Name: Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprenda a determinar o potencial de membrana mitocondrial e espécies reativas de oxigênio em neurônios corticais de rato usando sondas fluorescentes TMRM e H2DCFDA. Este método permite monitorar dinâmicas celulares em tempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (K22NS050137 a JCB).

1. Cultura de células <ol><li> Neurônios corticais estão isolados e cultivados com técnicas previamente descritas e semeadas em placas de cultura com um fundo de vidro (Mattek Corporation, Ashland, MA) revestidas com poli-D-lisina e laminina 1. </li></ol> 2. Preparação das soluções estoque para o fluorescente sondas TMRM e 2 H DCF-DA <ol><li> Prepare uma solução estoque de 10 mM de TMRM pela dissolução de 5,0 mg de TMRM em 1 ml de dimetilsulfóxido anidro. Vortex por 1 min. Então, faça alíquotas e armazená-los a -20 ° C, proteger da luz, e usar dentro de um mês. </li><li> Em seguida, preparar uma solução estoque de 10 mM de H 2 DCF-DA dissolvendo 4,87 mg de H 2 DCF-DA em 1 ml de DMSO anidro. Da mesma forma vortex, por 1 min. Então, faça alíquotas e armazená-los a -20 ° C, proteger da luz, e usar dentro de uma semana. </li></ol> 3. Carregando neurônios de rato cortical com TMRM e 2 H DCF-DA TMRM é um potenciométrica, indicador de célula-permeável fluorescentes que se acumula no interior altamente carregadas negativamente das mitocôndrias. É importante usar a baixas concentrações (10-50 nm) de TMRM para evitar a auto-extinção da TMRM mitocondrial. Então, o sinal de fluorescência de TMRM pode ser diretamente co-relacionados com a ΔΨm através da membrana mitocondrial interna. A perda de ΔΨm causas TMRM a fuga de mitocôndrias, resultando em uma perda de intensidade de fluorescência. H 2 DCF-DA é a célula-permeável sonda convertido em DCF-DA por esterases intracelulares, e os resultados a sua oxidação no DCF fluorescente. A concentração final de H 2 DCF-DA varia entre 2-10 mM e deve ser testado empiricamente em neurônios derivados de diferentes regiões do cérebro vez que a concentração de carga elevada pode resultar na saturação de fluorescência DCF, mesmo na ausência de H 2 O 2. A presença de qualquer oxidante endógeno ou exógeno (por exemplo, óxido nítrico, peróxido de hidrogênio) aumentará DFC intensidade de fluorescência. Abaixo, fornecemos um protocolo para o carregamento com neurônios de rato cortical TMRM e 2 H DCF-DA. <ol><li> Para carregar os neurônios de rato cortical com TMRM, primeiro, lave os neurônios cultivados 3 vezes com tampão Tyrode do (Overlay Texto: TB: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de glucose, 1,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, e 10 HEPES mM; ajustar o pH para 7,4 com NaOH). Então, prepare 20 nM de TMRM diluindo a 10 mM de ações TMRM 1 / 1000 vezes em TB e depois adicionar 2 l da TMRM diluído por 1 ml de TB. Incubar os neurônios com TMRM por 45 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após 45 min, monte o prato de cultura no palco do microscópio e começar de imagem. </li><li> Para carregar os neurônios de rato cortical com H 2 DCF-DA, lave os neurônios cultivados 3 vezes com TB. Em seguida, prepare 2 mM de H 2 DCF-DA diluindo a 10 mM H 2 DCF-DA estoque 10/01 vezes em TB e depois adicionar 2 l da diluição H 2 DCF-DA por 1 ml de TB. Então, incubar os neurônios com H 2 DCF-DA por 45 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após 45 min, lave os neurônios 4 vezes com TB para remover indicador fluorescente excesso antes de obter imagens. </li></ol> 4. Ao vivo imagens de neurônios incubadas com TMRM para determinar ΔΨm <ol><li> Para realizar imagens ao vivo de neurônios incubadas com TMRM, microscopia confocal de varredura a laser (Overlay Texto: LSM 510, Carl Zeiss Inc.), com a aplicação do programa de séries temporais ao vivo, é usado. Aplicar de baixa resolução e atenuada a laser de potência (Overlay Texto: baixa resolução: 256 x 256; potência do laser: 1%) para minimizar o tempo necessário para obter imagens e evitar fotodegradação. </li><li> . Em seguida, ajustar o foco dos neurônios montado carregado com TMRM usando luz refletida. Examine a fluorescência TMRM pela iluminação a 514 nm e detecção a 570 nm. Definir o ganho de detecção de uma câmera, logo abaixo do nível de saturação. </li><li> Uma vez que todos os parâmetros que incluem resolução, potência do laser, o ganho de detecção de uma câmera, e lapso de tempo de intervalo para obter imagens são definidas, não alterar essas configurações entre experimentos. Em seguida, altere o campo. Começar a recolher imagens. </li><li> Para testar as alterações no ΔΨm, estímulos como uma mM de FCCP ou 2 mg / ml de oligomicina, pode ser aplicado, de forma significativa ou despolarizar hiperpolarizar o potencial de membrana mitocondrial, respectivamente. Estas alterações serão refletidas por uma diminuição na intensidade de fluorescência TMRM comparada com a intensidade de fluorescência de base, no caso de FCCP, ou um aumento na intensidade de fluorescência TMRM no caso de oligomicina. </li></ol> 5. Imagens ao vivo de neurônios incubadas com H 2 DCF-DA para determinar ROS <ol><li> Para realizar imagens ao vivo de neurônios