluorescência ao longo do tempo. A seguir, tem-se um exemplo de uma imagem de fluorescência de neurônios corticais de rato incubados com TMRM. A adição do desacoplador mitocondrial F-C-C-P-A leva à despolarização mitocondrial e à perda da intensidade de fluorescência do TMRM.

O nível basal de fluorescência de TMRM permanece estável antes da adição de FCCP. A análise quantitativa das alterações na fluorescência de TMRM ao longo do tempo mostra uma diminuição significativa na fluorescência de TMRM após a adição de FCCP. Abaixo, tem-se um exemplo de imagem de fluorescência de neurônios corticais de rato carregados com DCF.

O nível basal de fluorescência de DCF permanece inalterado nos primeiros 120 segundos antes da aplicação de peróxido de hidrogênio. A adição de peróxido de hidrogênio resulta em um aumento na intensidade da fluorescência de DCF nos corpos celulares. Medições com lapso de tempo da fluorescência de DCF mostram níveis estáveis que aumentaram após os tratamentos com peróxido de hidrogênio.

Neste procedimento, é importante lembrar de usar uma potência baixa do laser e uma velocidade de varredura rápida para evitar artefatos causados pelo desbotamento fotográfico e fototoxicidade. Boa sorte com o seu experimento.