incubadas com H 2 DCF-DA, primeiro, montar a placa de cultura no palco de um microscópio. Ajustar o foco das células-nosing luz refletida. Examine DCF fluorescência por excitação a 488 nm e emissão a 515 nm. </li><li> Em seguida, ajuste a potência do laser para 5-7%, o ganho do detector, e resolução de 256 x 256. Não altere estas configurações entre experimentos. Em seguida, defina a freqüência para a obtenção de imagens ao vivo usando o programa de séries temporais. </li><li> Selecione um campo novo e começar a adquirir as imagens. Para detectar mudanças nos níveis de ROS, tratar células com 100-200 mM de H 2 O 2. Isso será refletido por um aumento na intensidade de fluorescência DCF em comparação com o nível basal. </li></ol> 6. Análise de dados <ol><li> Use região de interesse (Overlay Texto: ROI) ferramenta do programa de LSM para selecionar as áreas. Então, medir o TMRM ou ROS intensidades de fluorescência. Selecione ROIs de regiões mitocondriais ou ROIs do corpo celular em células de toda fotografada para medir a intensidade de fluorescência de TMRM ou ROS, respectivamente. </li><li> Calcular a intensidade média de fluorescência de todos os ROIs de cada célula para TMRM ou de corpos de células inteiras para todas as células com imagens de ROS para cada ponto de tempo. Selecione regiões próximas às células para calcular a intensidade de fluorescência de fundo. Tomar várias medidas e calcular a intensidade média de fundo. </li><li> Subtrair a intensidade de fluorescência média de fundo de média intensidades de fluorescência das ROIs em cada célula para cada ponto de tempo usando o Microsoft Excel. Depois de subtrair a intensidade de fundo, normalizar a intensidade TMRM ou DCF fluorescência para a fluorescência de base usando esta fórmula (Overlay Texto: ΔF = FF o / F o x 100, onde F = intensidade de fluorescência em qualquer ponto do tempo, Para = linha de base de fluorescência). Então, use o programa Sigma Plot para gerar o gráfico mostrando as mudanças na intensidade de fluorescência ao longo do tempo. </li></ol> 7. Resultados representante Figura 1A mostra uma imagem de fluorescência de neurônios corticais de rato incubadas com TMRM. Adição de FCCP, um desacoplador mitocondrial, leva a despolarização mitocondrial e uma perda de TMRM intensidade de fluorescência (Figura 1B). A linha de base nível de fluorescência TMRM permanece estável antes da adição de FCCP (o primeiro 350 seg;. Fig 1C). Análise quantitativa de fluorescência TMRM mudanças ao longo do tempo mostra uma diminuição significativa na fluorescência TMRM após a adição de FCCP (Fig. 1C). Figura 1D mostra a imagem de fluorescência de neurônios corticais de rato carregado com DCF. Adição de H 2 O 2 resulta em aumento da intensidade de fluorescência DCF nos corpos celulares (Fig. 1E). A linha de base DCF nível de fluorescência mantém-se inalterado (os primeiros 120 segundos) antes da aplicação de H 2 O 2. Lapso de tempo de medições de fluorescência DCF mostram seus níveis estáveis, o que aumenta depois de H 2 O 2 de tratamento (Fig. 1F). <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Avaliação do potencial de membrana mitocondrial e os níveis de ROS em neurônios corticais rato vivo. (A) Representante imagem de fluorescência de neurônios corticais carregado com TMRM. Após a digitalização da linha de base TMRM de fluorescência, os neurônios foram tratados com o FCCP protonophore (1 mM). Para a direita é um bar pseudo intensidade de fluorescência TMRM com o máximo de amarelo e preto brilhante representação e intensidade mínima, respectivamente. A perda de fluorescência TMRM das regiões mitocondrial indica o colapso do ΔΨm sobre FCCP tratamento (painel B). A representação quantitativa da mudança na intensidade de fluorescência TMRM em momentos diferentes, antes e após o tratamento FCCP é mostrado no painel C. (D) a imagem de fluorescência de neurônios corticais de rato carregado com H2DCF-DA. Após a determinação da linha de base DCF fluorescência, as células foram tratadas com 200 mM H 2 O 2, ea mudança no DCF fluorescência foi avaliada. Um aumento na fluorescência do DCF reflete o aumento nos níveis de ROS em H 2 O 2 tratamento (E). Análise quantitativa das mudanças no DCF fluorescência, antes e depois do H 2 O 2 tratamento, é mostrado no painel da barra de escala F. = 10 mM Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi Ao vivo imagens de células de TMRM em neurônios corticais antes e depois disso FCCP utilizando objetiva de 40X. A intensidade mostra um pseudo (amarelo brilhante, antes da adição FCCP) e diminuição máxima (cor vermelha, após a adição FCCP) TMRM intensidade de fluorescência após a adição FCCP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">Clique aqui para ver o vídeo</a> Vídeo. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi Ao vivo imagens de células de DCF nos neurônios corticais antes e depois do H 2 O 2 disso utilizando objetiva de 40X. A linha de base DCF fluorescência tem cor verde-claro nos corpos celulares e H2O2 disso aumenta o DCF intensidade de fluorescência de cor verde brilhante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">Clique aqui para ver o vídeo</a>

<ol><li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+%28AICD%29+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li>
<li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%3A+implication+for+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós apresentamos um procedimento passo-a-passo descreve como determinar ΔΨm e ROS em neurônios corticais de rato usando o fluorescente indicadores TMRM e H 2 DCF-DA, respectivamente. Para outros tipos de células, é importante determinar empiricamente a concentração final e tempo de carregamento para TMRM ou 2 H DCF-DA. Em geral, as concentrações de gama TMRM 2-20 nM, eo tempo de incubação das células com TMRM varia de 20 a 60 min. A concentração final de H 2 DCF-DA faixas de 2-10 mM, e incubação de células em uma solução de carga contendo este indicador varia de 30-45 min. É importante para otimizar a potência do laser e velocidade de digitalização de levar as imagens para evitar a foto-toxicidade para as células e as mudanças na intensidade de fluorescência (por exemplo cintilação de TMRM fluorescência), na ausência de qualquer estímulo. As configurações otimizadas óptico deve resultar em um sinal de fluorescência que não está acima ou abaixo saturadas (threshold) na ausência de estímulo. As condições ideais para coletar as imagens de um campo selecionado em uma potência do laser em particular e uma velocidade de digitalização são obtidas quando não há mudanças na intensidade de fluorescência da sonda na ausência de qualquer estímulo por 10-15 min de imagens ao vivo. Outras sondas de fluorescência para determinar ΔΨm incluem rodamina 123 e tetra metil etil éster rodamina (TMRE). No entanto, eles foram encontrados para inibir os processos respiratórios em dois mitocôndrias isoladas. Importante, TMRM não tem nenhum efeito sobre a respiração mitocondrial em baixas concentrações 2 e tem fototoxicidade baixa e fotobranqueamento 3, em comparação com outras sondas. H 2 DCF-DA é um bom indicador para ROS como é bem retida nas células e reconhece as espécies oxidantes diversos, tais como peróxidos, óxidos de super, e óxido nítrico 4.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> De vidro prato de cultura de fundo </td><td> Mattek Corporação </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF-DA </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> • CaCl 2 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> MgCl 2 • 6H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D-Glicose </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr></tbody></table>

determinação de membrana mitocondrial espécies de oxigênio reativas potencial e em neurônios de rato vivo cortical

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) é fundamental para manter a função fisiológica da cadeia respiratória para gerar ATP. A perda significativa de células ΔΨm torna esgotado de energia, com posterior morte. Espécies reativas de oxigênio (ROS) são importantes moléculas sinalizadoras, mas a sua acumulação em condições patológicas leva ao estresse oxidativo. As duas principais fontes de ROS nas células são toxinas ambientais e do processo de fosforilação oxidativa. Disfunção mitocondrial eo estresse oxidativo têm sido implicados na fisiopatologia de muitas doenças e, portanto, a capacidade de determinar ΔΨm e ROS pode fornecer pistas importantes sobre o estado fisiológico da célula ea função das mitocôndrias. Várias sondas fluorescentes (Rodamina 123, TMRM, TMRE, JC-1) pode ser usado para determinar Δψm em uma variedade de tipos celulares, e muitos indicadores de fluorescência (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) pode ser usado para determinar ROS . Quase todas as sondas de fluorescência disponíveis utilizados para avaliar ΔΨm ou ROS são um único comprimento de onda de indicadores, que aumentar ou diminuir sua intensidade de fluorescência proporcional a um estímulo que aumenta ou diminui os níveis de ΔΨm ou ROS. Assim, é imperativo para medir a intensidade de fluorescência destas sondas ao nível basal e após a aplicação de um estímulo específico. Isto permite uma para determinar a porcentagem de mudança na intensidade de fluorescência entre o nível de referência e um estímulo. Esta mudança na intensidade da fluorescência reflete a mudança nos níveis relativos de ΔΨm ou ROS. Neste vídeo, demonstramos como aplicar o indicador de fluorescência, TMRM, em neurônios corticais de ratos para determinar a variação percentual na intensidade de fluorescência TMRM entre o nível de base e após a aplicação de FCCP, um desacoplador mitocondrial. Os níveis mais baixos de TMRM fluorescência resultante do tratamento FCCP refletem a despolarização do potencial de membrana mitocondrial. Também mostramos como aplicar a fluorescência da sonda H 2-DA DCF para avaliar o nível de ROS em neurônios corticais, primeiro na linha de base e, em seguida, após a aplicação de H 2 O 2. Este protocolo (com pequenas modificações) também podem ser usados ​​para determinar mudanças no ΔΨm e ROS em diferentes tipos celulares e em neurônios isolados de outras regiões do cérebro.

Nós demonstramos a aplicação do indicador de fluorescência, TMRM, em neurônios corticais para determinar a alterações relativas na intensidade de fluorescência TMRM antes e após a aplicação de um estímulo específico. Mostramos também a aplicação da sonda de fluorescência H<sub&gt; 2</sub&gt; DCF-DA para avaliar o nível relativo de espécies reativas de oxigênio nos neurônios corticais.

Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical

O potencial de membrana mitocondrial (&Delta;&Psi;m) é fundamental para a manutenção da função fisiológica da cadeia respiratória para a geração de ATP. Um...

O objetivo deste procedimento é determinar o potencial da membrana mitocondrial e os níveis de espécies reativas de oxigênio em neurônios corticais primários utilizando as sondas fluorescentes TMRM e H2DCFDA, respectivamente. Isso é realizado primeiramente preparando as concentrações estoque e de trabalho do TMRM e do H2DCFDA. O segundo passo é incubação dos neurônios corticais com TMRM e H2DCFDA à temperatura ambiente por 45 minutos em tampão Thai roads.O terceiro passo é obter imagens da intensidade de fluorescência de TMRM e DCF em neurônios corticais vivos utilizando excitação/emissão de 5 15 5 17 nanômetros e 4 88 5 15 nanômetros, respectivamente. As alterações na fluorescência de TMR serão monitoradas na presença do desacoplador mitocondrial FCCP, enquanto as alterações na fluorescência de DCF serão monitoradas na presença de peróxido de hidrogênio. O passo final deste procedimento é a coleta, normalização e análise dos dados.No final das contas, os resultados são obtidos pela construção de um gráfico que mostra os níveis relativos de intensidade de fluorescência de TMRM e DCF antes e depois do tratamento com FCCP e peróxido de hidrogênio, respectivamente. Olá, sou Joanna Koska. Bem-vindos ao meu laboratório na Universidade Loyola de Chicago.Hoje vamos mostrar como medir o potencial da membrana mitocondrial e as espécies reativas de oxigênio em neurônios corticais de rato. O procedimento será demonstrado por dhi. Olá, sou Denise Jossi.Utilizando este procedimento, o potencial da membrana mitocondrial pode ser medido em nível de mitocôndria individual e as espécies reativas de oxigênio em nível de célula individual. Vamos começar. Prepare um estoque de 10 milimolar de TMRM dissolvendo cinco miligramas de TMRM em um mililitro de óxido de dimetilsulfóxido anidro, agitando em vórtex por um minuto.Em seguida, faça alíquotas e armazene as alíquotas a menos 20 graus Celsius. Proteja da luz e utilize dentro de um mês. A seguir, prepare um estoque de 10 milimolar de H 2D CFDA dissolvendo 4,87 miligramas de H 2D CFDA em um mililitro de dimetil sulfóxido anidro.Da mesma forma, vortexie por um minuto, em seguida, faça alíquotas e armazene-as a menos 20 graus Celsius. Proteja da luz e utilize dentro de uma semana para carregar primeiro os neurônios corticais de rato com TMRM. Lave os neurônios cultivados três vezes com tampão Tyro's.Em seguida, prepare TMRM a 20 nanomolar diluindo o estoque de TMRM a 10 milimolar 1000 vezes em tb. Em seguida, adicione dois microlitros do TMRM diluído por um mililitro de tb. Incube os neurônios com TMRM por 45 minutos no escuro e à temperatura ambiente.Após 45 minutos, coloque a placa de cultura sobre a platina do microscópio e inicie a aquisição de imagens para carregar os neurônios corticais de rato com H 2D CFDA, lave os neurônios cultivados três vezes com tb. Em seguida, prepare dois micromolares de H 2D CFDA diluindo o estoque de H 2D CFDA de 10 milimolares 10 vezes em tb. E então adicione dois microlitros de H 2D CFDA diluído por um mililitro de tb.Em seguida, incubar os neurônios com H 2D CFDA por 45 minutos no escuro e à temperatura ambiente após 45 minutos. Lavar os neurônios quatro vezes com TB para remover o indicador fluorescente em excesso antes de obter imagens para realizar a imagem em tempo real de neurônios incubados com TMRM por microscopia confocal a laser com varredura, utilizando o programa de série temporal em tempo real. Aplicar baixa resolução e potência de laser atenuada para minimizar o tempo necessário para obter imagens e evitar o desbotamento fotônico.Em seguida, ajuste o foco dos neurônios montados carregados com TMRM utilizando luz refletida. Examine a fluorescência do TMRM por meio de iluminação em cinco 14 nanômetros e detecção em cinco 70 nanômetros. Configure o ganho de detecção da câmera logo abaixo do nível de saturação, uma vez definidos todos os parâmetros, que incluem resolução, potência do laser, ganho da câmera e intervalo de captura de imagens no modo time-lapse.Não altere essas configurações entre os experimentos. Em seguida, modifique o campo. Comece a coletar imagens para testar alterações no estímulo delta PSY M, como a aplicação de um micromolar de FCCP ou dois microgramas por mililitro de oligomicina, o que irá significativamente despolarizar ou hiperpolarizar o potencial da membrana mitocondrial, respectivamente.Essas alterações serão refletidas por uma diminuição na intensidade da fluorescência de TMRM em comparação com a intensidade de fluorescência basal no caso do FCCP ou por um aumento na intensidade da fluorescência de TMRM. No caso de um LIGA myin sin para realizar imagem em tempo real de neurônios incubados com H 2D CFDA, monte primeiro o prato de cultura sobre a platina de um microscópio e ajuste o foco das células utilizando luz refletida. Examine a fluorescência de DCF com excitação em 4 88 nanômetros e emissão em cinco 15 nanômetros.Em seguida, ajuste a potência do laser para entre 5% e 7% para detectar um ganho e uma resolução de 256 por 256. Não altere essas configurações entre os experimentos. Em seguida, defina a frequência para obtenção de imagens em tempo real.Utilizando o programa de séries temporais, selecione um novo campo e inicie a aquisição de imagens para detectar alterações nos níveis de espécies reativas de oxigênio. Trate as células com 100 a 200 micromolar de peróxido de hidrogênio. Isso será refletido por um aumento na intensidade da fluorescência do DCF em comparação com o nível basal.Utilize a ferramenta de região de interesse do programa LSM para selecionar as áreas. Em seguida, selecione as ROI de regiões mitocondriais ou as ROI de todo o corpo celular nas células da imagem para medir as intensidades de fluorescência de TMRM ou de ESP, respectivamente.Selecione regiões adjacentes às células. Para calcular a intensidade de fluorescência de fundo, realize várias medições e, para calcular a intensidade média de fundo, subtraia a intensidade média de fluorescência de fundo das intensidades médias de fluorescência das regiões de interesse em cada célula para cada ponto temporal utilizando o Microsoft Excel. Após subtrair a intensidade de fundo, normalize a intensidade de fluorescência de TMRM ou DCF à fluorescência basal.Usando esta fórmula, utilize então o programa SigmaPlot para gerar o gráfico mostrando as alterações na intensidade de fluorescência ao longo do tempo. A seguir, tem-se um exemplo de uma imagem de fluorescência de neurônios corticais de rato incubados com TMRM. A adição do desacoplador mitocondrial F-C-C-P-A leva à despolarização mitocondrial e à perda da intensidade de fluorescência do TMRM.O nível basal de fluorescência de TMRM permanece estável antes da adição de FCCP. A análise quantitativa das alterações na fluorescência de TMRM ao longo do tempo mostra uma diminuição significativa na fluorescência de TMRM após a adição de FCCP. Abaixo há um exemplo de imagem de fluorescência de neurônios corticais de rato carregados com DCF.O nível basal de fluorescência de DCF permanece inalterado nos primeiros 120 segundos antes da aplicação de peróxido de hidrogênio. A adição de peróxido de hidrogênio resulta em um aumento na intensidade da fluorescência de DCF nos corpos celulares. Medições com lapso de tempo da fluorescência de DCF mostram níveis estáveis que aumentaram após os tratamentos com peróxido de hidrogênio.Neste procedimento, é importante lembrar de usar baixa potência do laser e velocidade de varredura rápida para evitar artefatos causados pelo desbotamento fotográfico e fototoxicidade. Boa sorte com o seu experimento.

determination-mitochondrial-membrane-potential-reactive-oxygen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Katsalifis, A., et al. Imagem ao vivo do estado redox de glutationa mitocondrial em neurônios primários usando um indicador raciométrico. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a imagem do estado redox mitocondrial em neurônios primários usando um indicador fluorescente raciométrico. Ao aplicar dois comprimentos de onda de excitação sob um microscópio de fluorescência, a taxa de intensidade de fluorescência é medida para avaliar a oxidação mitocondrial. O protocolo inclui estimulação de...

Imagem do estado redox mitocondrial em neurônios primários usando um indicador raciométrico

A comparação do potencial da membrana mitocondrial entre as amostras produz informações valiosas sobre o status celular. São descritas etapas detalhadas para isolar mitocôndrias e avaliar a resposta a inibidores e desacopladores usando fluorescência. O método e a utilidade deste protocolo são ilustrados pelo uso de uma cultura de células e modelo animal de estresse celular.

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Este artigo descreve o método de imagem mitocondrial time-lapse de culturas de astrócito equipadas com biosensor MitoTimer e a análise multiparamétrica resultante da dinâmica mitocondrial, mobilidade, morfologia, biogênese, estado redox e rotatividade.

Imagem ao vivo do Sistema Mitocondrial em Astrócitos Cultivados

Este artigo descreve um protocolo para determinar diferenças no estado basal redox e respostas redox a perturbações agudas em neurônios hipocampais primários e corticais usando microscopia viva confocal. O protocolo pode ser aplicado a outros tipos de células e microscópios com modificações mínimas.

Imagem ao vivo do Estado De Glutathione Mitocondrial Redox em Neurônios Primários usando um Indicador Ratiométrico

Este estudo relata uma nova abordagem para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais com base na citometria de fluxo e dupla coloração com dois repórteres fluorescentes ou anticorpos para detectar alterações no volume mitocondrial, potencial de membrana mitocondrial, nível de espécies reativas de oxigênio, composição da cadeia respiratória mitocondrial e DNA mitocondrial.

Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais

A respirometria de alta resolução acoplada aos sensores de fluorescência determina o consumo mitocondrial de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar as taxas respiratórias mitocondriais e a produção de ROS no nervo ciático permeabilizado.

Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

A rede mitocondrial é extremamente complexa, tornando-a muito difícil de analisar. Uma nova ferramenta MATLAB analisa mitocôndrias confocais ao vivo em imagens de timelapse, mas resulta em um grande volume de saída que requer atenção manual individual. Para resolver esse problema, uma otimização de rotina foi desenvolvida, permitindo uma análise rápida dos arquivos.

Análise Automatizada Otimizada da Modulação da Homeostase das Mitocôndrias Neuronais Vivas por Receptores de Ácido Retinóico Isoform-Específicos

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho para a propagação, diferenciação e coloração de células SH-SY5Y cultivadas e neurônios primários do hipocampo de ratos para visualização e análise da ultraestrutura mitocondrial usando microscopia de depleção de emissão estimulada (STED).

Usando imagens STED de células vivas para visualizar a ultraestrutura da membrana interna mitocondrial em modelos de células neuronais

Neste estudo, descrevemos um protocolo passo a passo e enfatizamos os principais detalhes para determinar as características morfológicas das mitocôndrias em células vivas, incluindo preparação de amostras, aquisição de imagens e análise de dados. Este método é comumente usado para examinar a morfologia mitocondrial para estudar várias condições.

Determinação da morfologia mitocondrial em células vivas usando microscopia confocal

Apresentamos um método não invasivo e em tempo real para monitorar a saúde mitocondrial usando Espectroscopia Raman por Ressonância (RRS). Usamos RRS para quantificar os estados redox mitocondriais e desenvolvemos uma métrica para a saúde mitocondrial, a razão mitocondrial reduzida de Ressonância Raman (3RMR), que mostra uma resposta mais rápida às mudanças na oxigenação do que os analitos tradicionais de gases sanguíneos.

Avaliação em tempo real e não invasiva da função mitocondrial usando espectroscopia Raman por ressonância

Aprenda a determinar o potencial de membrana mitocondrial e espécies reativas de oxigênio em neurônios corticais de rato usando sondas fluorescentes TMRM e H2DCFDA. Este método permite monitorar dinâmicas celulares em tempo real.

Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical

Explorar mais vídeos